Name: 啮齿动物心脏和脑组织准备缺血后数码微距摄影 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学习啮齿动物心脏和脑组织的切片与染色方法，用于缺血再灌注后的科学微距摄影。本方案提供照明与相机设置指南，确保高质量图像采集，适用于心肌梗死面积测量及神经科学研究。

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作者得到欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助协议编号857394、项目FAT4BRAIN的支持。

实验操作遵循欧洲共同体的指南以及当地法律法规（指令 2010/63/EU），所有操作程序均经拉脱维亚里加食品与兽医服务部门批准。
1. 心脏染色与切片
注意：本方案中描述的技术可用于经Langendorff灌注的离体大鼠或小鼠心脏。6,7 和 体内 大鼠心脏缺血-再灌注损伤检测8,9,10,11染色后的操作步骤 体内 IR 损伤检测实验中，假设心脏被取出后固定于插管上，并以 Langendorff 灌流模式进行短暂灌流。
<ol>
	<li>将充满克雷布斯-亨塞莱特溶液的心脏套管从注射器上取下，连接至另一支装有温热（37 °C）的0.1%亚甲蓝克雷布斯-亨塞莱特溶液的注射器。大鼠心脏使用5 mL注射器，小鼠心脏使用1–2 mL注射器。 
	注意：也可选择将含蓝色染料的溶液注入压力或流量控制（如Langendorff）装置中。在拆卸和安装过程中，必须确保套管内无气泡残留，并且用于冠状动脉再闭合的缝线不得松动。</li>
	<li>以约4 mL/min的流速向大鼠心脏继续灌注4 mL亚甲蓝溶液，以约0.5–1 mL/min的流速向小鼠心脏灌注1 mL亚甲蓝溶液。 
	注意：根据经验，两种方法均安全且可实现充分染色；然而，对于初学者而言，使用压力控制泵或静水压系统虽然耗时较长，但可更有效地避免过度染色。</li>
	<li>将套管与注射器断开，并将心脏从套管上取下。</li>
	<li>用滤纸轻轻滚动心脏以去除多余的亚甲蓝。在去除多余染料后，打开止血钳，松开冠状动脉周围的结扎线，并仅在此时移除缝线上的塑料管。 
	注意：在此阶段，可将小鼠心脏置于小型塑料袋或5 mL离心管中，于-20 °C冷冻5–10分钟。最长冷冻时间需由各实验室根据实验条件确定。短期冷冻有助于初学者将小鼠心脏切成1 mm厚的切片。不建议冷冻大鼠心脏。避免在-20 °C下冷冻超过10分钟。</li>
	<li>将染色后的大鼠心脏置于不锈钢切片模具中（见材料表）进行切片（图1A）。随后将心室切成2 mm厚的切片（成年大鼠心脏通常可获得6–7片）。对于小鼠心脏，将心室切成1.5 mm厚的切片（成年小鼠心脏至少应获得4片）。 
	注意：必须使用与切片模具兼容的剃刀刀片。通常，兼容的单边刃剃刀刀片（例如厚度不超过0.01英寸（0.254 mm））可用于大鼠心脏切片。小鼠心脏通常使用双边刃剃刀刀片，其厚度一般不超过0.004英寸（0.1 mm）。</li>
</ol>
<img alt="静态平衡；带凹槽的方块，展示重量分布分析示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：大鼠心脏和脑组织切片用模具。（A）大鼠心脏，（B）大鼠脑。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>切片后，将切片转移至一个15 mL塑料管中。向装有心脏切片的管中加入5 mL溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的1%氯化三苯基四氮唑（TTC），于37 °C水浴中孵育10分钟。</li>
	<li>在TTC溶液中孵育后，用PBS至少清洗心脏切片2–3次，并准备进行图像采集。</li>
</ol>
2. 脑组织染色与切片
<ol>
	<li>大脑中动脉闭塞实验后3,12取出包括脑干在内的脑组织，用预冷的PBS冲洗。</li>
	<li>选择合适尺寸的脑部不锈钢切片模具（参见 材料表）根据动物的体重（图1B将脑组织腹侧朝上放置于脑切片矩阵中。 
	注意：将脑组织置于基质中时，其腹侧面必须与模具的顶面平行。</li>
	<li>使用刀片从两侧限制脑的前端和尾端部分（每侧各用两片刀片）。 
	注意：必须使用适用于切片基质的剃刀刀片。通常，可使用兼容的单边剃刀刀片（厚度不超过0.01英寸（0.254 mm））进行大鼠脑组织切片。</li>
	<li>将刀片部分插入（不要完全切断脑组织）第一片与最后一片刀片之间的槽道中。当所有刀片均插入并平行排列后，用手掌同时下压所有刀片，将脑组织切成2 mm厚的冠状切片。</li>
	<li>用两根手指牢固地捏住刀片两侧，将刀片与切好的脑组织一起从矩阵中取出。</li>
	<li>将脑片逐一放置于培养皿（70 mL，72 × 72 mm）中。摆放脑片时，应确保每张切片的腹侧始终朝上。</li>
