Name: 患者源性肿瘤外植体作为预测患者耐药性的实时临床前平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 了解患者源性肿瘤外植体作为临床前药物测试平台的方法，用于评估肿瘤药物反应并发现预测性生物标志物。该技术保留三维肿瘤微环境结构，支持精准医学和个性化癌症治疗研究。

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我们感谢莱斯特大学医院NHS信托基金的外科医生和病理学家提供手术切除的肿瘤组织。我们还感谢核心生物技术服务中心的组织学设施在FFPE组织块的处理和切片方面提供的帮助，以及Kees Straatman在使用Vectra Polaris系统方面的支持。本研究由Explant联盟资助并提供资金支持，该联盟包括四个合作单位：莱斯特大学、医学研究理事会毒理学部门、英国癌症研究会治疗发现实验室以及LifeArc。此外，研究还获得了英国癌症研究中心-英国国家健康研究所莱斯特实验癌症医学中心（C10604/A25151）的支持。GM、CD和NA的研究经费由Breast Cancer Now的Catalyst计划（2017NOVPCC1066）提供，该计划获得了辉瑞公司的资金支持。

1. 组织采集
<ol>
	<li>手术后，将新鲜切除的人类肿瘤标本转移至含有 25 mL 新鲜培养基（DMEM 高糖培养基，添加 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺&#160;+ 1% (v/v) 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素）的离心管中，并置于冰上保存。在手术后 2 小时内于无菌 II 级生物安全柜中处理组织块。</li>
</ol>
2. 外植体准备
<ol>
	<li>使用70%工业变性酒精（IMS）溶液清洁所有手术器械（植皮刀片/牙科蜡表面/镊子）。</li>
	<li>在10 cm培养皿（参见材料表）中加入约25 mL新鲜培养基，并将其置于冰床上。</li>
	<li>用镊子将样本转移至牙科蜡表面（参见材料表），并使用两把植皮刀片将组织切成约2–3 mm3大小的碎片。 
	注意：为获得最佳效果，应先将组织切成2–3 mm厚的单条，再沿长度方向切割该条带以获得最终的组织块。重复此过程，直至整个样本被切碎。</li>
	<li>立即将组织块转移至10 cm培养皿中的冰冻培养基中。取部分组织块（6–9块），放入含有10%非缓冲福尔马林溶液的1 mL离心管中，在室温（RT）下放置24小时。 
	注意：这些组织块将作为“未培养”条件下的对照组织块。</li>
	<li>在6孔板的每个孔中加入1.5 mL新鲜培养基，并在每个孔中放置一个组织培养插入式圆盘（参见材料表），使其漂浮在培养基表面，注意避免培养基与插入物界面处产生气泡。</li>
	<li>随机选取组织块，逐个放置在插入式圆盘表面。为与“未培养”条件保持一致，每孔使用6–9个组织块。将多孔板置于37 °C、5% CO2的CO2培养箱中，使组织块恢复培养16小时。 
	注意：为避免压碎组织，强烈建议轻柔操作镊子。</li>
</ol>
3. 药物处理
<ol>
	<li>16 小时后，取新的 6 孔板，向每孔加入 1.5 mL 新鲜培养基，按所需浓度加入相应的药物，并设置一个溶剂对照孔。使用镊子将含有外植体的每个插入物转移至已加入药物的 newly prepared 6 孔板中。将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的 CO2 培养箱中培养 24–48 小时。</li>
	<li>将先前用甲醛固定的未培养外植体转移至组织学包埋盒中（见下文第 4 节），并保存于 70% IMS 中直至实验结束。</li>
</ol>
4. 组织学处理
<ol>
	<li>组织固定
	<ol>
		<li>药物处理后，将含有外植体的插入圆盘转移至新的6孔板中，孔板内含10%福尔马林，并在外植体表面滴加数滴10%福尔马林，以确保外植体完全被固定液覆盖。 
		注意：福尔马林具有危害性。避免与皮肤接触，并在通风橱内操作以防止吸入。</li>
		<li>让外植体在10%福尔马林中静置过夜（20–24小时）。</li>
		<li>次日，将适量的小型组织学海绵浸入70%工业甲基化酒精（IMS）中，然后放入组织学包埋盒内。将来自同一药物处理条件下的所有外植体轻柔地转移至同一块海绵上（保持外植体的方向，使与插入圆盘接触的一侧，即药物处理区域，与海绵接触）。在外植体上方再放置一块预先浸泡过的海绵，并将包埋盒封好（每个孔/处理条件使用一个包埋盒）。</li>
		<li>将包埋盒浸入70% IMS中，在室温下放置24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡包埋与组织切片
	<ol>
		<li>次日，将含有外植体的组织学包埋盒转移至组织处理机（见材料表）的样品篮中，并盖紧盖子。将样品篮放入消解罐中并轻轻关闭。选择所需程序，启动组织处理机。排空消解罐，打开后取出样品篮，然后将样品篮转移至包埋中心的石蜡浴中。</li>
		<li>完成包埋后，将金属包埋盒盖放回样品篮中，再将样品篮放回组织处理机的消解罐内，运行清洗程序。用干燥的纸巾擦拭传感器，清除消解罐盖上的多余石蜡，然后执行清洗程序。</li>
		<li>将石蜡块置于旋转式切片机上，先切去数片4 µm厚的切片，然后将石蜡块放回冰上。重新调整石蜡块位置，继续切取更多4 µm厚的切片。使用小号画笔和镊子将切片转移至水浴中，以去除皱褶和气泡。</li>
		<li>将切片居中放置于载玻片上，静置数分钟以沥干液体，随后将载玻片放入玻片架中，在37 °C孵育箱内干燥过夜。切片干燥后，将其存放于室温下的玻片夹或玻片盒中，以防灰尘污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>将染色机（参见材料表）加入试剂，并设置H&amp;#38;E染色所需程序：苏木精染色时间：5 min；伊红染色时间：3 min。</li>
