Name: 早期果蝇胚胎内免疫组织化学和RNA原位分布的方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: 学习免疫组织化学和RNA原位杂交技术，用于研究黑腹果蝇早期胚胎发育过程中的蛋白质和RNA定位分布。该方法通过优化载玻片处理和胚胎包埋步骤，显著改善胚胎附着效果，为发育生物学研究提供可靠的技术支持。

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本工作得到国家自然科学基金（#31771377/31571273/31371256）、国家教育部外国杰出学者项目（#MS2014SXSF038）、国家教育部中央高校基本科研业务费专项资金（#GK201301001/201701005/GERP-17-45）以及XZ获得的陕西省优秀博士学位论文基金（#2019TS082/2019TS079）、陕西省教育厅重点项目（#20JS138）和陕西省科技厅自然科学基础研究计划青年项目（#2020JQ-885）的资助。

1. 葡萄汁琼脂平板的制备
<ol>
	<li>将5 g琼脂和5 g蔗糖加入150 mL蒸馏水中，用微波炉加热至琼脂和蔗糖完全溶解。将50 mL 100%葡萄汁与该溶液混合。</li>
	<li>加入1 mL 100%丙酸，使丙酸终浓度为0.5%。将25 mL制备好的溶液倒入每个培养皿中。待琼脂凝固后，于4 °C保存培养基。</li>
</ol>
2. 包被载玻片
<ol>
	<li>用去污剂预处理载玻片。用自来水清洗载玻片3次，再用蒸馏水清洗1次。然后将载玻片置于45 °C烘箱中干燥2小时。</li>
	<li>将载玻片浸入约450 mL重铬酸钾硫酸溶液（含20 g重铬酸钾、40 mL蒸馏水和400 mL浓硫酸）中，浸泡24小时。用自来水清洗载玻片3次，再用蒸馏水清洗1次。
	<ol>
		<li>将载玻片置于45 °C烘箱中干燥2小时。然后浸入95%乙醇中至少2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将0.5 g硫酸铬钾和5 g明胶加入1 L蒸馏水中。使用前在60 °C水浴中溶解。铬明矾明胶溶液可在4 °C长期保存。</li>
	<li>在载玻片上滴加10 µL铬明矾明胶溶液，并将溶液均匀、完整地覆盖整个载玻片面。将载玻片胶面朝上放置于42 °C烘箱中，持续48小时。制备好的载玻片可于4 °C保存以备后续使用。 
	&#8203;注意：此为关键步骤，必须实现完全包被。对于果蝇及其胚胎，该载玻片包被方法似乎比多聚赖氨酸包被更为高效。</li>
</ol>
3. Drosophila 胚胎包埋
<ol>
	<li>Drosophila 胚胎收集 
	注意：我们收集了四个时期的 Drosophila 胚胎，分别为 0–2 小时（合胞体囊胚期）、2–3 小时（细胞化囊胚期）、3–12 小时（早期原肠胚期）和 12–24 小时（晚期原肠胚期）18。各时期主要胚胎类型的比例如 表 1 所示。
	<ol>
		<li>将 400–500 只果蝇&#160;放入塑料收集瓶中，并在瓶口覆盖含酵母提取物的葡萄汁琼脂平板。Drosophila 胚胎在室温下产于葡萄汁琼脂表面。</li>
		<li>分别收集四个时期的胚胎，每个平板中轻轻加入 2 mL PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，pH 7.4），使胚胎漂浮。将约 200 个胚胎转移至 50 mL 离心管中，置于冰上 2 分钟，使胚胎沉降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预包埋
	<ol>
		<li>将 200 个 Drosophila 胚胎转移至 1.5 mL 离心管中，置于冰上 2 分钟使胚胎沉降，然后小心用移液器弃去上清液。向管中加入 1 mL 50% 次氯酸钠溶液，轻轻振荡 2 分钟。 
		注意：次氯酸钠溶液应新鲜配制，其用量可根据收集的胚胎数量适当调整。</li>
		<li>将胚胎倒在滤纸上轻轻收集，并用 1 mL PBS 洗涤 3 次，每次 1 mL。</li>
		<li>用滤纸将胚胎转移至约 5 mL 正庚烷中。</li>
		<li>将混合物转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 甲醇，轻轻振荡，待胚胎沉降后收集。</li>
		<li>弃去上清液，用 1 mL PBS 洗涤胚胎 3–5 次。</li>
		<li>用 400 µL Bouin 固定液（71% 饱和苦味酸，24% 甲醛，5% 乙酸）固定胚胎 30 分钟，随后用 1 mL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>为聚集胚胎，将样品转移至橡胶塞中，并去除 PBS。</li>
		<li>配制 1.2% 琼脂糖-PBS 溶液，并保持溶液温度在 60 °C。将 200 µL 1.2% 琼脂糖-PBS 溶液加至胚胎上，使胚胎固定成琼脂块。</li>
