Name: 通过透明硅胶窗进行纵向活体成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学习使用透明硅胶窗进行纵向活体成像技术，该方法成本低廉且能减少手术炎症，适用于肝脏、胰腺和乳腺等器官的癌细胞与免疫细胞动态观察，为发育生物学和神经科学研究提供可靠的长期成像方案。

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感谢 Rob Eifert 在设计和优化激光切割不锈钢网格方面提供的帮助。本工作由冷泉港实验室癌症中心（P30-CA045508）以及美国国立卫生研究院（NIH）对 M.E. 的资助（1R01CA2374135 和 5P01CA013106-49）、冷泉港实验室（CSHL）与北威尔健康（Northwell Health）、Thompson 家族基金会、Swim Across America 组织，以及西蒙斯基金会（Simons Foundation）对冷泉港实验室的资助支持。M.S. 受美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所医学科学家培训项目培训奖（T32-GM008444）以及 NIH 国家癌症研究所奖项 1F30CA253993-01 的支持。L.M. 获得詹姆斯·S·麦克唐纳基金会博士后奖学金的支持。J.M.A. 是癌症研究所/欧文顿博士后奖学金（CRI 奖项 #3435）的获得者。D.A.T. 受 Lustgarten 基金会胰腺癌研究专用实验室及 Thompson 家族基金会的支持。示意图使用 Biorender.com 制作。