	<li>将载玻片架固定在载体上，放入第一个盛有二甲苯的容器中，启动程序。将载玻片载体从架上取下，连同载玻片架一起转移至封片区域。</li>
	<li>在通风橱内使用邻苯二甲酸二丁酯二甲苯（DPX）进行封片。在每张盖玻片上滴加DPX，将组织面朝下将载玻片缓慢置于盖玻片上，使DPX均匀铺展。 
	注意：DPX具有危害性，避免接触皮肤，并在指定通风橱内操作。</li>
</ol>
6. 免疫染色
注意：除非另有说明，以下步骤均在室温下进行。
<ol>
	<li>脱蜡与复水
	<ol>
		<li>将切片放入切片架中，在65 °C下加热10分钟，然后用二甲苯脱蜡3分钟（2次）。尽量减少溶液的残留量。 
		注意：二甲苯易燃、有害且具有刺激性。应在通风橱内操作，并佩戴双层手套。避免接触皮肤和眼睛。废液应置于密闭容器中妥善处理。</li>
		<li>按照以下酒精梯度对切片进行复水：99% IMS 溶液中孵育 1 分钟（两次），随后在 95% IMS 溶液中孵育 1 分钟。尽量减少溶液的残留量。 
		注意：IMS 高度易燃、易挥发且具有刺激性。应在通风橱内操作，避免接触皮肤和眼睛。</li>
		<li>将载玻片架完全浸入超纯水（UP水）中5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>根据所用特定抗体的制造商指南配制抗原修复缓冲液。 
		注意：0.2 M 柠檬酸盐缓冲液，pH 6，或 tris(hydroxymethyl)氨基甲烷（Tris）-乙二胺四乙酸（EDTA）0.1 M，pH 9，分别为酸性和碱性条件下常用的缓冲液。柠檬酸一水合物和Tris具有刺激性。所有储备液均应在通风橱中配制。避免接触皮肤和眼睛。</li>
		<li>将放置载玻片的支架浸入抗原修复缓冲液中，并进行微波处理（参见 材料表以最大功率（800 W）处理 20 分钟。 
		注意：整个过程中需保持载玻片完全浸没在缓冲液中。为避免缓冲液体积过度减少，请在所用容器上方加盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多重免疫荧光（mIF） 
	注：此过程需要1–2天。
	<ol>
		<li>用洁净容器加入250 mL超纯水，将载玻片架完全浸入水中2分钟（重复一次）。随后将每张载玻片装入载玻片盖板中（参见 材料表).
		<ol>
			<li>将载玻片装配到盖板上时，准备一个盛水的玻璃槽。将盖板和载玻片均浸入水中，并使组织切片面朝向盖板。</li>
			<li>将载玻片底边置于盖板底部的凸起之上，最后对齐载玻片与盖板，使水充满两者之间的间隙且无气泡残留。手持盖板与载玻片，将其放入盖板架中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）填充盖板，等待缓冲液在重力作用下流过载玻片以进行洗涤（2次）。用移液器加入110 μL封闭缓冲液（参见 材料表将每块盖玻片放入孵育10分钟。</li>
		<li>根据制造商的建议，用 PBS 或封闭缓冲液配制所需浓度的一抗。每张切片加入 110 μL 一抗，孵育 30 分钟。按照 6.3.2 步骤，用 5 mL PBS 洗涤切片 2 次。</li>
		<li>将切片与110 μL辣根过氧化物酶聚合物在室温下孵育30分钟。按照6.3.2步骤，用5 mL PBS洗涤切片2次。</li>
		<li>在扩增稀释液中按1:100（v/v）稀释荧光染料，将切片与荧光染料（每张切片110 μL）孵育10分钟。按照6.3.2节所述，用5 mL PBS洗涤切片2次。 
		注意：使用荧光染料780时，请遵循制造商的使用说明。若将切片置于PBS最终洗涤液中，并于4 °C过夜保存，则实验可在此处暂停。</li>
		<li>取下盖板上的载玻片，返回抗原修复步骤，开始使用另一种抗体进行染色。重复染色步骤，直至完成所有待检测抗体的染色。</li>
		<li>按照第6.3.5步对最后一个使用的荧光染料进行操作，将切片保留在载玻片上，用超纯水配制6 μM的4’-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）双乳酸盐溶液，每张切片加入110 μL，避光孵育5 min进行复染。用超纯水洗涤切片（2次），通过吸干切片边缘去除多余水分。使用封片剂将盖玻片封固于切片上，避光室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 扫描
注意：切片扫描使用多光谱自动成像系统进行（参见材料表）。
<ol>
	<li>将切片组装到载片架中，并按所需顺序装入扫描仪。 
	注意：建议包含一个对照切片，在免疫组织化学染色过程中不使用任何荧光染料或 DAPI。该切片将用作组织自身荧光（自发荧光，AF）的对照。</li>
	<li>启动切片扫描软件后，从首页选择编辑方案。创建一个新方案，填写名称、成像模式、要执行的多光谱扫描类型（4–7 个通道）以及研究项目（目录）。 
	注意：如需修改分析波段的默认设置，可使用选择扫描波段功能来选中或取消选中所需的滤光片。</li>
	<li>继续进行扫描曝光和加载载片架操作，最后为方案设置选择相应的载片架。点击获取概览图像以检测切片上的组织。在载片架上选择一个切片，并使用红色光标选择组织的特定区域，使其在屏幕左侧窗口中显示实时图像。</li>
	<li>选择DAPI 滤光片，点击自动对焦或手动调节载物台高度滑块，以聚焦目标区域。点击自动曝光，使系统为该滤光片/波段找到最佳曝光参数。 
	注意：每个滤光片的曝光时间初始设定为 12 ms。在系统自动曝光后，可进一步优化曝光时间。也可通过在高亮单元格中手动输入数值来覆盖自动曝光值。</li>