		<li>从橡胶塞中取出琼脂块，并将其保存在 PBS 中。 
		注意：在预包埋过程中，预热操作至关重要。我们强烈建议，本步骤中所使用的离心管和移液器吸头必须在操作前完全预热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡包埋
	<ol>
		<li>将预包埋的琼脂块依次浸入 35% 乙醇、50% 乙醇、75% 乙醇和 85% 乙醇中，各 15 分钟；然后分别浸入 95% 乙醇和 100% 乙醇中各 2 次。 
		注意：根据琼脂块中胚胎数量的不同，每一步所需的固定剂体积应为琼脂块体积的 5–10 倍，梯度脱水时间需 15–30 分钟。</li>
		<li>将胚胎块浸入 100% 乙醇与二甲苯（1:1）混合液中 15 分钟。</li>
		<li>将琼脂块转移至纯二甲苯中 1 分钟，使胚胎组织透明化。</li>
		<li>将琼脂块浸入二甲苯与石蜡（1:1）混合液中 30 分钟。</li>
		<li>将琼脂块依次浸入石蜡 I、石蜡 II 和石蜡 III 中，每次 2 小时。</li>
		<li>预先将包埋盒中充满石蜡，然后将琼脂块轻轻水平转移至包埋盒底部。待石蜡自然凝固后，可将凝固的石蜡块储存于 4 °C。 
		&#8203;注意：预包埋样品也可用于冰冻切片，操作步骤如下：在上述方法用琼脂糖完成预包埋后，样品可直接包埋于 OCT 包埋剂中，随后按照常规冰冻切片流程进行切片，之后可对切片进行常规染色处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 苏木精-伊红染色
<ol>
	<li>制备黑腹果蝇（Drosophila）胚胎切片。将制备好的切片置于60 °C烘箱中孵育15分钟，随后将切片浸入二甲苯中2次，每次10分钟。再将切片浸入100%乙醇与二甲苯（1:1比例）混合液中1次，持续2分钟。</li>
	<li>依次将切片在100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇和蒸馏水中各浸泡3分钟，以进行水化。</li>
	<li>用苏木精溶液染色切片2分钟。将载玻片迅速浸入1%酸性乙醇溶液（1 mL盐酸与100 mL 70%乙醇混合）中，随后用蒸馏水清洗载玻片。</li>
	<li>依次将载玻片浸入50%乙醇、75%乙醇、85%乙醇和95%乙醇中。</li>
	<li>用伊红溶液染色切片1分钟。</li>
	<li>将载玻片依次在95%乙醇I、95%乙醇II、95%乙醇III、100%乙醇I、100%乙醇II和100%乙醇III中脱水，每次1分钟。</li>
	<li>将载玻片依次在100%二甲苯I、100%二甲苯II和100%二甲苯III中透明处理，每次5分钟。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用中性树胶封片。</li>
</ol>
5. 高碘酸-银甲胺染色
<ol>
	<li>脱蜡并水化石蜡切片 果蝇 胚胎转移至蒸馏水中。</li>
	<li>在室温下用1%过碘酸氧化切片15分钟。</li>
	<li>将载玻片在蒸馏水中冲洗3次，每次1分钟。</li>
	<li>将载玻片置于约40 mL新近过滤的银-六亚甲基四胺工作液（3%六亚甲基四胺，5%硝酸银，5%硼砂溶液）中，于60 °C孵育1小时20分钟。随后用蒸馏水冲洗载玻片1分钟。</li>
	<li>用0.2%氯化金染色2分钟，然后用蒸馏水冲洗1分钟。</li>
	<li>将切片置于3%硫代硫酸钠中3分钟，然后用蒸馏水冲洗切片1分钟。</li>
	<li>用苏木精对切片进行复染，30 秒。用流动的自来水清洗切片 3–5 分钟。</li>
	<li>将切片依次在70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇I、95%乙醇II、95%乙醇III、100%乙醇I和100%乙醇II中各脱水5分钟。</li>
	<li>在二甲苯 I、二甲苯 II 和二甲苯 III 中各脱蜡 5 分钟。</li>
	<li>按照制造商说明，使用中性树胶封片。</li>
</ol>
6. 免疫组织化学
<ol>
	<li>按照标准方案19将黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的石蜡切片脱蜡并重新水化至磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>在室温下用含0.3% H2O2的甲醇处理载玻片10分钟，并避光。</li>
	<li>将合适的抗原修复缓冲液预热至约100 °C，放入带有载玻片的蔬菜蒸锅中的容器内。容器应配有盖子。将载玻片放入容器中，盖上蒸锅盖子。
	<ol>
		<li>从此刻起，在蒸锅中保持容器20分钟。注意载玻片容器的盖子不应完全拧紧，以便水蒸气在蒸制过程中进入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让载玻片自然冷却至室温，然后用PBS-T（含Tween-20的PBS，pH 7.2）轻轻冲洗3次，每次5分钟，再用PBS冲洗3次，每次1分钟。</li>