所述所有操作均遵循冷泉港实验室外科指南进行，并已获得冷泉港实验室机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 铸造硅胶窗口
<ol>
	<li>按10:1（v/v）的体积比混合基础弹性体和固化剂，制备硅胶聚合物（PDMS）。</li>
	<li>在无菌、光滑的表面上滴加少量PDMS，形成窗口，并通过调节体积与面积的比例来控制所需厚度。 
	注意：在24孔板盖上直径为22 mm的圆形区域使用200 mg聚合物溶液，可在窗口强度与光学透明性之间取得良好平衡。</li>
	<li>可选步骤：如需对同一组织区域进行重复成像以定位，可在PDMS置于目标成型表面后，轻轻将不锈钢网格压入硅胶中作为标记。</li>
	<li>为去除气泡，将涂覆后的表面置于真空干燥器中脱气45分钟。</li>
	<li>将硅胶窗口置于80 °C烘箱中固化45分钟。</li>
	<li>用镊子沿模具边缘划痕，并轻轻将固化的窗口从成型表面剥离。</li>
	<li>手术前，通过高压灭菌法对窗口进行灭菌处理。</li>
</ol>
2. 准备小鼠以植入硅胶窗
<ol>
	<li>在诱导室中使用 4% (v/v) 异氟烷对小鼠进行麻醉。将小鼠转移至手术台上的保温垫上，将其口鼻部置于麻醉面罩中，并将异氟烷浓度降至 2%，在整个手术过程中维持麻醉。</li>
	<li>通过轻捏后肢脚趾检查麻醉深度。在小鼠无活动且无脚趾夹捏反射反应前，不得继续操作。</li>
	<li>在眼睛表面涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥及损伤。</li>
	<li>皮下注射预先镇痛药物（布托啡诺 0.05 mg/kg）。</li>
	<li>剃除手术区域的毛发，并使用脱毛膏彻底清除残留毛发。</li>
	<li>依次使用聚维酮碘溶液（10% v/v）和乙醇（70% v/v）各消毒 3 次，以预防手术部位感染。</li>
</ol>
3. 在肝脏中植入腹侧成像窗；可适用于其他腹腔器官（图1）
<ol>
	<li>将小鼠置于仰卧位。</li>
	<li>从剑突下方3 mm处开始，使用无菌剪刀和镊子做一个10 mm的切口。</li>
	<li>移除1–1.5 cm2 沿中线的皮肤切口。</li>
	<li>使用另一把无菌剪刀和镊子，取下一块略小于皮肤切口的腹膜组织。</li>
	<li>可选：为了观察更大范围的肝脏，可使用无菌生理盐水浸湿的无菌棉签将肝脏从膈肌处向下推，以暴露连接肝脏与膈肌的镰状韧带。切断该韧带时需注意避免损伤下腔静脉。</li>
	<li>用31 G注射器吸取手术粘合剂，在拟成像区域周围肝脏表面涂抹少量粘合剂。该粘合剂可形成环形密封，中心区域保持开放以供成像。 
	注意：将粘合剂限制为围绕成像区域呈圆形分布的小液滴。与粘合剂直接接触的组织无法进行成像。涂抹粘合剂前无需干燥组织。 
	注意：任何以氰基丙烯酸酯为基础的粘合剂均可成功用于本操作。手术用粘合剂可确保无菌性。对于终末性操作，通用型强力胶亦可取得良好效果。</li>
	<li>使用镊子放置窗口，并将其牢固按压在肝脏上，直至粘合剂干燥（约2分钟）。</li>
	<li>将窗缘折叠至腹膜下方。</li>
	<li>用注射器将少量外科粘合剂涂在目前位于腹膜下的窗缘处。用镊子按压腹膜，使其牢固地贴附于窗上。</li>
	<li>类似地，在推入之前，先在腹膜上涂抹少量外科粘合剂&#160;用镊子将皮肤向下压紧，固定于腹膜上。 
	注意：若操作正确，此时应可通过窗口观察到肝脏组织的圆形区域。</li>
	<li>在窗口边缘涂抹胶水，形成一圈凸起的边缘，以防止皮肤重新生长覆盖窗口。 
	警告：如果使用无菌外科技术进行操作，并在植入前对窗口进行灭菌，则用外科粘合剂封闭伤口足以避免感染。然而，若在手术植入过程中未遵循正确的无菌技术，或伤口封闭不严密，可能导致明显或亚临床感染，以及组织干燥。</li>
</ol>
4. 在肝脏中创建用于成像的侧窗；可同时经门静脉注射癌细胞（图2）
<ol>
	<li>将小鼠置于左侧卧位</li>
	<li>使用无菌剪刀和镊子在右侧肋弓下方3毫米处做一道10毫米的切口。</li>
	<li>移除1 cm2 皮肤切片</li>
	<li>使用另一把无菌剪刀和镊子，取下一块略小于皮肤切口的腹膜组织。</li>
	<li>用31 G注射器吸取手术粘合剂，取少量涂抹于肝脏表面待成像区域的周围边缘处。 
	注意：将粘合剂限制为在成像区域周围形成环形分布的小液滴。与粘合剂直接接触的组织无法进行成像。 
	注意：任何以氰基丙烯酸酯为基础的粘合剂均可成功用于本操作。手术用粘合剂可确保无菌性。对于终末性操作，通用型强力胶亦可取得良好效果。</li>
	<li>使用镊子放置窗口，并将其牢固按压在肝脏上，直至粘合剂干燥（约2分钟）。</li>
	<li>将窗缘折叠至腹膜下方。</li>
	<li>用注射器将少量外科粘合剂涂在目前位于腹膜下的窗缘处。用镊子按压腹膜，使其牢固地固定在窗上。</li>
	<li>类似地，在腹膜上涂抹少量外科粘合剂&#160;推动&#160;用镊子将皮肤向下压紧，固定于腹膜上。 
	注意：若操作正确，此时应可通过窗口观察到肝脏组织的圆形区域。</li>
	<li>在窗口边缘涂抹胶水，形成一圈凸起的边缘，以防止皮肤重新生长覆盖窗口。</li>
	<li>如果需要进行门静脉注射：
	<ol>
		<li>将小鼠置于仰卧位。</li>
		<li>从剑突开始向下在皮肤上做一个10 mm的切口。</li>
		<li>使用另一把无菌剪刀和镊子，在腹膜上做一个10 mm的切口。</li>
		<li>将两根棉签浸入无菌生理盐水中。</li>
		<li>用棉签轻轻将肠道移至用无菌生理盐水润湿的无菌纱布上，注意不要扭转或改变其原有方向。</li>
		<li>将肠道从腹腔中继续移开，直至在腹部右侧可见门静脉。</li>
		<li>在门静脉进入肝脏处远端5–7 mm的位置插入一根31–33 G针头，确保沿血管内走行，而非穿透血管。</li>
		<li>缓慢注射癌细胞（重悬于100 μL无菌PBS中）。 
		注意：本实验可使用小鼠胰腺癌细胞系（例如 KPC-BL/6-1199），在完全 DMEM 培养基中进行培养，接种密度为 1 × 10⁶5 100 μL 无菌 PBS 中的细胞注射</li>