	<li>对方案中所有滤光片重复上述步骤。如有必要，更换位置和/或切片，以找到设置曝光的最佳信号。 
	注意：如果在实时视图中组织区域呈现红色，则表示当前分析滤光片的荧光信号已饱和，必须重新执行自动曝光。</li>
	<li>确定曝光参数后，点击返回按钮并保存方案。从软件首页（参见材料表）选择扫描切片。</li>
	<li>将所有待扫描的载片架堆叠放入切片载架存放舱，并记录切片顺序，以便在系统中分配其编号。 
	注意：在软件界面上，每个载片架对应一个包含 4 张切片的插槽。</li>
	<li>若要为多个切片配置相同参数，请点击配置任务，并选择一个或多个插槽，勾选选项对相同切片使用相同规则。当编辑切片界面打开后，配置任务、研究项目和方案，然后点击确定。</li>
	<li>通过点击插槽图标为每张切片标注标签，并在切片编号单元格中输入名称。点击扫描以开始扫描。 
	注意：当插槽图标变为蓝色且切片旁出现蓝色箭头时，表示载片架已具备所有规则，可进行扫描。可通过点击保存设置按钮，保存切片编号、研究项目、方案和任务信息。</li>
</ol>
8. 分析
注意：以下方案说明了表型分析的方法。
<ol>
	<li>图像准备
	<ol>
		<li>为准备图像进行分析，请打开查看软件（参见材料表），并选择加载切片。在屏幕右侧选择训练项目所需的扫描图像。</li>
		<li>对于每个扫描图像，点击标记，并在选择用途：&#160;框中选择项目。在图像区域中定义一个尺寸为 1 × 1 的标记，稍后将用作训练分析的模板。注意，此标记将以红色方框标示。 
		注：用于项目的标记注释数量无固定要求。建议为自发荧光扫描图像生成一个标记，并额外添加几个能代表组织内信号分布的标记。</li>
		<li>最后，打开实验中的所有扫描图像。对每张图像，点击标记，此次在选择用途：&#160;框中选择批量选项。放置一个包围每个外植体的标记。 
		注：此次标记将以绿色方框标示，并在启动批量分析时被调用。请根据需要选择合适的标记尺寸（1 × 1、2 × 2、3 × 3），并避免标记重叠，否则导出文件中将产生重复数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>训练分析</li>
	<li>启动分析软件（参见材料表），创建一个新项目：选择 文件 | 新建 | 项目。</li>
	<li>在项目名称框中输入名称，并配置项目类型。 
	注：本实验采用以下设置：可训练的组织分割；自适应细胞分割；表型分析。</li>
	<li>加载包含训练标记的扫描图像：文件 | 打开 | 图像。在单图模式视图中浏览图像，选择具有自发荧光的扫描图像。</li>
	<li>点击自发荧光（AF）按钮，使用自发荧光选取工具在未染色的组织区域上绘制。点击准备图像，使软件从所有用于训练的图像中减去自发荧光强度。</li>
	<li>点击编辑标记与颜色按钮，在对应荧光染料的框中输入标记名称。点击屏幕顶部的组织分割步骤，打开组织分割训练窗口。</li>
	<li>在组织类别窗口中，输入要将图像分割成的组织类别名称（例如：肿瘤、间质、背景、坏死）。</li>
	<li>在组织分割训练窗口中，点击绘制按钮，在细胞群周围绘制区域以定义感兴趣的组织类别。例如，为定义肿瘤区域，可在一群肿瘤细胞周围绘制区域。切换至下一类别并重复绘制过程。 
	注：建议在大多数用于训练的图像中绘制区域。也可通过调整模式尺度和分割分辨率来优化训练，具体细节请参阅用户手册。</li>
	<li>完成训练区域定义后，继续执行训练组织分割器。 
	注：训练过程中，软件将显示组织分割的准确率百分比。为获得最佳结果，建议组织分割准确率至少达到90%。当分割器结果稳定后，点击完成按钮。</li>
	<li>要查看所有图像上的组织类别掩膜，请点击全部分割按钮。</li>
	<li>在验证组织分割质量后，对分类错误的区域重新绘制训练区域，并重新训练组织分割器，直至达到满意效果。</li>
	<li>点击窗口顶部步骤栏中的细胞分割步骤，继续分析。</li>
	<li>选择要分割的细胞区室：细胞核、细胞质和/或细胞膜。 
	注：由于自适应细胞分割仅能检测具有核信号的细胞，因此请勿取消选择细胞核。尽管也可分割细胞质和/或细胞膜，但建议优先选择信号最强、最丰富的核组分（例如 DAPI）。</li>
	<li>使用典型强度滑块配置核组分，以调整用于检测核像素的阈值。注意观察打开的预览窗口，其会随着阈值调整提供实时反馈。 
	注：该阈值为自适应，相对于周围背景进行测量。若检测到过多背景信号，应提高该值；若微弱的细胞核未被检测到，则应降低该值。使用显示/隐藏区域按钮可切换分割掩膜的显示，检查核像素是否被正确识别。</li>
	<li>为分割成簇的核像素，请使用核组分分割面板。选择最能描述细胞核染色质量的按钮，然后使用滑块调整分割灵敏度，注意较低的值会导致更多分割。</li>
	<li>点击全部分割按钮以对所有图像进行分割。若结果不准确，请修改设置并重新训练软件，直至获得满意的分割效果。</li>
	<li>进入分析的最后一步：表型分析。在表型面板中，添加要检测的表型列表，并在相应的文本框中输入名称。点击编辑表型按钮，选择特定细胞以弹出下拉菜单，并选择对应的表型。 
	注：每种表型至少需要五个细胞用于训练分类器。关闭细胞核的可视化可更清晰地观察需分配的细胞表型。</li>
	<li>完成训练选择后，点击训练分类器按钮。 
	注：软件将对图像中的每个细胞进行分类，若出现分类错误，可编辑细胞表型并重复训练分类器。在进行批量分析前请保存项目，并点击屏幕顶部工具栏中的导出。</li>
	<li>在左侧菜单中选择批量分析选项卡，在批量算法或项目框中加载项目。</li>
	<li>点击导出选项，为每张图像创建独立目录，并使用浏览按钮选择数据导出位置。勾选图像和表格中的所有选项以进行导出。</li>
	<li>在屏幕右侧点击添加切片，加载所有包含先前准备的批量标记的图像（步骤 7.3）。点击运行按钮以启动批量分析，逐个处理每个标记并导出相应数据。</li>
</ol>