	<li>用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS在室温下封闭载玻片60分钟。</li>
	<li>加入一抗（FKBP12抗体，1:1000稀释）于载玻片上，在4 °C孵育过夜或在室温孵育4小时。</li>
	<li>用PBS-T洗涤载玻片4次，每次5分钟。</li>
	<li>加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗聚合物（抗兔抗体，1:5,000稀释），室温孵育90分钟。操作过程需避光，以防荧光淬灭。</li>
	<li>用PBS-T洗涤载玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入5% 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB），孵育2–10分钟，直至在显微镜下观察到反应产物颜色适宜为止。</li>
	<li>用苏木精对载玻片复染30秒，然后用蒸馏水洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>依次用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和100%乙醇脱水，每次1分钟。</li>
	<li>用100%二甲苯I、100%二甲苯II和100%二甲苯III各透明5分钟。</li>
	<li>根据制造商说明书，用中性树胶封片。</li>
</ol>
7. 原位 杂交
注意： 黑腹果蝇 胚胎切片使用经0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水制备。所有用于 原位 杂交前，需预先用DEPC处理过夜。
<ol>
	<li>核糖探针制备
	<ol>
		<li>通过使用能产生5'突出端的限制性内切酶，在克隆插入片段下游的限制性酶切位点处切割，将模板DNA线性化。线性化后，采用苯酚/氯仿抽提法纯化模板DNA，随后进行乙醇沉淀。使用标准实验方案。</li>
		<li>向无RN酶的离心管中加入1 µg纯化的模板DNA。将离心管置于冰上。加入DEPC处理的水至总体积为13 µL。
		<ol>
			<li>然后按以下顺序加入试剂：2 µL 10x NTP标记混合物、2 µL 10x转录缓冲液、1 µL protector RNase抑制剂、2 µL RNA聚合酶SP6或RNA聚合酶T7。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用移液器吹打混匀反应液，短暂离心。在 37 °C 下孵育 2 小时。 
		注意：延长孵育时间不会增加标记RNA的产量。在进入下一步操作前，必须对反应管进行短时离心（约800 rpm），这一点至关重要。该离心步骤可使孵育过程中可能附着于管壁的全部内容物沉降至管底。</li>
		<li>加入2 µL无RNase的DNase I以去除模板DNA，在37 °C下孵育15分钟。</li>
		<li>加入 2 µL 200 mM EDTA（pH 8.0）以终止反应。 
		注意：地高辛标记的RNA探针可在乙醇中于-15至-25 °C保存一年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预杂交 果蝇 胚胎切片
	<ol>
		<li>放置切片 果蝇 在42 °C的烘箱中孵育胚胎48 h。</li>
		<li>将切片在100%二甲苯中脱蜡，每次10分钟，共两次。</li>
		<li>依次将切片浸入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中，每种浓度各5分钟，以进行水化。</li>
		<li>将切片置于 PBS 中孵育，每次 5 分钟，重复 3 次，以去除组织中的固定液/Bouin 溶液。</li>
		<li>用100 mmol/L甘氨酸/PBS溶液洗涤载玻片，每次5分钟，共洗两次。</li>
		<li>用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共洗 2 次。</li>
		<li>将载玻片在含0.3% Triton X-100的PBS中孵育15分钟，以通透细胞膜。</li>
		<li>用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共清洗 3 次。</li>
		<li>将载玻片置于 15 µg/mL 无 RNase 的蛋白酶 K 中，37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>将切片在 PBS 中含有 4% 多聚甲醛的溶液中孵育 3 分钟，以终止消化反应。</li>
