通过透明硅胶窗进行纵向活体成像

这种铸造和植入硅胶窗的方法降低了进行长期活体成像的技术门槛。我们的方案可制备出坚固且易于适配的窗口，对动物具有良好的耐受性。利用该技术，我们已对肝脏、胰腺和乳腺中的癌细胞和免疫细胞进行了成像。

经过少量调整后，该方法可适用于多种解剖位置和生物学问题。对于首次尝试此技术的研究人员，建议练习从注射器中释放少量胶水。胶水用量过多会遮蔽成像视野，并使手术区域难以操作。

通过在洁净光滑的表面上滴加少量新配制的硅胶聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS），开始浇铸硅胶窗口，并调整体积与面积的比例以获得所需的厚度。将PDMS滴加到目标浇铸表面后，轻轻将不锈钢网格压入硅胶中，以提供用于重复成像同一组织区域的定位标记。为去除气泡并对硅胶聚合物进行脱气处理，将涂覆后的表面置于真空干燥器中45分钟。

完成后，将聚合物在 75 至 80 摄氏度的烘箱中固化 45 分钟。沿模具边缘在聚合物上划线，并用镊子轻轻将固化的窗口从浇铸表面剥离。将小鼠置于左侧卧位。

通过在剃毛的手术区域连续三次涂抹10%（体积比）聚维酮碘溶液和70%（体积比）乙醇，对麻醉小鼠进行手术前准备。必须注意保持手术区域无菌。接着，使用无菌剪刀和镊子在右侧 flank 区域、肋弓下方3毫米处做一个10毫米的切口。

取下一平方厘米大小的皮肤组织，使用另一把无菌剪刀和镊子取下稍小于皮肤组织的腹膜部分。将少量外科粘合剂滴加至无菌孔板中，用31号针头的注射器吸取后，涂抹于肝脏表面待成像区域的周围边缘，然后将观察窗放置于目标区域，并用力将其紧压在肝脏上约两分钟，直至粘合剂完全干燥。将观察窗边缘折叠至腹膜下方后，在此时位于腹膜下方的观察窗边缘处滴加少量外科粘合剂，再用镊子向下按压腹膜，使其牢固固定于观察窗上。

同样，在向下按压皮肤之前，先在腹膜上涂少量手术粘合剂以封闭腹膜，然后在窗口边缘涂抹胶水，形成一圈边缘，防止皮肤重新生长覆盖窗口。将窗口植入胰腺时，将小鼠置于右侧卧位，在左侧腹部做切口，随后去除一部分腹膜，操作方法如前所述。使用无菌生理盐水浸湿的无菌棉签轻轻牵拉脾脏，以暴露并观察胰腺。

使用湿润的棉签重新调整胰腺位置，使切口处暴露更多的胰腺表面区域。一旦暴露胰腺，按照之前所述方法，在目标区域插入并密封成像窗口。要暴露乳腺组织，将小鼠置于仰卧位，使用无菌剪刀和镊子在腹股沟乳头之一的内侧做一条10毫米的切口。

在乳腺上方取下一块0.5平方厘米的皮肤，然后用无菌剪刀轻轻插入皮肤与乳腺之间的界面，分离乳腺与皮肤，以破坏其粘连。使用31号针头的注射器，在乳腺表面待成像区域的边缘周围涂抹少量手术粘合剂。将成像窗口牢固地放置并按压在乳腺上，直至粘合剂完全干燥。

将窗口边缘折叠到皮肤下方后，在位于皮肤下的窗口边缘处涂抹少量外科粘合剂，并用镊子按压皮肤，使皮肤与窗口固定。在窗口边缘涂抹胶水，形成一圈边缘，以防止皮肤重新生长覆盖窗口。在开始成像前，用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭窗口，清除任何残留碎屑。

使用水浸物镜时，将超声耦合剂涂抹在窗口上，避免产生气泡。开始成像前，通过目镜找到网格并将其调至清晰对焦。然后通过将网格底部设为零点，确定组织成像的大致深度。

这些信息将有助于在后续成像过程中定位相应的Z平面。为了在多次成像过程中识别相同的位置，可利用网格上的方格作为参考点。在成像过程中，记录网格的方向以及每个视野在网格内的成像位置。

可以利用网格在后续成像过程中返回特定的网格区域和成像视野，以确保成像实验的成功。每次成像结束后，用蘸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭窗口，去除残留的镜片浸没介质和碎屑。硅胶窗口可实现对免疫细胞动态浸润过程的长期观察。

代表性分析展示了在重塑的乳腺组织中，中性粒细胞在第2天和第4天的浸润情况。硅胶窗使得在植入后数周内的多个时间点均可观察肿瘤。由200毫克PDMS浇铸的窗口通常更适用于手术植入，因其表现出的韧性显著优于由150毫克PDMS浇铸的窗口。

值得注意的是，聚二甲基硅氧烷（PDMS）窗口不如标准玻璃 rigid，表现为玻璃窗口的杨氏模量显著高于 PDMS。在不同器官中插入窗口耐受性良好，因为大多数小鼠随时间推移继续增重。进行此操作时最重要的是要使用胶水将窗口完全密封。

这可以防止感染、组织干燥以及窗口移位。手术后，可通过硅胶窗口进行原位注射，使研究人员能够研究多种课题，如细胞增殖、细胞间相互作用以及治疗效果。