无任何利益冲突需要披露

本文描述了PDEs的生成、药物处理和分析方法，并强调了该平台作为临床前模型系统的优势。对新鲜切除的肿瘤进行离体&#160;培养，无需破坏其结构，可保留肿瘤的组织架构13,24，从而维持肿瘤微环境（TME）中细胞组分的空间相互作用以及瘤内异质性。本方法展示了如何利用肿瘤特异性标志物，区分肿瘤组织区域与间质区域，进而分别评估这些区域对药物的反应（图3）。此外，还可同时分析多种生物标志物，以评估免疫细胞在肿瘤微环境内的靶向迁移等效应（图4）。
先前的一项研究报道了该PDE平台在非小细胞肺癌（NSCLC）PDE中用于标准护理化疗药物顺铂的分层应用，表明可以将化疗耐药与化疗敏感的群体区分开来24。这些与PDE相关的发现与患者的临床反应相一致。通过采用本文所述的方法，可以对其他肿瘤类型以及不同类型的药物（无论是化...

开发有效且安全的抗癌药物需要合适的临床前模型，这些模型还应能够揭示作用机制，从而有助于识别预测性和药效动力学生物标志物。已知肿瘤间和肿瘤内异质性1,2,3,4,5以及肿瘤微环境（TME）6,7,8,9,10,11,12会影响抗癌药物的反应，而许多现有的临床前癌症模型（如细胞系、类器官和小鼠模型）无法充分涵盖这些关键特征。一种&#34;理想&#34;的模型应能够重现肿瘤内恶性细胞与非恶性细胞之间复杂的空间相互作用，并反映肿瘤内部的区域差异。本文重点介绍PDEs作为一种新兴平台，能够满足其中许多要求13。
人类PDE（也称为组织培养）的首次应用可追溯到20世纪80年代末，当时Hoffman等人制备了新鲜切除的人类肿瘤组织切片，并将其在胶原基质中进行培养14,15。该方法建立了一种三维培养系统，能够保持组织结构，确保肿瘤微环境（TME）中的基质成分及细胞间相互作用得以维持。Hoffman等人16在不破坏原始肿瘤结构的前提下，开创了一种转化医学研究的新途径。自此以后，许多研究团队不断优化不同的组织外植培养方法，旨在保持组织完整性并获得准确的药物反应数据17,18,19,20,21,22,23,24，尽管不同实验方案之间存在一些差异。Butler等人将外植组织培养在明胶海绵中，以促进营养物质和药物在样本中的扩散20,21,25；而Majumder等人则通过将外植组织培养在由肿瘤和基质蛋白组成的基质上，并添加来自同一患者的自体血清，构建了一个肿瘤生态系统22,23。
最近，我们课题组建立了一种方案，通过将肿瘤组织切割成2 - 3 mm3大小的碎片，制备出组织块，随后将其不添加其他成分直接置于培养系统气液界面的可渗透膜上24。综上所述，&#160;大量研究已证明，PDE技术能够实现对完整、存活的人类肿瘤组织碎片的培养，且这些组织碎片可保留原始肿瘤的空间结构和区域异质性。在早期实验中，通常在药物处理后将组织块或组织培养物进行匀浆，随后对匀浆样品应用多种活力检测方法，例如组织培养药物反应检测20,21、MTT（3-(6)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）检测、乳酸脱氢酶检测或基于刃天青的检测26,27,28。近年来终点分析技术尤其是数字病理学的进步，已显著拓展了可用于组织块的终点检测和分析方法29,30。为了应用这些新技术，不再采用匀浆处理，而是将组织块用福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE），然后利用免疫染色技术进行分析，从而实现空间层面的分子谱型分析。该方法已在非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌、结直肠癌和间皮瘤的组织块研究中得到应用，通过针对增殖标志物Ki67和凋亡标志物裂解型多聚ADP核糖聚合酶（cPARP）的免疫组织化学染色，监测细胞增殖和细胞死亡的变化情况24,31,32,33,34。
多重免疫荧光技术特别适用于对离体组织样本在实验终点进行药物反应的空间分析35例如，可以在药物处理后测量肿瘤微环境中特定类型免疫细胞（如巨噬细胞或T细胞）的重定位和空间分布13,36,37,38，并研究治疗剂是否能够促进从 &#34;冷肿瘤&#34; 到 &#34;热肿瘤&#34;39近年来，该研究团队致力于从不同肿瘤类型（非小细胞肺癌、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤）中分离患者来源的类器官（PDEs），并测试多种抗癌药物，包括化疗药物、小分子抑制剂以及免疫检查点抑制剂（ICIs）。终点分析方法已优化，纳入了多重免疫荧光技术，以实现对细胞活性相关生物标志物及肿瘤微环境（TME）中不同组分生物标志物的空间分布特征分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;乙酸&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>染色试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体稀释液/封闭液，1x&lt;/strong&gt;</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARD1001EA</td><td>抗体稀释/封闭缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Barnstead NANOpure Diamond&lt;/strong&gt;</td><td>Barnstead</td><td></td><td>超纯水（UP）H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O制备仪</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;柠檬酸一水合物&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7129</td><td>柠檬酸缓冲液用试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Costar 多孔细胞培养板&lt;/strong&gt;</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td>6 孔板</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DAPI 二盐酸盐&lt;/strong&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;100 x 17 mm 培养皿，Nunclon Delta&lt;/strong&gt;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td>组织培养用 100 mm 直径培养皿</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DMEM (1x) 改良杜尔贝科培养基 + 4.5 g/L D-葡萄糖 + 110 mg/mL 丙酮酸钠&lt;/strong&gt;</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10569-010</td><td>组织培养基（500 mL）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DPX 封片剂&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>360294H</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DPX 封片剂&lt;/strong&gt;</td><td>Merck</td><td>6522</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;乙二胺四乙酸（EDTA）&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>TE 缓冲液用试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;伊红&lt;/strong&gt;</td><td>CellPath</td><td>RBC-0100-00A</td><td>染色试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;胎牛血清&lt;/strong&gt;</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>用于组织培养基</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;37% 甲醛&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher (Acros)</td><td>119690010</td><td>10% 福尔马林</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;iGenix 微波炉 IG2095&lt;/strong&gt;</td><td>iGenix</td><td>IG2095</td><td>用于抗原修复的微波炉</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;工业变性酒精（IMS）&lt;/strong&gt;</td><td>Genta Medical</td><td>199050</td><td>99% 工业变性酒精（IDA）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;InForm 