		<li>用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共洗 2 次。</li>
		<li>将切片在含有0.25%（v/v）乙酸酐的100 mM三乙醇胺缓冲液（pH 8.0）中孵育，每次5分钟，重复两次。</li>
		<li>向载玻片湿盒中加入DEPC水。在载玻片上加入20 µL预杂交液（含100 µg/mL鲑鱼精DNA）。将载玻片放入湿盒中。于42 °C孵育4小时。 
		注意：必须确保湿盒盖子的密封性，并始终保持湿盒处于水平状态，以防止预杂交液及后续杂交液挥发或偏离组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交 果蝇 胚胎切片
	<ol>
		<li>除去预杂交液，用0.2x SSC（150 mM氯化钠，15 mM柠檬酸钠，pH 7.0）洗涤载玻片，每次5分钟，共洗3次。用滤纸吸去组织样本周围的多余0.2x SSC溶液。</li>
		<li>用移液器加入30 µL探针杂交液（将2-6 ng地高辛标记的RNA探针用预杂交液稀释后加入）。将玻片置于玻片湿盒中，42 °C孵育约20小时。 
		注意：请务必确保盖子拧紧，如上一条注释所建议的。否则，预杂交液或杂交液泄漏会导致切片干燥，从而产生包括假阳性在内的背景污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交
	<ol>
		<li>移除杂交溶液，用4x SSC溶液在37 °C下洗涤载玻片，每次15分钟，共洗涤4次。</li>
		<li>在37 °C下，用含20 µg/mL RNase A的2x SSC溶液洗涤载玻片30分钟。</li>
		<li>在37 °C下用1x SSC溶液洗涤载玻片15分钟。</li>
		<li>在37 °C下用0.5x SSC溶液洗涤载玻片15分钟。</li>
		<li>在37 °C下用0.1x SSC溶液洗涤载玻片15分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
		<li>用洗涤缓冲液（100 mM 马来酸，150 mM NaCl，0.3% (v/v) Tween 20，pH 7.5）洗涤载玻片 1 分钟。</li>
		<li>将切片置于100 mL新配制的封闭液（2% 羊血清溶于不含Tween 20的马来酸缓冲液）中，孵育30分钟。</li>
		<li>将切片置于20 mL抗体溶液中孵育45分钟。
		<ol>
			<li>每次使用前，将抗体在原装小瓶中以10,000 rpm离心5分钟，小心从液面吸取所需量。用封闭液按1:5000（150 mU/mL）稀释抗地高辛-碱性磷酸酶抗体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 100 mL 洗涤缓冲液洗涤载玻片，每次 15 分钟，共洗 2 次，以去除未结合的抗体偶联物。</li>
		<li>将载玻片在20 mL检测缓冲液（100 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 9.5）中平衡2-5分钟。</li>
		<li>在载玻片湿盒中加入10 mL新配制的显色底物溶液，孵育载玻片。显色反应在数分钟内开始，16小时后完成。显色过程中切勿摇动或混匀。</li>
		<li>用50 mL蒸馏水清洗载玻片5分钟以终止反应。</li>
		<li>在避光条件下将样品干燥过夜。</li>
		<li>将切片依次在70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇I和100%乙醇II中脱水，每级3分钟。</li>
		<li>用100%二甲苯I、100%二甲苯II和100%二甲苯III分别清洗载玻片，每次20分钟。</li>
		<li>用中性树胶封片。</li>
		<li>使用倒置显微镜和厂商软件记录图像并进行分析。根据胚胎沿纵轴或不同区域中阳性信号的密度，使用 ImageJ 进行分布分析。 
		注意：在步骤 7.4.12 中与新配制的显色底物溶液孵育期间，即使肉眼也可观察到反应颜色。可通过体视显微镜检查显色情况。当反应颜色达到适当程度后，即可进行步骤 7.4.13 以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

RyRs 和 IP3Rs 介导的钙信号传导是脊椎动物和无脊椎动物多种生理与病理过程中的基本通路1,2,3,4。在人类中，RyR2 基因的点突变（如与儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速相关的 R4496C 突变）会导致心肌细胞肌浆网中的钙泄漏，从而引发心脏功能障碍。这些突变表现为在体力活动期间出现心律失常，并具有较高的猝死风险，该表型可在携带此突变的基因工程小鼠模型中重现。在运动条件下，携带该钙泄漏突变的小鼠会出现心脏性猝死，而野生型对照小鼠则未表现出此现象18,20,21,22。在心脏中过表达 RyRs 调节蛋白 FKBP12 与小...