	<li>加入温热的（+37 °C) 将1% TTC溶液加入脑切片中，在37℃下孵育8分钟 37 °C 在暗处。 
	注意：脑切片在孵育过程中必须完全浸没在TTC溶液中。</li>
	<li>在1% TTC溶液中孵育后，将脑片转移至蓝色塑料托盘中以采集图像。按从额叶到尾侧的顺序依次排列脑片，并使用解剖刀沿矢状面分离半球。 
	注意：托盘表面应可清洗，呈哑光质地，且颜色需与脑切片形成对比（即不能为红色、白色或浅粉色）。</li>
</ol>
3. 宏观摄影
<ol>
	<li>染色后立即对组织切片进行拍照。 
	注意：心脏切片可在冷 PBS（+4 °C）或福尔马林溶液中保存最多 30 分钟。脑切片可在福尔马林中长期保存（1-2 周）。</li>
	<li>将所选相机安装在支架上，配备充满电的电池、存储卡和镜头（图 2） 
	注意：图像采集前至少提前 5-10 分钟打开光源，以预热设备。LED 灯在微秒内即可达到全亮度。</li>
</ol>
<img alt="用于样品托盘分析的LED灯、微距镜头和遥控数字成像装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于微距摄影的相机与光源装置。 相机垂直于成像平面放置，以确保相机的焦平面与样品平行。缩写：LED = 发光二极管。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>根据可用的光源，选择合适的白平衡设置，或按照相机说明书中的说明进行色温校准。 
	注意：推荐使用白色LED光源（色温6,500 K），以避免荧光灯管引起的光线闪烁。</li>
	<li>将相机切换至全手动模式，设置ISO为100，光圈为f/10，并调节快门速度以获得最佳图像曝光。确保相机焦平面与样品放置表面平行。 
	注意：使用直方图功能有助于确保组织切片未过度曝光。</li>
	<li>连接或启用有线或无线远程快门触发器，以防止按下快门时相机抖动。 
	注意：另一种替代方法是启用延迟快门功能，即在按下触发按钮后延迟2或10秒再触发快门。</li>
	<li>将心脏切片完全浸入盛有PBS的容器中。 
	注意：浸没的切片容易漂离原位。为尽量减少漂浮，应使用能容纳所有切片的最小托盘，并使用最少的浸没液，确保样本完全浸没。其他方法包括将切片夹在玻璃载玻片之间，或在镜头上使用偏振滤光片。将圆形偏振滤光片安装在镜头上，并旋转至相机实时取景画面中的反光消失为止。</li>
	<li>将脑切片置于无PBS或其他液体的干燥托盘中进行排列。 
	注意：使用偏振滤光片拍摄脑切片图像非常方便。</li>
	<li>将盛有切片的容器置于配备微距镜头的相机下方，并确保所有切片完全处于视野范围内。确保切片位于同一平面上，即无弯曲或卷曲。</li>
	<li>检查曝光情况，并根据需要调整相机设置。 
	注意：一旦设定，整个实验过程中不得更改曝光及其他设置。</li>
	<li>拍摄样品编号（或其他标识）以及使用远程触发器拍摄组织切片图像。 
	注意：当需要对样本尺寸进行绝对量化时，应在视野中包含尺寸标记，例如毫米尺。</li>
	<li>旋转切片并从另一侧拍摄其图像。</li>
</ol>

<ol><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
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<li>Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischemia+model+by+endovascular+suture+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978(2011).</li>
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<li>Liepinsh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+L-carnitine+biosynthesis+and+transport+by+methyl-gamma-butyrobetaine+decreases+fatty+acid+oxidation+and+protects+against+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction.</a> British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).</li>