高级图像分析软件&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>InForm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Leica ASP3000 组织处理仪&lt;/strong&gt;</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>全自动真空组织处理仪</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Leica Arcadia H 和 C&lt;/strong&gt;</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>包埋蜡浴</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Leica RM2125RT&lt;/strong&gt;</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>轮转式切片机</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Leica ST4040 线性染色机&lt;/strong&gt;</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>苏木精-伊红（H&amp;E）染色机</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mayer 苏木精&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma</td><td>GHS132-1L</td><td>染色试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Millicell 细胞培养插件，30 mm，亲水性 PTFE，0.4 &amp;micro;m&lt;/strong&gt;</td><td>Merck Milipore</td><td>PICMORG50</td><td>类器官培养插件圆盘</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Novolink 聚合物检测系统&lt;/strong&gt;</td><td>Leica Biosystems</td><td>RE7150-K</td><td>DAB 染色试剂盒</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;OPAL 480&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1500001KT</td><td>含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;OPAL 520&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1487001KT</td><td>含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;OPAL 570&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1488001KT</td><td>含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;OPAL 620&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1495001KT</td><td>含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;OPAL 650&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1496001KT</td><td>含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;OPAL 690&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1497001KT</td><td>含二甲基亚砜（DMSO）稀释液的荧光染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;OPAL 780 / OPAL TSA-DIG 试剂&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1501001KT</td><td>含二甲基亚砜（DMSO）稀释液和 TSA-DIG 试剂的荧光染料</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Opal Polymer HRP Ms Plus Rb，1x&lt;/strong&gt;</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARH1001EA</td><td>HRP 聚合物</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;青霉素/链霉素溶液&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11548876</td><td>用于组织培养基</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PhenoChart 全片上下文查看器&lt;/strong&gt;</td><td>Akoya Biosciences</td><td>PhenoChart</td><td>扫描图像查看软件</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;磷酸盐缓冲液片剂&lt;/strong&gt;</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>PBS</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1x Plus 放大稀释液&lt;/strong&gt;</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1498</td><td>荧光染料稀释液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂&lt;/strong&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;载玻片架&lt;/strong&gt;</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>用于将载玻片装入 Vectra Polaris 扫描仪的载玻片架中</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;氯化钠&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/63</td><td>10% 福尔马林</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;氢氧化钠颗粒&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/4920/53</td><td>柠檬酸缓冲液用试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tenatex 加强型蜡 - 粉红色（500 g）&lt;/strong&gt;</td><td>KEMDENT</td><td>1-601</td><td>牙科蜡表面</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Thermo Scientific Shandon Sequenza 免疫染色中心载玻片架&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10098889</td><td>载玻片及夹具支架</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Thermo Scientific Shandon 塑料盖板&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11927774</td><td>载玻片夹</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>TE 缓冲液用试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;VectaShield&lt;/strong&gt;</td><td>Vecta Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Vectra Polaris 载玻片扫描仪&lt;/strong&gt;</td><td>Perkin Elmer</td><td>Vectra Polaris</td><td>载玻片扫描仪</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二甲苯&lt;/strong&gt;</td><td>Genta Medical</td><td>XYL050</td><td>脱蜡剂</td></tr></tbody></table>