钙诱导的钙释放信号（CICR）在许多生物过程中发挥关键作用，例如骨骼肌/平滑肌和心脏血管功能、细胞增殖与凋亡、发育、衰老、神经元突触可塑性以及再生1,2,3,4,5,6。兰尼碱受体（RyRs）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3Rs）是钙信号通路中的主要参与者，其活性受蛋白激酶A（PKA）、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）、FK506结合蛋白（FKBPs）、钙网蛋白（CSQ）、三联蛋白（triadin）和连接蛋白（junctin）等调节因子调控1,2,3,4,5,6。这些蛋白在人体中的异常表达或突变可导致心律失常7和肿瘤性增殖8,9等病理性生理状态。
FKBPs 通过兰尼碱受体（RyRs）调控内质网（ER）中的钙释放。这一过程对于收缩机制至关重要&#160;，因而负责由肌球蛋白-肌动蛋白收缩所产生的一切机械运动，该过程依赖于钙诱导的钙释放以及胚胎期 RyRs 的参与1,2。在小鼠模型中，RyR2 及其调控蛋白 FKBP12/Calstabin 的缺失无一例外地导致死亡，死亡发生于胚胎发育期或出生后早期10,11,12。FKBP12/Calstabin 基因敲除小鼠在胚胎发育期间表现出严重的心脏缺陷，包括兴奋-收缩耦联（EC）异常以及脑水肿。这表明 FKBP12/Calstabin 在调控 RyR2 通道表达方面发挥着关键作用，对心脏和大脑的发育均具有重要意义10。
在受精的青鳉鱼卵的合子形成阶段，首次发现了由RyR介导的钙火花现象13,14。然而，关于钙信号在早期胚胎发育中的功能，相关研究仍十分有限。在Drosophila melanogaster中，对DmFKBP12 S107突变体的研究结果提供了强有力的证据，表明该基因在幼虫发育及健康寿命中具有重要作用，这归因于其对抗氧化应激的功能15,16。最近，我们鉴定了FKBP12/Calstabin蛋白及其信使RNA在早期Drosophila melanogaster发育过程中的动态定位17。通过本方法学中所述的技术，我们能够追踪D. melanogaster在合胞体囊胚期（0–2 h）、细胞化囊胚期（2–3 h）、早期原肠胚期（3–12 h）以及晚期原肠胚期（12–24 h）中FKBP12/Calstabin的表达情况。本文中，我们详细描述了先前研究中所用各项技术的具体实验方案，包括用于经典石蜡切片的胚胎前包埋、胚胎切片载玻片的预包被处理、组织化学染色与免疫染色，以及用于基因表达鉴定的mRNA原位杂交技术。

<table><tbody><tr><td>-20&amp;deg;C 冰箱</td><td>Meiling Biology &amp;Medical</td><td>DW-YL270</td><td>用于试剂储存</td></tr><tr><td>-80&amp;deg;C 超低温冰箱</td><td>Thermo</td><td>Forma 90 系列</td><td>用于试剂储存</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>葡萄汁琼脂平板的制备</td></tr><tr><td>抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab 片段</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>用于检测地高辛标记的化合物</td></tr><tr><td>生化培养箱</td><td>上海蓝帕仪器</td><td>LRH-250</td><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt;杂交</td></tr><tr><td>波因氏溶液</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>69945460</td><td>果蝇胚胎包埋</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt;杂交</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Denville</td><td>C-2170</td><td>果蝇胚胎收集</td></tr><tr><td>铬明矾</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>10001018</td><td>载玻片涂布</td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>金坛恒丰仪器</td><td>KW-1000DC</td><td>苏木精-伊红染色、免疫组织化学、原位杂交及高碘酸-银甲胺染色</td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision 检测系统</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>在免疫组织化学反应或原位杂交反应中，与一抗结合，并通过染色对目标进行标记</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>原位杂交</td></tr><tr><td>DIG RNA 标记试剂盒</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>利用 SP6 和 T7 RNA 聚合酶通过体外转录，用地高辛-UTP 