		<li>为防止出血，拔出针头后，立即用一小块外科海绵在注射部位轻轻按压1–2分钟。</li>
		<li>压力释放后，观察穿刺部位1–2分钟，以确保止血。</li>
		<li>使用湿润的棉签，按照肠道的生理走向将其复位至腹腔内。</li>
		<li>使用无菌镊子将窗口立即插入小鼠腹腔左侧的腹膜下方。</li>
		<li>使用4-0丝线缝合，并用7 mm不锈钢伤口钉合器钉合中线切口。</li>
		<li>将小鼠置于左侧卧位</li>
		<li>使用无菌剪刀和镊子，在右侧肋弓下方3 mm处的皮肤上做一个10 mm的切口。</li>
		<li>移除1 cm2 切口周围的皮肤区域</li>
		<li>使用另一把无菌剪刀和镊子，取下一块略小于皮肤切口的腹膜组织。</li>
		<li>在按照步骤 4.8–4.10 进行粘合固定之前，先将窗口移至肝脏上方的预定位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 在胰腺中植入用于成像的窗口（图3）
<ol>
	<li>将小鼠置于右侧卧位。</li>
	<li>使用无菌剪刀和镊子，在左侧肋弓下方3 mm处的左 flank 区做一道10 mm的切口。</li>
	<li>围绕切口去除约1 cm2的皮肤组织。</li>
	<li>使用另一套无菌剪刀和镊子，去除一块略小于皮肤面积的腹膜组织。</li>
	<li>用浸有无菌生理盐水的无菌棉签轻轻牵拉脾脏，以暴露胰腺。随后用湿润的棉签调整胰腺位置，使更多胰腺表面通过切口可见。 
	注意：若实验设计需要，此时可将胰腺癌细胞原位注射至胰腺内。</li>
	<li>用31 G注射器吸取外科粘合剂，在成像区域边缘周围的胰腺表面涂抹少量粘合剂。 
	注意：粘合剂应仅限于在成像区域周围形成小液滴的环形分布。与粘合剂直接接触的组织将无法成像。</li>
	<li>用镊子将观察窗定位，并将其紧贴胰腺固定，直至粘合剂完全干燥（约2分钟）。</li>
	<li>将观察窗的边缘折叠至腹膜下方。</li>
	<li>用注射器在已位于腹膜下方的观察窗边缘处滴加少量外科粘合剂，再用镊子将腹膜向下压紧，使其牢固粘附于观察窗上。</li>
	<li>同理，在用镊子将皮肤压紧固定于腹膜之前，先在腹膜上滴加少量外科粘合剂。 
	注意：若操作正确，此时应可通过观察窗看到一圈清晰可见的胰腺组织区域。</li>
	<li>在观察窗边缘周围涂抹胶水，形成一圈凸起边缘，以防止皮肤组织再生覆盖观察窗。</li>
</ol>
6. 乳腺成像窗的植入（图4）
<ol>
	<li>将小鼠置于仰卧位。</li>
	<li>使用无菌剪刀和镊子，在一侧腹股沟乳头内侧做一道10 mm的切口。</li>
	<li>切除乳腺上方约0.5 cm2的皮肤区域。</li>
	<li>使用另一把无菌剪刀，通过在皮肤与乳腺组织之间轻轻撑开剪刀，仔细将乳腺从皮肤上分离，以破坏两者之间的粘连。 
	注意：为了便于对腹股沟乳腺区域进行成像，解剖时应注意保留乳腺上方但位于后肢近头侧的部分皮肤，以确保观察窗不会限制小鼠的活动能力。</li>
	<li>用31 G注射器吸取手术粘合剂，在待成像区域边缘周围的乳腺组织表面涂抹少量粘合剂。 
	警告：仅在成像区域周围以小液滴形式呈环形涂抹少量粘合剂。与粘合剂直接接触的组织将无法进行成像。</li>
	<li>用镊子将观察窗定位，并将其紧压在乳腺组织上，直至粘合剂完全干燥（约2分钟）。 
	注意：若操作正确，此时应可通过观察窗清晰看到乳腺组织的圆形区域。</li>
	<li>将观察窗的边缘折叠至皮肤下方。</li>
	<li>用注射器将少量手术粘合剂涂布于已位于皮下的观察窗边缘，再用镊子按压皮肤，使皮肤牢固粘附于观察窗上。</li>
	<li>在观察窗边缘周围涂抹粘合剂，形成一圈凸起的密封边缘，以防止皮肤组织重新生长覆盖观察窗。</li>
</ol>
7. 术后恢复
<ol>
	<li>将小鼠放入干净的恢复笼中，提供充足的筑巢材料，并确保笼子的一部分置于加热垫上。</li>
	<li>持续监测小鼠，直至其恢复意识并能自由活动。</li>
	<li>若需要，可在预先给予镇痛剂后 12 h 追加一次镇痛剂量。 
	注：通常无需额外镇痛，但如果小鼠出现痛苦迹象（如弓背、毛发凌乱或食欲减退），应咨询兽医。术后前 3 天应每天监测小鼠是否有感染或其他不良反应的迹象。少于 2% 的小鼠需要兽医干预或实施安乐死，通常原因是窗口部分脱落。需要注意的是，对于安装腹部肝脏成像窗口的雄性小鼠，个体间的争斗可能导致窗口脱落，因此应将小鼠单独饲养以避免此问题。</li>
</ol>
8. 通过窗口成像
<ol>
	<li>在诱导室中使用4%（v/v）异氟烷麻醉小鼠。</li>
	<li>在眼部涂抹眼用润滑剂，以防止眼睛干燥和避免损伤。</li>
	<li>将小鼠从诱导室转移至显微镜载物台。将小鼠置于麻醉面罩中，并将异氟烷浓度下调至约1–1.5%，以维持成像过程中的麻醉状态。</li>
	<li>将压力垫传感器置于小鼠下方以监测呼吸频率，并使用软质外科胶带将小鼠固定在载物台上。</li>
	<li>在整个成像过程中插入直肠温度计以监测体温。</li>
	<li>打开加热垫，密切监测小鼠，确保其体温不超过 37 °C。 &#160;</li>
	<li>使用软件监测小鼠的呼吸频率，理想频率约为每秒1次呼吸。根据需要调整麻醉深度。</li>
	<li>每次成像前，用蘸有70%乙醇（v/v）的棉签轻轻擦拭窗口，清除残留的浸镜介质和碎屑。</li>
	<li>使用水浸物镜时，将超声耦合剂涂抹于窗口，避免产生气泡。 
	注意：也可使用蒸馏水，但在成像过程中可能需要重新添加。</li>
	<li>为找到最佳成像深度，首先定位网格并将其调至焦点。</li>
	<li>通过将网格底部设为0来确定组织成像的大致深度。该信息对于在后续成像过程中定位相应的z平面至关重要。</li>
	<li>为了在多次成像过程中识别相同的位置，可利用网格上的方格作为参考点。成像时，记录网格的方向以及每次成像视野在网格中的位置（例如，2nd 从顶部起第4行th 左侧的方块。</li>
	<li>在连续的成像过程中，利用网格导航返回特定的网格区域——从而定位到相同的成像视野。</li>
	<li>每次成像结束后，用蘸有70%乙醇（v/v）的棉签轻轻擦拭窗口，以去除残留的浸没介质和碎屑。</li>
</ol>