源自患者的肿瘤外植体作为预测患者药物耐药性的“活体”临床前平台

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

要理解药物耐药性并开发使高度耐药癌症重新敏感的新策略，依赖于能够准确预测患者反应的合适临床前模型。现有临床前模型的一个缺点是无法在情境上保留人类肿瘤微环境（TME），也无法准确反映肿瘤内的异质性，从而限制了数据的临床转化。相比之下，患者来源的肿瘤组织外植体（PDE）平台通过培养人类肿瘤的活体组织碎片，能够在三维（3D）环境中检测药物反应，尽可能真实地模拟原始肿瘤的病理特征和组织结构。先前关于PDE的研究已证实该平台能够区分化疗敏感与耐药的肿瘤，并且这种区分可预测患者对相同化疗方案的临床反应。同时，PDE还提供了研究预测药物反应的分子、遗传和组织学特征的机会，从而有助于识别用于患者分层的生物标志物，以及开发使耐药肿瘤重新敏感的新型干预策略。本文详细报告了从患者样本采集到终点分析的PDE技术方法，全面描述了外植体的制备与培养流程，并在适当时强调了针对特定肿瘤的定制化培养条件。在终点分析方面，重点介绍了多重免疫荧光与多光谱成像技术，用于在肿瘤区域和间质区域中对关键生物标志物进行空间分布分析。通过整合这些方法，可以获得与多种临床病理参数相关联的定性和定量药物反应数据，进而有望用于生物标志物的识别。