对 RNA 进行标记</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington 果蝇资源中心</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;突变品系</td></tr><tr><td>电热鼓风干燥箱</td><td>天津泰斯特仪器</td><td>101-0AB</td><td>用于载玻片涂布和石蜡包埋</td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>苏木精-伊红染色</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>100092680</td><td>石蜡包埋、苏木精-伊红染色、免疫组织化学、原位杂交及高碘酸-银甲胺染色</td></tr><tr><td>明胶</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>10010328</td><td>载玻片涂布</td></tr><tr><td>氯金酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>高碘酸-银甲胺染色</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>苏木精-伊红染色</td></tr><tr><td>High Pure PCR 产物纯化试剂盒</td><td>Roche</td><td>11732668001</td><td>用于 PCR 产物的纯化</td></tr><tr><td>智能恒温恒湿箱</td><td>宁波江南仪器</td><td>HWS</td><td>用于果蝇饲养</td></tr><tr><td>LE 琼脂糖</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>预包埋</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>10014108</td><td>果蝇胚胎收集</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>苏木精-伊红染色、免疫组织化学、原位杂交及高碘酸-银甲胺染色</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>MeVid 实验耗材制造</td><td>P105-2001</td><td>载玻片涂布</td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>10004160</td><td>苏木精-伊红染色</td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>40026768</td><td>果蝇胚胎收集</td></tr><tr><td>石蜡切片机</td><td>华海科学仪器</td><td>HH-2508III</td><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt;杂交</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>69019461</td><td>石蜡包埋</td></tr><tr><td>pH/mV 计</td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>用于测定溶液的 pH 值</td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>10018461</td><td>高碘酸-银甲胺染色</td></tr><tr><td>超纯水仪</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt;杂交</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>国药集团北京化学试剂</td><td>10023418</td><td>石蜡包埋</td></tr></tbody></table>

一种用于免疫组织化学与rna的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

钙诱导钙释放信号（CICR）在许多生物过程中发挥着关键作用。从细胞增殖与凋亡、发育与衰老，到神经元突触可塑性及再生，这些细胞活动均与兰尼碱受体（Ryanodine receptors, RyRs）相关。尽管钙信号在生物学中具有重要意义，但其在早期发育中的具体作用机制仍不明确。作为一种妊娠周期较短的生物，其胚胎在 黑腹果蝇 是研究发育过程中CICR相关蛋白及其调控因子分布与定位的理想对象。然而，由于其胚胎富含脂质且卵壳富含几丁质，导致胚胎难以牢固附着于玻璃表面，限制了其应用。本文中，我们介绍了一种实用的实验方案，可显著增强胚胎在玻璃表面的附着能力 果蝇 将胚胎置于载玻片上，并详细说明成功进行组织化学、免疫组织化学的实验方法 原位 杂交。铬矾明胶载玻片包被法和胚胎预包埋法显著提高了研究中的产量 果蝇 胚胎蛋白质和RNA表达。为展示该方法，我们研究了DmFKBP12/Calstabin，其为果蝇早期胚胎发育过程中兰尼碱受体（RyR）的一个已知调控因子 黑腹果蝇我们鉴定了 DmFKBP12 在合胞体囊胚阶段早期即开始，并报告其动态表达模式 DmFKBP12 在发育过程中：最初在合胞体原肠胚中均匀分布，随后在细胞化原肠胚阶段初步定位于皮层的基底层，继而在原肠胚早期三胚层阶段分布于原始神经结构和消化结构中。这种分布模式可能解释了兰尼碱受体（RyR）在起源于这些胚层的重要器官系统中的关键作用，包括舌下神经节、咽上神经节、腹神经索以及肌肉骨骼系统。