<li>Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+effect+of+cerivastatin+on+cardiac+regional+ischemia+in+a+rat+model+mimicking+off-pump+coronary+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery.</a> Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).</li>
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<li>Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction in rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2464(2011).</li>
<li>Vavers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+effects+of+R-phenibut+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia.</a> Pharmacological Research. 113, Pt B 796-801 (2016).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pathologic+detection+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early pathologic detection of acute myocardial infarction.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

缺血再灌注（IR）后心脏的制备首先需重新闭塞冠状动脉，并灌注蓝色染料以区分风险区域与非风险区域。亚甲蓝或伊文思蓝染料最常用于此目的2。由于过高的压力可能损伤心脏瓣膜，从而导致风险区域部分或完全被染色，因此最好使用压力可控的系统进行心脏灌注，例如兰格多夫装置，或配有静水压力系统的简化注射器或泵。可控灌注可确保生理压力水平，染料通常不会进入心脏的闭塞区域。流量控制和压力控制技术均可防止过度染色。
在可存活组织处理过程中，最严重的错误之一是在染色前将组织长时间存放在冷冻柜中。冷冻通常被采用的原因是研究者希望在缺血再灌注（IR）实验后的第二天或更晚时间进行心脏染色。此外，冷冻也被用来使心脏切片更容易操作。我们发现，将心脏短期冷冻不超过5-10分钟对心脏组织的完整性影响极小，并有助于组织切片（尤其是小鼠心脏）成薄片。然而，长时间冷冻会损伤细胞膜，降低细胞活力和线粒体功能13。结果，功能性线粒体的TTC染色受到影响，坏死组织与存活组织之间的边界变得模糊不清。总体而言，应避免冷冻大鼠心脏，仅可对小鼠心脏进行短期冷冻以方便切片。
下一步是在37 °C的1% TTC溶液中对组织进行染色14。染色液应预先温育——尤其是脑组织切片染色时尤为重要。使用预温的溶液时，心脏切片的最佳染色时间为10分钟。孵育时间过长或温度高于37 °C会导致心肌组织呈现棕色。标本染色充分且红色强度一致，对于后续图像分析至关重要。在拍照前的最后步骤中，组织切片需用冷PBS或类似缓冲液冲洗2–3次，以去除溶液中的TTC和过量的亚甲蓝，避免照片出现蓝色偏色。心脏切片应在染色后尽快拍照，以获得最佳图像质量。若将心脏切片置于冷（+4 °C）PBS中保存，最多60分钟内仍可保持良好的染色质量。染色后的脑切片和主动脉组织通常保存在4%中性甲醛溶液中，可维持良好质量达一周。脑组织在甲醛溶液（+4 °C）中过夜保存不会影响正常组织的染色强度，适合用于图像采集。然而，甲醛会引起心脏切片肿胀并导致褪色，因此不建议将心脏组织保存在甲醛中。
下一步是图像采集。许多实验室使用平板扫描仪作为图像采集工具，期望其能够取代数码相机和照明装置。我们发现，对切片进行扫描无法提供足够的图像分辨率和颜色分离度，因此不适合用于心脏切片的成像。特别是扫描仪的分辨率不足以满足小鼠心脏的成像需求，且我们观察到亚甲蓝的显色效果较差。相比之下，对于仅用TTC或其他单一染料染色的脑切片成像，扫描仪或许可作为数码相机的一种替代方案。在对组织切片进行扫描时，必须使用能够确保恒定曝光设置的扫描软件。总体而言，平板扫描仪功能较弱，在大多数成像应用中无法替代数码相机。
标本的背景颜色同样重要。理想情况下，托盘底部的颜色应避免与染色标本中的颜色相同。例如，若需以自动或半自动方式量化亚甲蓝和氯化三苯基四氮唑（TTC，红色）染色面积，则应避免使用白色、红色、蓝色、黄色和棕色的背景，因此绿色背景更为合适。然而，颜色的选择还取决于操作人员在图像后处理时的偏好。许多科研人员倾向于使用白色背景，因为在图像后处理过程中，白色背景可以被删除并转换为纯白色（RGB 白色代码 255,255,255）。随后，在用于半自动分析的颜色选择列表中，应排除&#160;完全&#160;白色的区域，仅计数浅色的坏死区域——这些区域若未过度曝光，则不会呈现完全白色。蓝色和绿色背景适用于脑切片和主动脉的摄影。