对多重免疫荧光染色的组织切片进行多光谱成像，可实现对移植物肿瘤微环境（TME）中单个细胞群体的鉴定与表型分析，以及肿瘤和间质成分的识别（图2）。多光谱成像在分析具有高本底自发荧光的组织（如富含胶原的组织）时尤为有用，因为它能够将自发荧光信号与其他信号分离，并在后续分析中将其排除。随后通过计算机进行的组织与细胞分割，可实现对药物反应的定量分析，输出参数多样，包括但不限于细胞总数（例如，阳性百分比）、信号强度、细胞大小、组织面积以及单个细胞的空间位置。
因此，组织和细胞分割对于药物治疗效果的定量分析以及肿瘤特异性和基质特异性反应的识别极为有用。例如，同时对Ki67和cPARP以及肿瘤标志物进行染色，可分别对离体组织中外植体的增殖和细胞死亡水平进行定量（图3）。在本示例中，针对抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）免疫检查点抑制剂（ICI）纳武利尤单抗处理下的PDE，分别对基质区和肿瘤区的Ki67和cPARP水平进行了定量。此外，从染色切片中提取空间信息的能力，使得可以计算...

本文介绍了一种用于生成、药物处理及分析患者来源的离体组织的方法，以在活体、与患者相关且具有临床前意义的模型系统中评估肿瘤对药物的反应。

对药物耐药性的理解以及开发新型策略以提高高度耐药性癌症的敏感性，依赖于合适的……的可获得性

患者来源的组织外植体是一种短期方法，可提供即时的药物反应数据，准确预测患者治疗效果。PD 平台能够在三维环境中检测药物反应，尽可能地模拟区域肿瘤的病理特征和组织结构。外植体有望为药物的代谢过程和作用机制提供新的见解，并有助于发现新的药效动力学生物标志物。实验开始前，使用70%工业甲基化酒精溶液清洁所有手术器械。将25毫升预冷的新鲜培养基加入直径10厘米的培养皿中，并置于冰上。用镊子将样本转移至牙科蜡表面，然后使用两把皮肤移植刀将组织切成约2至3立方毫米大小的碎片。将外植体转移至一个10厘米的培养皿中，并取六到九块组织放入含有1毫升10%未缓冲福尔马林溶液的离心管中，在室温下孵育24小时。在六孔板中，根据需要向每孔加入1.5毫升新鲜培养基，并将一个组织培养插入式培养皿放入每一孔中，使其漂浮于培养基表面。将6至9个外植体放置于每个插入盘上，并在5%二氧化碳培养箱中孵育16小时，以促进恢复。次日，向新培养板的每孔中加入新鲜培养基和药物，同时设置一孔作为溶剂对照。当所有药物处理溶液制备完成后，使用镊子将每个插入物转移至新的六孔板的各个孔中，在二氧化碳培养箱中孵育 24 至 48 小时。药物处理结束后，将组织块转移至含有 10% 甲醛的新六孔板中，并在每个组织块上方加入数滴 10% 甲醛，确保固定液完全覆盖组织，于室温下固定孵育 24 小时。第二天，将适量的小型组织学海绵浸泡在70%工业甲基化溶液中，并将海绵放入组织学盒中。当所有海绵放置完毕后，将同一药物处理条件下的所有外植体转移至同一块海绵上，使每个外植体的药物处理面接触插入的海绵圆片。在每个外植体上方再放置一块预先浸泡过的海绵，并合上盒盖以固定盒内的外植体。随后将盒体浸入70%工业甲基化溶液中，再进行组织学处理。扫描完成后，进行训练分析，将包含印章图像的扫描文件导入相应的分析软件中用于训练。在单模式视图中，浏览图像并选择要分析的扫描图像以及具有内在荧光的扫描图像。当具有内在荧光的扫描图像显示在单个视图中时，点击自发荧光选择工具，在未染色组织区域绘制一个区段。点击编辑标记和颜色，并在每个荧光染料对应的框中输入标记名称。单击“准备图像”以允许软件从所有已上传的图像中减去自发荧光的强度。单击屏幕顶部的“分割组织”步骤，打开组织分割训练窗口。在组织类别面板中，输入要分割的每个组织类别的名称。单击“绘制”，在感兴趣的组织类别中围绕细胞群绘制区域。然后切换到下一个组织类别并绘制新区域。当所有训练区域都定义完毕后，使用“训练组织分割器”，并等待训练准确率稳定。可能接近100%的值。单击“分割全部”以分割组织。在确认组织分割质量后，单击“细胞分割”并选择要分割的细胞组分。配置核组分时，使用典型强度滑块调整用于检测核像素的阈值。预览窗口可提供实时反馈。若要分割细胞核像素的聚集体，在细胞核组分分割面板中，选择最能描述细胞核染色质量的按钮，并使用滑动条调整分割灵敏度。然后点击“分割全部”以对所有图像进行分割。当所有图像完成分割后，在表型面板中添加待检测的表型列表，并在相应的文本框中输入表型名称。单击“编辑表型”以选择特定细胞，并在下拉菜单中选择对应的表型。完成训练选择后，单击“训练分类器”以评估每种表型的结果。继续进行所有表型分析，保存项目后点击导出。选择批量分析选项卡，并在批量算法或项目框中加载该项目。为导出图像和表格，在导出选项中勾选所有复选框，点击添加幻灯片，并加载所有包含先前准备批次印章的图像。然后点击“运行”，以开始对一个样本进行批量分析，并在数据采集完成后导出相应的结果。对经细胞活性标志物染色的非小细胞肺癌（NSCLC）离体组织进行多光谱成像，可实现对离体肿瘤微环境中单个细胞亚群的鉴定与表型分析，以及肿瘤组分和间质组分的识别。如示例所示，对细胞活性标志物染色的多光谱图像进行组织与细胞分割，可用于定量分析经感兴趣药物处理的患者来源离体组织中的细胞死亡与增殖情况。例如，在本分析中，与经对照处理的肿瘤样本相比，在经纳武利尤单抗（Nivolumab）处理的肿瘤组织样本中检测到更多的死亡细胞。此外，如图所示，通过分析染色切片获得空间信息，可计算细胞间的距离。外植体还可用于广泛的原位分析或质谱流式细胞术，从而在保持样本三维结构的同时，实现数百种生物标志物在亚细胞分辨率下的同步检测。PDs 可用于预测免疫治疗的疗效。例如，有可能区分对免疫检查点抑制剂敏感或耐药的病例，并研究介导这种差异的潜在机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