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</ol>

M.E. 是 Insmed 公司关于 brensocatib 的研究咨询委员会成员；Vividion Therapeutics 公司科学咨询委员会成员；Protalix 公司顾问；并持有 Agios Pharmaceuticals 公司股份。D.A.T. 是 Mestag Therapeutics 公司的联合创始人，并在 Mestag Therapeutics、Leap Therapeutics、Surface Oncology 和 Cygnal Therapeutics 公司担任科学咨询委员会成员且持有股份。其他作者声明不存在竞争利益。

活体成像窗口是用于随时间推移以细胞分辨率直接观察生理和病理过程的重要工具。本文所述的在小鼠体内铸造并植入柔性硅胶成像窗口的新方法，克服了目前常用成像窗口存在的一些常见问题（如渗出、破裂以及对正常活动的干扰），提高了小鼠的安全性，并增强了该技术的可操作性。
目前最常用的成像窗由一个金属框架和固定在其上的玻璃盖玻片组成。使用这类典型成像窗的主要障碍在于，固定金属环需要繁琐的缝合操作，因而要求操作人员具备高级外科手术技能。此外，制造这些金属框架成本较高，且需要专用设备。PDMS 成像窗克服了上述两个问题。插入 PDMS 成像窗的操作无需缝合，显著降低了该技术的学习门槛。制作该成像窗的材料成本低廉，且易于采购。此外，该成像窗的形状以及手术操作均可根据需要进行调整，适用于对乳腺、肝脏、胰腺、脾脏和肠道等多种器官的成像。
尽管现有的活体成像窗口通常可支持数天的纵向成像，但一些常见问题限制了其应用&#160;长时间使用这些窗口。玻璃窗的重量和尺寸可能妨碍小鼠的自由活动，且渗出物可能在窗口处积聚。小鼠还可能损坏玻璃盖玻片，导致伤口和感染。相比...