图示描述了用于克服高脂质和高几丁质卵壳粘附难题的实验方案 果蝇 胚胎（表1) 涂布于玻片表面，以供观察和实验。采用所示的铬矾明胶玻片涂布法进行处理。 图1，我们增强了附着性 果蝇 将胚胎置于载玻片表面，而胚胎预包埋方法如图所示 图2 可实现对蛋白质和RNA DmFKBP12/Calstabin在早期发育全部四个阶段中动态分布的高效检测即，合胞体囊胚，细胞囊胚，原肠胚早期和晚期的 果蝇 胚胎 图3 显示了抗体检测到的FKBP12/Calstabin在合胞体胚盘和细胞胚盘阶段的蛋白质分布。根据这些组织化学结果可以看出，FKBP12在合胞体胚盘阶段的表达极性较弱（图A至H），随后开始定位于滋养外胚层上皮下方的基底膜内，形成从前端到后端表达量递减的梯度分布（图I至S）。最终，DmFKBP12/Calstabin蛋白局限于原始胚胎组织的特定结构成分中，其细胞外分布较...

在此，我们描述了一种用于检测与定位的实验方案 黑腹果蝇 从收集到预包埋和包埋、免疫染色以及 mRNA 检测的胚胎蛋白与 RNA 原位 杂交

一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

钙诱导钙释放信号（CICR）在多种生物过程中发挥关键作用。从细胞增殖到……的每一项细胞活动

作为一种妊娠周期较短的生物，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的胚胎是研究发育过程中蛋白质及其调控因子分布与定位的理想研究对象。然而，由于其胚胎富含脂质且卵壳富含几丁质，导致胚胎难以牢固地贴附在玻璃表面，限制了其应用。在本研究中，我们介绍了一种实用方法，可显著增强黑腹果蝇胚胎在载玻片上的附着效果，并详细阐述了我们成功进行组织化学、免疫组织化学和原位杂交实验的具体方法。在进行此处所示步骤之前，应先用洗涤剂清洗载玻片，然后用自来水和蒸馏水冲洗，再放入烘箱中干燥。干燥后的载玻片需在重铬酸钾溶液中轻轻浸泡24小时，之后再次冲洗并干燥，接着置于95%乙醇中至少2小时。在此步骤期间，可按照我们的方法准备其他载玻片或铬矾-明胶溶液。明胶可在使用前保存于60度的水浴中。进行载玻片包被时，将少量明胶滴加至载玻片的一端，然后用另一块载玻片缓慢而均匀地将明胶在待包被的载玻片表面推开。这会形成一层薄而均匀的膜。将其放入支架或干燥装置中，并置于烘箱内完全干燥，需静置过夜或48小时。使用葡萄汁琼脂平板收集胚胎，待准备就绪后，即可移除葡萄汁琼脂平板。用 PBS 浸没培养板，并用软毛刷轻轻刷洗，以去除附着的胚胎。将含有胚胎的 PBS 转移至 1.5 毫升离心管中，并置于冰上静置。待胚胎在冰上沉降后，小心移除上清 PBS。注意不要扰动管底的胚胎。向样品中加入 1 mL 50% 次氯酸钠溶液，轻轻振荡两分钟。通过过滤去除次氯酸钠溶液，并用 PBS 洗涤胚胎三次。准备正庚烷。准备好后，将滤纸在溶液中轻轻振荡，使胚胎从滤纸上洗入正庚烷中。让胚胎在正庚烷培养皿底部沉淀，并将此正庚烷收集至新的1.5毫升离心管中。向试管中加入1毫升甲醇，使溶液沉淀，然后吸除正庚烷-甲醇混合液。用PBS清洗胚胎3至5次，以去除残留的甲醇。吸去多余的PBS，加入Bouin固定液，静置30至60分钟，以固定胚胎。去除Bouin固定液，并用PBS再次清洗胚胎三次。在PBS中配制1.2%琼脂糖，置于60度水浴中保温。然后轻轻吸除胚胎储存所用的多余PBS，以准备包埋。注意不要扰动底部的胚胎，随后将溶液底部的胚胎团块吸出，轻柔地放入瓶盖模具中。在加入1.2%琼脂糖凝胶前，吸尽该模具中残留的PBS。配制PBS溶液用于储存这些琼脂糖小块。待琼脂糖完全凝固后，可将各个琼脂糖小块转移至该PBS溶液中保存。此处展示的是逐级脱水过程。每次孵育时间为15分钟。然后将样品从100%乙醇中取出，置于乙醇与二甲苯按1:1配制的溶液中固定，再孵育15分钟。从该1:1的二甲苯-石蜡溶液中取出后，再在纯二甲苯中处理1分钟。此时组织样本即可转移至预热的1:1二甲苯-石蜡溶液中，静置30分钟，随后在100%石蜡中进行最终包埋。转移至第一缸100%石蜡中，静置2小时。在第二缸和第三缸石蜡中重复此过程。此时样品已准备好转移至模具中，并用石蜡充满模具，以完成包埋过程。果蝇胚胎的包埋。将制备好的果蝇胚胎石蜡切片置于60°C烘箱中孵育15分钟，随后放入100%二甲苯溶液中。然后开始复水。将切片依次放入以下每种溶液中各3分钟。切片放入蒸馏水后，再置于苏木精溶液中染色2分钟。完成后，务必尽可能将载玻片上的溶液彻底沥干。将载玻片用蒸馏水冲洗后，再将其置于伊红染液中染色一分钟。最后，将载玻片从伊红染液中取出，并用蒸馏水冲洗。一旦此载玻片清洁完毕，我们便开始最终的脱水步骤。最后将其放入100%二甲苯中5分钟。该步骤需在两份新的100%二甲苯溶液中重复进行，并在载玻片的一侧边缘滴加少量中性树胶。取此盖玻片，轻轻放置在载玻片的一侧边缘。首先将载玻片放入100%二甲苯中进行脱蜡。一旦载玻片从蒸馏水中取出，应立即用1%过碘酸溶液覆盖。然后弃去多余的溶液，并用蒸馏水冲洗。将载玻片直接放入预热的溶液中。此步骤完成后，用蒸馏水冲洗载玻片，再用0.2%氯化金溶液染色一到两分钟。接下来，使用蒸馏水配制的3%硫代硫酸钠溶液固定组织，持续三分钟。然后用苏木精进行复染。复染后，可用此处所示的任一管蒸馏水洗去染液。然后进入脱水步骤。将玻片直接放入100%二甲苯中，随后在玻片的一角滴加少量中性树胶，轻轻盖上盖玻片。