患者源性肿瘤外植体作为预测患者耐药性的"实时"临床前平台

本文建立了一种利用脑肿瘤手术标本进行药物疗效检测的方法，称为“肿瘤外植法”。通过该方法，我们可在不破坏实体瘤微环境的前提下评估药物疗效。为验证该方法的可靠性，我们展示了使用当前一线化疗药物替莫唑胺处理胶质瘤标本所获得的代表性数据。...

利用手术标本肿瘤外植体进行新型抗癌药物研发的方法

在过去的几十年中，已建立的癌细胞系和异种移植模型一直是癌症研究的主要手段。然而，最近的证据表明，治疗反应在很大程度上受到肿瘤细胞微环境的影响。因此，我们开发了一种用于药物开发的原发性肿瘤标本的ex...

离体 原发肿瘤和/或相关转移灶的治疗反应：用于治疗药物的临床前与临床开发

利用患者来源的肿瘤建立皮下临床前模型，是研究新型疗法疗效、预测性生物标志物发现以及耐药通路的极佳方法。在药物研发过程中，该模型对于确定多种新型抗癌疗法在进入临床研究前的命运至关重要。...

用于研究新型抗癌疗法的临床前患者来源肿瘤异种移植模型的建立与维护

为了实现对播散性人结直肠癌（CRC）细胞在组织中定植的高灵敏度检测，本文展示了一种在将PDX来源的CRC类器官细胞注射到受体小鼠之前，高效转导绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒颗粒的方案，并通过立体荧光显微镜进行观察。...

高灵敏度检测由患者来源结肠肿瘤类器官经GFP慢病毒转导培养后产生的微转移灶

与传统的基于塑料培养皿的组织培养检测方法相比，患者来源的异种移植（PDX）模型能更可靠地再现黑色素瘤的分子和生物学特征，并能更准确地预测治疗反应。本文介绍了我们建立新型 PDX 模型以及对已有 PDX...

一种黑色素瘤患者来源的异种移植模型

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

我们介绍一种用于测量类器官肿瘤组织切片中实时药物反应的方案。此处概述的实验策略提供了一个平台，可在体外条件下对来自临床或小鼠肿瘤的组织切片进行中高通量药物筛选。...

在原代肿瘤组织切片中实时测量药物反应

源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。...

原位移植乳腺肿瘤作为乳腺癌的临床前模型

本文描述了一种利用患者来源的异种移植瘤（PDX）建立类器官的方法，用于体外筛选，从而获得匹配的体内/体外模型对。将PDX肿瘤通过机械或酶消化方法处理成小块，随后采用Clevers方法培养肿瘤类器官，并对这些类器官进行传代、冻存，以及与原始PDX进行比对表征。...

创建匹配的PDX与PDX来源类器官体内/体外患者来源模型对用于癌症药理学研究

高度准确的 体外 高通量检测系统被开发用于评估基于患者来源肿瘤类器官（PDOs）的抗癌药物，这类类器官类似于癌组织，但不适合用于 体外...

高通量 体外 使用患者来源肿瘤类器官的检测方法

本方案描述了在非小细胞肺癌患者来源类器官模型中，对靶向信号通路抑制剂的药物敏感性进行标准化评估的方法。...

表征EGFR突变型非小细胞肺癌患者来源类器官对靶向治疗的敏感性

了解患者源性肿瘤外植体作为临床前药物测试平台的方法，用于评估肿瘤药物反应并发现预测性生物标志物。该技术保留三维肿瘤微环境结构，支持精准医学和个性化癌症治疗研究。

源自患者的肿瘤外植体作为预测患者药物耐药性的“活体”临床前平台

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