用于组织摄影的最佳成像工具是配备兼容微距镜头的单反相机或无反可换镜头数码相机。拍摄非常微小的物体可能需要相机与显微镜组合使用；然而，微距镜头通常已具备足够的放大倍数（至少1:2），足以获取小鼠心脏的详细图像。许多制造商提供价格适中的数码相机和微距镜头，可用于拍摄高分辨率、高倍率的照片。目前所有主流数码相机均具备微距摄影所需的基本特性与功能，包括可安装在支架上、高像素数量（通常&#62;20 Mpx）、实时取景、反光镜预升、延时拍摄功能、遥控快门，以及手动设置相机参数的能力，从而确保快门速度、光圈、白平衡和ISO设置保持恒定。具备上述功能且镜头放大倍数至少为1:2的紧凑型相机也可用于微距摄影。由于镜头特性，某些紧凑型相机需非常靠近被摄物体放置，实验人员必须确保相机机身不会影响标本的照明效果。
使用任何类型的可换镜头相机进行微距摄影时，需要配备高放大倍率（1:1–1:2）的微距镜头。我们建议在全画幅（24 mm × 36 mm）传感器上使用焦距范围为50 mm至100（120）mm或等效焦距的微距镜头。&#160;传感器较小的相机具有不同的传感器尺寸，因此应相应重新计算放大倍率。在拍摄心脏切片时，100 mm微距镜头前端到被摄物体的人体工学距离约为150 mm。该设置允许操作者将所有设备放置在桌面上，并方便地接触相机控制部件。对于较大物体（如脑切片）的摄影，可考虑使用50 mm微距镜头，因为需要更宽的视场角，以便在单张照片中完整捕捉所有切片。
为了获得高分辨率的清晰图像，应将相机安装在稳固的支架上，这种支架与照明设备组合在一起称为摄影复制架。将相机固定在支架上，并使用远程（有线或无线）快门触发装置，可消除相机抖动，并确保与拍摄目标保持恒定距离。相机与照明系统的配置应包含两个位于被摄物体两侧的恒定光源，其照射角度相对于被摄物平面约为30–60°，以确保标本得到充分照明，同时有助于避免反光。相机安装时必须精确调整，使成像传感器与被摄物平面完全平行。为使画面区域照明均匀，两盏灯应保持相同的朝向，并与被摄物体处于相等的距离。若光源与被摄物体的距离不同，会导致照明不均。此外，闪烁的光源也会引起图像曝光的波动。总体而言，准确放置相机和光源对于获取照明良好、成像精确的标本图像至关重要。
组织样本会反射光线（呈现光泽），在图像中表现为白色斑点。这些光反射斑点不包含有用的颜色信息，因此图像的这些部分无法用于准确的图像定量分析。组织切片产生的光反射可通过多种方法去除。最有效的方法是将组织样本完全浸入盛有生理盐水或PBS溶液的容器中。另一种类似方法是将组织切片置于玻璃片下方（或两片玻璃之间）。该方法对消除反射有效，但其图像分辨率可能低于浸没状态下组织的拍照图像。
也可以使用安装在镜头上的偏振滤光片来消除光线反射。圆形偏振滤光片广泛可得，但其质量因价格而异，廉价滤光片可能会显著降低图像分辨率。通过将偏振滤光片的可转动部分旋转至适当角度，即可滤除反射光。某些光源（例如强LED光源）可能会影响偏振滤光片的效果。总体而言，在去除多余液体后，偏振滤光片可完全消除脑切片上的所有反射；然而，将样品浸入缓冲液中是处理心脏切片最简便且成本最低的方法。
手动设置快门速度、光圈、ISO 和白平衡对于完全控制成像过程至关重要。在自动模式下，样品、背景以及光源特性会影响相机的曝光测光系统；因此，为了在实验过程中保持多张照片之间曝光和白平衡的一致性，必须采用手动设置。对于微距摄影，建议光圈设置在 f/8 至 f/16 之间。缩小光圈可增加景深，这在被摄物体不在同一平面上时尤为有利。然而，过小的光圈会因衍射效应而限制摄影的总体分辨率。大多数镜头的最佳光圈通常为 f/10，因为在该设置下分辨率下降可忽略不计，且景深足够。为最小化图像伪影（噪声），通常选择 ISO 值在 50 至 400 之间（越低越好）。随后，在现有光照条件下，通过调整快门速度，结合上述光圈和 ISO 设置，以获得正确的曝光。手动设置对于图像分析的一致性至关重要。标准化成像可确保在整个研究过程中使用相同的颜色阈值设定，这对于需要进行分割分析的研究尤为重要。例如，若样本图像的颜色、白平衡和曝光保持一致，则可长期使用基于预定义蓝色、红色和白色（+浅粉色）颜色分割文件的 ImagePro 软件进行半自动化分析。
应根据用于照明样品的光源色温调整白平衡设置。白平衡可从相机内置的预设模式中选择，或通过灰色目标物的手动校准来设定。以RAW格式拍摄图像的优点在于，可以在软件后期处理过程中调整白平衡。由于RAW文件包含的信息远多于JPEG文件，因此对RAW文件进行后期处理能够有效校正色彩平衡和曝光，并获得更优的图像分辨率。鉴于大多数相机可同时拍摄JPEG和RAW文件，我们建议拍摄RAW文件并将其作为备份保存。
总体而言，本实验方案描述了一种用于大鼠心脏和脑组织切片与染色的方法，并提供了建立照明和相机设置以及高分辨率图像采集摄影技术的指导，以便进行后续分析。该方法适用于所有实验性小型动物器官摄影。