开始制备玻片，首先进行脱蜡并使用二甲苯处理，然后用等体积的二甲苯与乙醇混合液处理。一旦玻片完成脱蜡，我们便开始对组织进行再水化，最后置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。将切片置于甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液中孵育10分钟。然后在切片上覆盖20 mL靶修复溶液。随后可将切片放入染色盒中。将染色盒放入蒸锅中，确保溶液不会溢出，且切片仍被完全覆盖。注意，染色盒盖子不应完全闭合，以便在蒸煮过程中水蒸气能够逸出。然后用 PBS-T 轻柔冲洗三次。弃去多余的溶液，并用 PBS 重复此步骤。接下来，将切片在过氧化物阻断液中孵育 5 至 10 分钟，然后再次用 PBS-T 多次漂洗，再用 PBS 漂洗。准备好抗体后，直接滴加到组织上。随后可将这些组织在室温下孵育4小时。二抗应在室温下孵育90分钟，随后用5% DAB染色2至10分钟。当达到适当颜色后，用蒸馏水冲洗，然后用苏木精复染。苏木精染色后，可依次对切片进行脱水。将切片放入100%二甲苯中，浸泡3分钟。然后在切片的一侧边缘滴加少量中性树胶。放置封片胶后，取盖玻片，从载玻片的一侧轻轻盖上。向无菌、无RNase的反应管中加入一微克纯化的线性化模板DNA，然后加入足量的无菌、无RNase的DEPC处理双蒸水，使样品总体积达到13微升。然后短暂离心，并在37摄氏度下孵育两小时。对于RNase保护实验，建议加入2微升无DNase-1的RNase，以去除模板DNA，孵育15分钟。孵育步骤完成后，加入2微升pH为8的0.2摩尔EDTA以终止反应。在进行以下步骤之前，载玻片已根据我们先前展示的方案完成脱蜡和复水。复水后，将载玻片置于 pH 7.4 的 0.01 摩尔/升 PBS 中，每次孵育 5 分钟，重复两次，以去除组织中的固定液。在 PBS 洗涤后，接下来使用 100 毫摩尔/升甘氨酸溶液洗涤两次，每次 5 分钟，以去除组织中游离的醛基。此步骤完成后，用 PBS 冲洗载玻片 5 分钟。接着，在含有 0.3% Triton X-100 的 PBS 中孵育 15 分钟，冲洗后再用浓度为 1 微克/微升的蛋白酶 K 孵育。随后，用 pH 7.2 的含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定载玻片 3 分钟。然后，洗涤载玻片，再与含 0.25% 乙酸酐的 0.1 摩尔三乙醇胺缓冲液（pH 8）孵育。在此步骤中，您可以选择倾斜盒子以确保溶液完全覆盖。准备盒子时，将20%甘油或DEPC水加入干燥的杂交盒底部。接着，用20 µL预杂交溶液覆盖玻片。向每张载玻片加入浓度为100微克/毫升的鲑鱼精子DNA。然后在42摄氏度下孵育4小时。此步骤需在预先准备好的湿盒中进行，以确保溶液在此过程中不会干燥。在杂交后的阶段，必须将杂交溶液从样品中彻底冲洗干净。可通过在37摄氏度下依次用4倍浓度SSC、2倍浓度SSC、1倍浓度SSC、0.5倍浓度SSC和0.1倍浓度SSC溶液进行连续冲洗来实现，每次冲洗均在37摄氏度下孵育15分钟。完成此步骤后，在加入洗涤缓冲液前，用 PBS 洗涤三次，每次五分钟。在进行下一步操作前，应先将洗涤缓冲液冲洗一分钟。确保在加入下一种溶液前，玻片上的洗涤缓冲液已完全干燥。向每张玻片加入 100 毫升封闭液，并将玻片孵育 30 分钟。最好在避光环境中操作，以确保染色效果良好。随后，将切片再次置于20 mL抗体溶液中孵育30分钟。将抗体溶液直接加在切片上，确保组织完全覆盖。孵育完成后，加入100毫升洗涤缓冲液。在避光条件下孵育15分钟，以去除未结合的抗体偶联物。移除洗涤缓冲液。接着，加入20毫升检测缓冲液，孵育约4分钟。4分钟后，移除检测缓冲液。干燥载玻片以确保无多余液体残留，然后加入10毫升新鲜配制的显色底物溶液。该反应在几分钟内开始，但需16小时才能完成。因此，需在避光条件下孵育相应时间。当观察到目标条带位置后，用50毫升TE缓冲液洗涤玻片以终止反应。然后完成我们之前展示的中性树胶脱水和封片过程。图一和图二展示了用于石蜡切片的铬矾明胶涂层方法，以及在发育中的果蝇胚胎中FKBP12和DmFKBP12表达谱的包埋方法。图三显示了抗体检测到的FKBP12蛋白在合胞体细胞化囊胚阶段的分布情况。从这些组织化学结果可以看出，FKBP12 在合胞体囊胚中的表达极性较弱，随后开始定位于滋养层上皮下方的基底膜，并在前后极形成表达梯度，前后极的表达量更高。图四展示了黑腹果蝇胚胎在早期和晚期原肠胚形成阶段的情况，显示 FKBP12 蛋白逐渐局限于原始胚胎组织的特定结构成分中，其细胞外分布较早期和晚期原肠胚阶段有所减少。有趣的是，如图五所示，上述动态蛋白质分布并未伴随FKBP12的MRI水平发生相应变化，表明该蛋白质的表达可能是某种尚不明确的转录后分子机制的结果。雷诺丁受体介导的钙信号通路在脊椎动物和无脊椎动物的多种生理与病理过程中均发挥着基础性作用。该基因的突变已知可导致多种生理紊乱，进而引发疾病或早期心脏性死亡。然而，该基因在早期果蝇发育过程中所起的作用一直难以研究。由于胚胎本身、富含脂质的胚胎组织以及富含几丁质的卵壳等过渡性结构的存在，使得对早期果蝇发育中蛋白质和胚胎表达的研究变得困难。本文所述的载玻片包被、胚胎包埋及免疫组织化学技术，使我们能够详细研究雷诺丁受体蛋白及其mRNA的动态分布。我们分享这些技术，并希望它们能帮助其他研究者在果蝇早期发育阶段研究其他蛋白质。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案原位早期分布果蝇胚胎

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