一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

作为一种妊娠周期较短的生物，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的胚胎是研究发育过程中蛋白质及其调控因子分布与定位的理想研究对象。然而，由于其胚胎富含脂质且卵壳富含几丁质，导致胚胎难以牢固地贴附在玻璃表面，限制了其应用。在本研究中，我们介绍了一种实用方法，可显著增强黑腹果蝇胚胎在载玻片上的附着效果，并详细阐述了我们成功进行组织化学、免疫组织化学和原位杂交实验的具体方法。

在进行此处所示步骤之前，应先用洗涤剂清洗载玻片，然后用自来水和蒸馏水冲洗，再放入烘箱中干燥。干燥后的载玻片需在重铬酸钾溶液中轻轻浸泡24小时，之后再次冲洗并干燥，接着置于95%乙醇中至少2小时。在此步骤期间，可按照我们的方法准备其他载玻片或铬矾-明胶溶液。

明胶可在使用前保存于60度的水浴中。进行载玻片包被时，将少量明胶滴加至载玻片的一端，然后用另一块载玻片缓慢而均匀地将明胶在待包被的载玻片表面推开。

这会形成一层薄而均匀的膜。将其放入支架或干燥装置中，并置于烘箱内完全干燥，需静置过夜或48小时。使用葡萄汁琼脂平板收集胚胎，待准备就绪后，即可移除葡萄汁琼脂平板。

用 PBS 浸没培养板，并用软毛刷轻轻刷洗，以去除附着的胚胎。将含有胚胎的 PBS 转移至 1.5 毫升离心管中，并置于冰上静置。待胚胎在冰上沉降后，小心移除上清 PBS。

注意不要扰动管底的胚胎。向样品中加入 1 mL 50% 次氯酸钠溶液，轻轻振荡两分钟。通过过滤去除次氯酸钠溶液，并用 PBS 洗涤胚胎三次。

准备正庚烷。准备好后，将滤纸在溶液中轻轻振荡，使胚胎从滤纸上洗入正庚烷中。让胚胎在正庚烷培养皿底部沉淀，并将此正庚烷收集至新的1.5毫升离心管中。

向试管中加入1毫升甲醇，使溶液沉淀，然后吸除正庚烷-甲醇混合液。用PBS清洗胚胎3至5次，以去除残留的甲醇。吸去多余的PBS，加入Bouin固定液，静置30至60分钟，以固定胚胎。

去除Bouin固定液，并用PBS再次清洗胚胎三次。在PBS中配制1.2%琼脂糖，置于60度水浴中保温。然后轻轻吸除胚胎储存所用的多余PBS，以准备包埋。注意不要扰动底部的胚胎，随后将溶液底部的胚胎团块吸出，轻柔地放入瓶盖模具中。

在加入1.2%琼脂糖凝胶前，吸尽该模具中残留的PBS。配制PBS溶液用于储存这些琼脂糖小块。待琼脂糖完全凝固后，可将各个琼脂糖小块转移至该PBS溶液中保存。

此处展示的是逐级脱水过程。每次孵育时间为15分钟。然后将样品从100%乙醇中取出，置于乙醇与二甲苯按1:1配制的溶液中固定，再孵育15分钟。

从该1:1的二甲苯-石蜡溶液中取出后，再在纯二甲苯中处理1分钟。此时组织样本即可转移至预热的1:1二甲苯-石蜡溶液中，静置30分钟，随后在100%石蜡中进行最终包埋。