几十年来，心脏和脑组织样本的摄影与分析一直是生命科学实验的重要组成部分。科学与创新的进步推动了能够实现超分辨率的昂贵显微镜的发展。显微照片需在严格控制的光照环境下，依照详细的操作步骤获取。相比之下，宏观摄影（放大倍数为1:2或更高）通常在光照条件不受控的环境中进行，并使用不合适的成像装置。样本制备和相机设置的技术往往需要大幅优化。因此，大量质量有限的宏观照片被广泛发表在科学期刊上。图像分辨率和对比度不足，限制了在红外研究中进行精确图像定量分析的可能性。
心肌1,2和脑3,4梗死的实验操作已有详细描述。本研究的目的是提供一份逐步指南，介绍如何建立一套系统，用于梗死实验后对啮齿类动物心脏和脑组织标本进行摄影及标准化分析。该流程包括组织切片、染色以及心脏和脑样本的大体摄影。组织标本的制备是实验的关键环节，而平面图像分析的结果在很大程度上依赖于所获得图像的质量5。
这些方法在啮齿类动物组织的测量和图像平面分析中尤为有用，也可为常规科学宏观摄影提供价值。此外，高质量且一致的图像使得数字照片能够进行自动化分析，有助于节省时间、避免人为干预，并最大限度地减少图像分析过程中的错误或偏差风险。这将有助于生成可靠且稳健的数据，并促进临床前研究成果向新型抗缺血临床治疗方案的转化。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Sagimed</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑 (TTC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Sagimed</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>成年大鼠脑切片矩阵</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSRAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>小鼠心脏主动脉插管</td><td>ADInstruments</td><td>SP3787</td><td></td></tr><tr><td>大鼠心脏主动脉插管</td><td>ADInstruments</td><td>SP3786</td><td></td></tr><tr><td>二水氯化钙，&amp;ge;99%</td><td>Acros Organics</td><td>207780010</td><td></td></tr><tr><td>弯头盖玻片镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11073-10</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Agnthos</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Hoya 62 mm α 圆形偏振滤光片</td><td>Hoya</td><td>HOCPA62</td><td></td></tr><tr><td>六水氯化镁</td><td>Penta</td><td>16330-31000</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>SigmaAldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>小鼠心脏切片矩阵</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSMS005-1</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯塑料导管</td><td>BD Intramedic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>生化用氯化钾</td><td>Acros Organics</td><td>418205000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾，&amp;ge;99%</td><td>Acros Organics</td><td>205920025</td><td></td></tr><tr><td>大鼠心脏切片矩阵</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRS001-1</td><td></td></tr><tr><td>钝头弯剪</td><td>Agnthos</td><td>14013-15</td><td></td></tr><tr><td>心脏清洗用剪刀</td><td>Agnthos</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>Zivic