活体显微成像（IVM）是一种对麻醉动物体内组织进行成像的技术，可在完整组织中以细胞分辨率揭示生理和病理过程的动态变化。该技术的应用范围广泛，尤其在癌症生物学领域发挥了重要作用，有助于阐明癌细胞如何侵袭组织并发生转移、如何与周围微环境相互作用，以及对药物的响应机制。1,2,3此外，IVM 已成为深入理解调控免疫反应的复杂机制的关键手段，所提供的见解可与 离体 分析方法（例如流式细胞术）。例如，活体成像实验已揭示了与细胞迁移和细胞间接触相关的免疫功能的详细信息&#160;并为量化损伤或感染后的时空动态提供了平台4,5,6,7许多此类过程也可通过组织学染色进行研究，但只有活体显微成像（IVM）能够追踪动态变化。事实上，组织学切片仅能提供特定时间点的组织静态图像，而活体成像则可在同一组织中随时间推移追踪细胞间和亚细胞水平的事件。特别是，荧光标记技术的进步以及分子报告系统的开发，使得分子事件能够与细胞行为（如增殖、死亡、运动性以及与其他细胞或细胞外基质的相互作用）相关联。大多数IVM技术基于荧光显微镜，但由于光散射的影响，对深层组织的成像仍具挑战性。因此，通常需要通过外科手术暴露目标组织，而该过程往往具有侵入性且为终末性操作。因此，根据器官部位的不同，组织可被连续成像数小时至40小时不等。8或者，通过手术植入永久性成像窗口，可对同一组织进行连续数天至数周的成像观察7,9.
开发新型成像窗口已被强调为一项技术需求，旨在进一步改进活体成像技术10。典型的活体成像窗口是由金属环构成，其中固定有玻璃盖玻片，并通过缝合线将其固定在皮肤上11。此类窗口常出现影响动物自由活动、渗出液积聚以及玻璃盖玻片破损等问题。此外，传统窗口需要专门制造，且手术操作可能需要较长时间的培训。为解决这些问题，研究人员采用了聚二甲基硅氧烷（PDMS）——一种硅基聚合物，此前已用于颅窗以实现脑部长期成像12——并将其改进用于腹部器官和乳腺组织的成像。本文详细介绍了基于PDMS的硅胶窗口的制备方法，包括如何围绕不锈钢网格浇铸窗口，以便在重复成像过程中精确定位同一组织区域。此外，还描述了一种简单、无需缝合的手术方法，用于将窗口植入腹部器官或乳腺上方。这种新方法克服了当前常用成像窗口的一些常见问题，提高了纵向活体成像技术的可及性。

