通过模拟大鼠肝移植模型中的血流动力学变化研究器官缺血-再灌注损伤

通过模拟大鼠肝移植模型中的血流动力学变化，研究器官缺血-再灌注损伤。缺血-再灌注损伤是肝移植术后常见的并发症。合并肝外器官受累的患者通常住院时间更长，医疗费用更高，且预后更差。

该并发症的发生与肝移植无肝期的持续时间密切相关。然而，肝移植后缺血-再灌注损伤的基础研究表明，肝移植术后的存活率与肝外器官损伤程度呈负相关。根据无肝期的定义，我们模拟了肝移植过程中导致肝外器官缺血-再灌注损伤的血流动力学变化。

本文的目的是详细介绍如何建立大鼠无肝期动物模型，用于肝移植后缺血-再灌注损伤的基础研究。袁 Yuan 博士负责所有视频中的动物操作。所需器械包括直头和弯头眼科镊、人工晶状体（IOL）镊、眼科剪、一至两把拉钩、棉签、3-0 外科缝线、碘仿纱布、缝合针，必要时使用 Biosystems 系统；其中人工晶状体（IOL）镊因具有圆头设计，可用于分离血管。

动物麻醉机、脱水机、包埋机、病理切片机、冷冻机、组织切片机、电热鼓风干燥箱、神经光学显微镜、扫描仪、用于全身麻醉的安氟醚、4%多聚甲醛溶液、无水乙醇、二甲苯、高效石蜡、苏木精-伊红染色液、盐酸、氨水、载玻片、盖玻片、中性树胶及染色试剂，以及耗材。移液器、离心机、全自动生化分析仪、丙氨酸氨基转移酶、ALT试剂盒、天冬氨酸、氨基转移酶、AST试剂盒、肌酐试剂盒。称重后，使用动物麻醉机通过异氟烷对大鼠进行麻醉。

腹部消毒后，使用镊子和剪刀在剑突下方做一条3厘米长的正中切口。打开腹腔，用拉钩暴露肝脏，并游离肝胃韧带。用棉签轻轻翻转肝脏中叶并向上抬起，以暴露肝门。

辨认胆管、门静脉和肝动脉。使用棉签将小肠推向左下腹腔，并将下腔静脉移至右肾静脉处，用眼内透镜（IOL）镊子分别分离出右肾静脉上方的门静脉、肝动脉和下腔静脉，每把镊子均用带滑结的3-0丝线标记。切开左右下肢的皮肤，使用眼科镊子暴露股静脉。

通过股静脉缓慢注射625 IU/kg的低分子量肝素，以实现全身肝素化。使用3-0缝线结扎门静脉、肝动脉和右肾静脉上方的下腔静脉，持续45分钟。将小肠放回腹腔，并用纱布覆盖。

在这些时间段内应减少吸入麻醉。45分钟后，松开门静脉、肝动脉以及右肾静脉上方的下腔静脉。逐层缝合肌肉和皮肤，并终止吸入麻醉。

术后使用皮下注射吗啡（5 mg/kg，每4小时一次）提供镇痛。观察大鼠直至其清醒，并在温度为25±2°C、湿度为50±10%的环境中饲养，需使用动物加热灯。在该动物模型中，根据缺血时间将大鼠随机分为五组：缺血15分钟组（I 15组）、30分钟组（I 30组）、45分钟组（I 45组）、60分钟组（I 60组）以及假手术组（sham组），每组10只大鼠。术后观察各组大鼠14天的存活率。

在 I 15、I 30 和假手术组中，所有大鼠均存活。I 45 组有 8 只大鼠存活至 14 天，而 I 60 组仅有 2 只存活。结果表明，大鼠最多可耐受 45 分钟的无肝期。

实验过程中，使用Biosystems系统记录了大鼠在无肝期前后的心率和血压变化，以及右侧颈内动脉插管的情况。我们发现，血管结扎后，大鼠的心率和平均动脉压（MAP）发生了显著变化。结扎后，肝脏缺血、肠道淤血和水肿、胃底静脉曲张以及脾脏肿大均明显可见。

将80只大鼠随机分为八组，分别为缺血45分钟组（T0）、再灌注6小时组（T6）、12小时组（T12）、24小时组（T24）、48小时组（T48）、72小时组（T72）、7天组（T7）和14天组（T14）。处死大鼠后取肾脏、胰腺、小肠、心脏和肺组织，进行HE染色。除心脏外，其余组织均根据文献参考标准分别进行病理评分。

结果显示，肝外器官损伤最严重的时期各不相同。胰腺为术后6至24小时，肺为术后24至48小时。肠道和肾脏在缺血45分钟后损伤最为严重。

术后24小时，肠黏膜未见明显异常，肾脏在48小时后恢复正常。至于心脏，随着再灌注后时间的推移，术后24至48小时内心肌组织出现局部心肌细胞坏死、细胞碎裂与溶解、炎性细胞浸润以及局部血管扩张和充血。采集血清，采用自动生化分析仪检测ALT、AST、肌酐和淀粉酶水平。

所有指标均在24至48小时达到峰值，与病理变化不同。尽管术后48小时各项指标水平基本恢复正常，但病理损伤仍在持续。综上所述，该大鼠模型无需显微外科操作，简便易行，可为肝缺血后肝外器官缺血-再灌注损伤的基础研究提供依据。