转移至第一缸100%石蜡中，静置2小时。在第二缸和第三缸石蜡中重复此过程。此时样品已准备好转移至模具中，并用石蜡充满模具，以完成包埋过程。

果蝇胚胎的包埋。将制备好的果蝇胚胎石蜡切片置于60°C烘箱中孵育15分钟，随后放入100%二甲苯溶液中。

然后开始复水。将切片依次放入以下每种溶液中各3分钟。切片放入蒸馏水后，再置于苏木精溶液中染色2分钟。

完成后，务必尽可能将载玻片上的溶液彻底沥干。将载玻片用蒸馏水冲洗后，再将其置于伊红染液中染色一分钟。最后，将载玻片从伊红染液中取出，并用蒸馏水冲洗。

一旦此载玻片清洁完毕，我们便开始最终的脱水步骤。最后将其放入100%二甲苯中5分钟。该步骤需在两份新的100%二甲苯溶液中重复进行，并在载玻片的一侧边缘滴加少量中性树胶。

取此盖玻片，轻轻放置在载玻片的一侧边缘。首先将载玻片放入100%二甲苯中进行脱蜡。一旦载玻片从蒸馏水中取出，应立即用1%过碘酸溶液覆盖。

然后弃去多余的溶液，并用蒸馏水冲洗。将载玻片直接放入预热的溶液中。此步骤完成后，用蒸馏水冲洗载玻片，再用0.2%氯化金溶液染色一到两分钟。

接下来，使用蒸馏水配制的3%硫代硫酸钠溶液固定组织，持续三分钟。然后用苏木精进行复染。复染后，可用此处所示的任一管蒸馏水洗去染液。

然后进入脱水步骤。将玻片直接放入100%二甲苯中，随后在玻片的一角滴加少量中性树胶，轻轻盖上盖玻片。

开始制备玻片，首先进行脱蜡并使用二甲苯处理，然后用等体积的二甲苯与乙醇混合液处理。一旦玻片完成脱蜡，我们便开始对组织进行再水化，最后置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。

将切片置于甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液中孵育10分钟。然后在切片上覆盖20 mL靶修复溶液。随后可将切片放入染色盒中。

将染色盒放入蒸锅中，确保溶液不会溢出，且切片仍被完全覆盖。注意，染色盒盖子不应完全闭合，以便在蒸煮过程中水蒸气能够逸出。然后用 PBS-T 轻柔冲洗三次。

弃去多余的溶液，并用 PBS 重复此步骤。接下来，将切片在过氧化物阻断液中孵育 5 至 10 分钟，然后再次用 PBS-T 多次漂洗，再用 PBS 漂洗。准备好抗体后，直接滴加到组织上。

随后可将这些组织在室温下孵育4小时。二抗应在室温下孵育90分钟，随后用5% DAB染色2至10分钟。当达到适当颜色后，用蒸馏水冲洗，然后用苏木精复染。

苏木精染色后，可依次对切片进行脱水。将切片放入100%二甲苯中，浸泡3分钟。然后在切片的一侧边缘滴加少量中性树胶。

放置封片胶后，取盖玻片，从载玻片的一侧轻轻盖上。向无菌、无RNase的反应管中加入一微克纯化的线性化模板DNA，然后加入足量的无菌、无RNase的DEPC处理双蒸水，使样品总体积达到13微升。

然后短暂离心，并在37摄氏度下孵育两小时。对于RNase保护实验，建议加入2微升无DNase-1的RNase，以去除模板DNA，孵育15分钟。孵育步骤完成后，加入2微升pH为8的0.2摩尔EDTA以终止反应。

在进行以下步骤之前，载玻片已根据我们先前展示的方案完成脱蜡和复水。复水后，将载玻片置于 pH 7.4 的 0.01 摩尔/升 PBS 中，每次孵育 5 分钟，重复两次，以去除组织中的固定液。在 PBS 洗涤后，接下来使用 100 毫摩尔/升甘氨酸溶液洗涤两次，每次 5 分钟，以去除组织中游离的醛基。

此步骤完成后，用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。接着，在含有 0.3% Triton X-100 的 PBS 中孵育 15 分钟，冲洗后再用浓度为 1 微克/微升的蛋白酶 K 孵育。随后，用 pH 7.2 的含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定载玻片 3 分钟。然后，洗涤载玻片，再与含 0.25% 乙酸酐的 0.1 摩尔三乙醇胺缓冲液（pH 8）孵育。