<table><tbody><tr><td>3M Medipore 柔性布质外科胶带</td><td>3M</td><td>70200770819</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18&quot; RB-2</td><td>Ethicon&amp;nbsp;</td><td>N267H</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>22974</td><td></td></tr><tr><td>AEC 底物试剂盒，过氧化物酶（HRP）（3-氨基-9-乙基咔唑）</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>SK-4200</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>Molecular Imaging Products Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acq&lt;em&gt;knowledge&lt;/em&gt; 软件和传感器&amp;nbsp;</td><td>BIOPAC</td><td>ACK100W, ACK100M, TSD110</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘喷雾剂&amp;nbsp;</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>c-&lt;em&gt;fms&lt;/em&gt;-EGFP（MacGreen）小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>CD45 单克隆抗体（30-F11）</td><td>Invitrogen</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>CD68 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab125212</td><td></td></tr><tr><td>Curity 纱布海绵&amp;nbsp;</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG H&amp;L（HRP）&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6885</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG H&amp;L（HRP）&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab97064</td><td></td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG H&amp;L（HRP）&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab102182</td><td></td></tr><tr><td>Dow SYLGARD 184 硅胶封装剂（透明）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td>双组分，混合比例 10:1</td></tr><tr><td>圆形盖玻片，直径 8 mm，厚度 #1.5&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72296-08</td><td></td></tr><tr><td>Ender-3 Pro 3D 打印机</td><td>Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>远红外加热毯</td><td>Kent Scientific</td><td>RT-0520</td><td></td></tr><tr><td>Fc 受体阻断剂</td><td>Innovex Biosciences</td><td>NB309</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 图像处理软件包</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>FluoroSpheres 羧基微球，0.04&amp;micro;m，黄绿色（505/515）</td><td>Invitrogen</td><td>F8795</td><td></td></tr><tr><td>门控系统：</td><td>BIOPAC Systems Inc.</td><td></td><td>所有组件共同实现成像过程中对小鼠生命体征的监测，并基于小鼠呼吸信号进行图像采集门控。所有组件均购自 BIOPAC 系统公司。</td></tr><tr><td>Acq&lt;em&gt;knowledge&lt;/em&gt; 软件&amp;nbsp;</td><td></td><td>ACK100W, ACK100M</td><td></td></tr><tr><td>差分放大模块，C 系列&amp;nbsp;</td><td></td><td>DA100C</td><td></td></tr><tr><td>双通道门控系统（小型动物）</td><td></td><td>DTU200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MP160 for Windows - 分析系统</td><td></td><td>MP160WSW&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MouseOx Plus 120V&amp;nbsp;</td><td></td><td>MOX-120V;015000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>压力垫&amp;nbsp;</td><td></td><td>TSD110&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>明胶海绵（Gelfoam）</td><td>Pfizer</td><td>9031508</td><td>可吸收明胶海绵</td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>两把；不锈钢，尖-尖&lt;br/&gt; 刃口，直头，26 mm&lt;br/&gt; 刃长，11 cm 总长</td></tr><tr><td>人/小鼠髓过氧化物酶/MPO 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3667</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>使用前约开启 30 分钟&lt;br/&gt;；工具在 &gt;200&lt;br/&gt; &amp;deg;C 下灭菌 30 秒</td></tr><tr><td>Imaris&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td>www.bitplane.com</td><td></td></tr><tr><td>浸油介质 Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>带 BD Ultra-Fine 针头的胰岛素注射器，6 mm × 31G，1 mL/cc</td><td>BD</td><td>324912</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Fluriso）</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>番茄凝集素（Lycopersicon Esculentum Lectin, LEL, TL），DyLight&amp;reg; 594</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>DL-1177-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;LysM&lt;/em&gt;-eGFP 小鼠</td><td>www.mmrrc.org</td><td>012039-MU</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td>带齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端宽度；4&quot; 长度</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5153</td><td>1×2 齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端&lt;br/&gt; 宽度，4&quot; 长度</td></tr><tr><td>MTS MiniBionix II 808</td><td>MTS Systems</td><td></td><td>伺服液压材料试验机</td></tr><tr><td>中性粒细胞弹性蛋白酶 680 FAST 探针</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV11169</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>General Welding Supply Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td>General Welding Supply Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乳酸丝材</td><td>Hatchbox</td><td></td><td>直径 1.75 mm</td></tr><tr><td>ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>Puralube 眼科软膏</td><td>Dechra&amp;nbsp;</td><td>NDC17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 7 伤口夹</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-9255</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢网格</td><td>Fotofab</td><td></td><td>单个网格直径为 0.200 英寸，共包含 52 个独立网格方格，每个方格尺寸为 0.016 × 0.016 英寸。每个方格之间间距为 0.003 英寸。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>表面处理无菌组织培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012929</td><td>盖子用作成像窗的固化表面</td></tr><tr><td>TriM Scope 多光子显微镜&amp;nbsp;</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td>成像使用直立式双光子显微镜（Trimscope，LaVision BioTec），配备两台钛宝石激光器（Mai Tai 和 InSight，Spectra-Physics）和一个光学参量振荡器。使用以下长通二向色镜（Chroma）将信号引导至四个光电倍增管：&lt;br/&gt; T560LP&lt;br/&gt; T665LPXXR&lt;br/&gt; T495lxpr</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>70200742529</td><td></td></tr><tr><td>VWR 显微盖玻片</td><td>VWR</td><td>48404-453</td><td></td></tr></tbody></table>