在此步骤中，您可以选择倾斜盒子以确保溶液完全覆盖。准备盒子时，将20%甘油或DEPC水加入干燥的杂交盒底部。接着，用20 µL预杂交溶液覆盖玻片。

向每张载玻片加入浓度为100微克/毫升的鲑鱼精子DNA。然后在42摄氏度下孵育4小时。此步骤需在预先准备好的湿盒中进行，以确保溶液在此过程中不会干燥。

在杂交后的阶段，必须将杂交溶液从样品中彻底冲洗干净。可通过在37摄氏度下依次用4倍浓度SSC、2倍浓度SSC、1倍浓度SSC、0.5倍浓度SSC和0.1倍浓度SSC溶液进行连续冲洗来实现，每次冲洗均在37摄氏度下孵育15分钟。

完成此步骤后，在加入洗涤缓冲液前，用 PBS 洗涤三次，每次五分钟。在进行下一步操作前，应先将洗涤缓冲液冲洗一分钟。确保在加入下一种溶液前，玻片上的洗涤缓冲液已完全干燥。向每张玻片加入 100 毫升封闭液，并将玻片孵育 30 分钟。

最好在避光环境中操作，以确保染色效果良好。随后，将切片再次置于20 mL抗体溶液中孵育30分钟。将抗体溶液直接加在切片上，确保组织完全覆盖。

孵育完成后，加入100毫升洗涤缓冲液。在避光条件下孵育15分钟，以去除未结合的抗体偶联物。移除洗涤缓冲液。

接着，加入20毫升检测缓冲液，孵育约4分钟。4分钟后，移除检测缓冲液。干燥载玻片以确保无多余液体残留，然后加入10毫升新鲜配制的显色底物溶液。

该反应在几分钟内开始，但需16小时才能完成。因此，需在避光条件下孵育相应时间。当观察到目标条带位置后，用50毫升TE缓冲液洗涤玻片以终止反应。

然后完成我们之前展示的中性树胶脱水和封片过程。图一和图二展示了用于石蜡切片的铬矾明胶涂层方法，以及在发育中的果蝇胚胎中FKBP12和DmFKBP12表达谱的包埋方法。图三显示了抗体检测到的FKBP12蛋白在合胞体细胞化囊胚阶段的分布情况。

从这些组织化学结果可以看出，FKBP12 在合胞体囊胚中的表达极性较弱，随后开始定位于滋养层上皮下方的基底膜，并在前后极形成表达梯度，前后极的表达量更高。图四展示了黑腹果蝇胚胎在早期和晚期原肠胚形成阶段的情况，显示 FKBP12 蛋白逐渐局限于原始胚胎组织的特定结构成分中，其细胞外分布较早期和晚期原肠胚阶段有所减少。

有趣的是，如图五所示，上述动态蛋白质分布并未伴随FKBP12的MRI水平发生相应变化，表明该蛋白质的表达可能是某种尚不明确的转录后分子机制的结果。雷诺丁受体介导的钙信号通路在脊椎动物和无脊椎动物的多种生理与病理过程中均发挥着基础性作用。

该基因的突变已知可导致多种生理紊乱，进而引发疾病或早期心脏性死亡。然而，该基因在早期果蝇发育过程中所起的作用一直难以研究。由于胚胎本身、富含脂质的胚胎组织以及富含几丁质的卵壳等过渡性结构的存在，使得对早期果蝇发育中蛋白质和胚胎表达的研究变得困难。

本文所述的载玻片包被、胚胎包埋及免疫组织化学技术，使我们能够详细研究雷诺丁受体蛋白及其mRNA的动态分布。我们分享这些技术，并希望它们能帮助其他研究者在果蝇早期发育阶段研究其他蛋白质。