通过透明硅胶窗进行纵向活体成像

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

活体显微成像（IVM）能够在单细胞分辨率下可视化细胞的运动、分裂和死亡过程。通过手术植入成像窗口进行IVM尤其强大，因为它允许对同一组织进行数天至数周的纵向观察。传统的成像窗口通常由生物相容性金属框架中的玻璃盖玻片构成，并缝合至小鼠皮肤上。这类窗口可能限制小鼠的自由活动，引发强烈的炎症反应，并可能因玻璃破裂或缝线撕裂而失效，这些情况均可能导致需要实施安乐死。为解决这些问题，研究人员开发了用于长期腹部器官和乳腺成像的成像窗口&#160;，该窗口采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜制成，PDMS是一种光学透明的硅基聚合物，此前已被用于颅脑成像窗口。这种窗口可直接粘附于组织表面，缩短了植入所需时间。PDMS具有良好的柔韧性，有助于其在小鼠体内长期保持结构完整性——已有实验验证其可持续使用长达35天。纵向成像指在不同时间点对同一组织区域进行多次成像。本研究在窗口内部嵌入不锈钢网格，以精确定位相同区域，从而能够在相隔数天的成像中观察同一位置的动态生物学过程（如乳腺退化）。该硅胶窗口还实现了对单个播散性癌细胞随时间发展为微转移灶的持续监测。与金属框玻璃窗口相比，本研究所用的硅胶窗口植入更简便，且对成像组织引起的炎症反应较轻微。此外，内置的网格结构使得在重复成像过程中能够简便地追踪同一组织区域。

通过成像窗口进行活体成像可用于在数小时至数周的时间内，以单细胞分辨率观察、追踪并定量多种多样的细胞和分子事件。理想的成像窗口应具备以下特性：a）对小鼠的健康状况及组织生理状态影响最小；b）具有良好的耐用性；c）植入操作简便；d）具备清晰的定位标志，以便对同一区域进行重复成像。该方法最终获得一种多功能、惰性的硅胶窗口，易于制备和植入，并可配备网格，用于在多次成像过程中准确定位同一视野。
窗口由PDMS制成，这是一种价格低廉、柔韧且透明的材料。大多数实验室均可方便地采购到用于浇铸窗口的耗材。为此，市面上可购得的24孔板盖上已蚀刻好的圆形模具（直径22 mm）非常适用。通过调节单位面积上使用的聚合物用量，可控制窗口的厚度。为了记录窗口厚度对成像分辨率的影响，采用40 nm荧光微球进行了点扩散函数（PSF）分析，以比较透过不同厚度PDMS窗口的成像效果与通常用于活体成像窗口的玻璃盖玻片（厚度0.17 mm）之间的差异。为了模拟活体成像所用的实验设置，PSF成像采用相同的双光子显微镜和水浸物镜，并以超声耦合凝胶作为浸没介质进行。
通过在...

本文介绍了一种利用光学透明硅胶窗进行长期活体成像的方法，该窗口可直接粘接于目标组织/器官及皮肤上。&#160;与其他目前常用的方法相比，这些窗口成本更低且更具灵活性，且手术植入过程对动物造成的炎症反应和不适程度较轻。

活体显微成像（IVM）可实现单细胞分辨率下细胞运动、分裂和死亡过程的可视化。通过手术植入的成像窗口进行的活体显微成像……

这种铸造和植入硅胶窗的方法降低了进行长期活体成像的技术门槛。我们的方案可制备出坚固且易于适配的窗口，对动物具有良好的耐受性。利用该技术，我们已对肝脏、胰腺和乳腺中的癌细胞和免疫细胞进行了成像。经过少量调整后，该方法可适用于多种解剖位置和生物学问题。对于首次尝试此技术的研究人员，建议练习从注射器中释放少量胶水。胶水用量过多会遮蔽成像视野，并使手术区域难以操作。通过在洁净光滑的表面上滴加少量新配制的硅胶聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），开始浇铸硅胶窗口，并调整体积与面积的比例以获得所需的厚度。将PDMS滴加到目标浇铸表面后，轻轻将不锈钢网格压入硅胶中，以提供用于重复成像同一组织区域的定位标记。为去除气泡并对硅胶聚合物进行脱气处理，将涂覆后的表面置于真空干燥器中45分钟。完成后，将聚合物在 75 至 80 摄氏度的烘箱中固化 45 分钟。沿模具边缘在聚合物上划线，并用镊子轻轻将固化的窗口从浇铸表面剥离。将小鼠置于左侧卧位。通过在剃毛的手术区域连续三次涂抹10%（体积比）聚维酮碘溶液和70%（体积比）乙醇，对麻醉小鼠进行手术前准备。必须注意保持手术区域无菌。接着，使用无菌剪刀和镊子在右侧 flank 区域、肋弓下方3毫米处做一个10毫米的切口。取下一平方厘米大小的皮肤组织，使用另一把无菌剪刀和镊子取下稍小于皮肤组织的腹膜部分。将少量外科粘合剂滴加至无菌孔板中，用31号针头的注射器吸取后，涂抹于肝脏表面待成像区域的周围边缘，然后将观察窗放置于目标区域，并用力将其紧压在肝脏上约两分钟，直至粘合剂完全干燥。将观察窗边缘折叠至腹膜下方后，在此时位于腹膜下方的观察窗边缘处滴加少量外科粘合剂，再用镊子向下按压腹膜，使其牢固固定于观察窗上。同样，在向下按压皮肤之前，先在腹膜上涂少量手术粘合剂以封闭腹膜，然后在窗口边缘涂抹胶水，形成一圈边缘，防止皮肤重新生长覆盖窗口。将窗口植入胰腺时，将小鼠置于右侧卧位，在左侧腹部做切口，随后去除一部分腹膜，操作方法如前所述。使用无菌生理盐水浸湿的无菌棉签轻轻牵拉脾脏，以暴露并观察胰腺。使用湿润的棉签重新调整胰腺位置，使切口处暴露更多的胰腺表面区域。一旦暴露胰腺，按照之前所述方法，在目标区域插入并密封成像窗口。要暴露乳腺组织，将小鼠置于仰卧位，使用无菌剪刀和镊子在腹股沟乳头之一的内侧做一条10毫米的切口。在乳腺上方取下一块0.5平方厘米的皮肤，然后用无菌剪刀轻轻插入皮肤与乳腺之间的界面，分离乳腺与皮肤，以破坏其粘连。使用31号针头的注射器，在乳腺表面待成像区域的边缘周围涂抹少量手术粘合剂。将成像窗口牢固地放置并按压在乳腺上，直至粘合剂完全干燥。将窗口边缘折叠到皮肤下方后，在位于皮肤下的窗口边缘处涂抹少量外科粘合剂，并用镊子按压皮肤，使皮肤与窗口固定。在窗口边缘涂抹胶水，形成一圈边缘，以防止皮肤重新生长覆盖窗口。在开始成像前，用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭窗口，清除任何残留碎屑。使用水浸物镜时，将超声耦合剂涂抹在窗口上，避免产生气泡。开始成像前，通过目镜找到网格并将其调至清晰对焦。然后通过将网格底部设为零点，确定组织成像的大致深度。这些信息将有助于在后续成像过程中定位相应的Z平面。为了在多次成像过程中识别相同的位置，可利用网格上的方格作为参考点。在成像过程中，记录网格的方向以及每个视野在网格内的成像位置。可以利用网格在后续成像过程中返回特定的网格区域和成像视野，以确保成像实验的成功。每次成像结束后，用蘸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭窗口，去除残留的镜片浸没介质和碎屑。硅胶窗口可实现对免疫细胞动态浸润过程的长期观察。代表性分析展示了在重塑的乳腺组织中，中性粒细胞在第2天和第4天的浸润情况。硅胶窗使得在植入后数周内的多个时间点均可观察肿瘤。由200毫克PDMS浇铸的窗口通常更适用于手术植入，因其表现出的韧性显著优于由150毫克PDMS浇铸的窗口。值得注意的是，聚二甲基硅氧烷（PDMS）窗口不如标准玻璃 rigid，表现为玻璃窗口的杨氏模量显著高于 PDMS。在不同器官中插入窗口耐受性良好，因为大多数小鼠随时间推移继续增重。进行此操作时最重要的是要使用胶水将窗口完全密封。这可以防止感染、组织干燥以及窗口移位。手术后，可通过硅胶窗口进行原位注射，使研究人员能够研究多种课题，如细胞增殖、细胞间相互作用以及治疗效果。

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