Instruments</td><td>BLADE012.1</td><td></td></tr><tr><td>生化用碳酸氢钠，99.5%</td><td>Acros Organics</td><td>447100010</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher bioreagents</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Sony Alpha a6000 无反光镜数码相机</td><td>Sony</td><td>ILCE6000</td><td>可用任何现代数码相机替代</td></tr><tr><td>Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS</td><td>Sony</td><td>SEL90M28G</td><td>重要提示：镜头需与相机兼容</td></tr><tr><td>Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS</td><td>Sony</td><td>2190246141</td><td></td></tr><tr><td>外科刀片</td><td>Heinz Herenz Hamburg Germany</td><td>BS2982</td><td></td></tr><tr><td>恒温振荡器</td><td>BioSan</td><td>PST-60HL-4</td><td></td></tr><tr><td>带齿组织镊</td><td>Agnthos</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>心脏清洗用带齿组织镊</td><td>Agnthos</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>称量盘，70 mL</td><td>Sarsted</td><td>71,99,23,212</td><td></td></tr></tbody></table>

啮齿类动物缺血-再灌注后心脏与脑组织数字宏观摄影标本制备

Rodent Heart and Brain Tissue Preparation for Digital Macro Photography after Ischemia-reperfusion

宏摄影适用于对各种组织样本进行高倍成像，以开展定性和定量分析。组织制备及后续的图像采集步骤需在缺血-再灌注（IR）实验结束后立即进行，必须及时操作并谨慎处理。本文针对心脑组织中IR诱导损伤的评估，介绍了基于2,3,5-三苯基-2H-四氮唑氯化物（TTC）染色结合宏摄影的方法。科学宏摄影需要可控的照明条件和合适的成像装置。该标准化方法即使使用价格低廉但更新及时的数码相机与宏镜头组合，也能获得高质量、高细节的数字图像。文中讨论了样本制备和图像采集过程中的正确技术及潜在错误，并提供了正确与错误设置对图像质量影响的示例。此外，还给出了避免常见错误的具体建议，例如染色过度、样本储存不当以及照明条件不理想等问题。本文展示了大鼠心脏与脑组织切片及染色的适当方法，并提供了建立照明系统、相机设置以及高分辨率图像采集摄影技术的指导原则。

图3A 是心肌梗死后经亚甲蓝和氯化三苯基四氮唑（TTC）染色的心脏切片照片，其包含足够的细节和颜色信息，可用于进一步进行梗死面积的平面测量分析（图3B）。我们检测了心脏在冷冻24小时后对组织完整性的影​​响（图3C）。长时间冷冻（>1小时，图3C）会降低线粒体功能，因此心脏的TTC染色不呈红色，而是呈淡粉色，且坏死组织与存活组织之间的边界变得模糊（图3C）。
此外，比较了两种减少样本反射的方法。浸没法是最有效的方法，可产生细节丰富且对比度良好的图像（图 4A）。第二种方法是使用安装在镜头上的偏振滤光片。偏振滤光片同样有效，但会略微降低图像的分辨率和微对比度。图 4B). 未使用浸没或滤光片的心脏切片示例图像（图4C) 包含大量反射信号，不适合进一步分析。
由于脑切片管理（漂浮）问题，脑切片不应浸入液体中。在平面测量分析中，重要的是将脑的未受累侧（健康侧）（图5A）与卒中受累侧（图5B）进行比较。脑切片在干燥的培养皿或托盘上更易于操作，同时使用偏振滤光片以消除反光。脑切片摄影采用蓝色背景的托盘（背景选择此前已有描述5）。
使用手动相机设置以确保完全控制曝光和白平衡。应根据可用的光源，在实验开始前或初期调整相机设置。这可确保所有图像具有最佳的曝光和白平衡，从而实现一致的分析（图6A）。相机的自动设置并不理想，可能导致相机参数变化，从而产生不适当的结果并引入图像间的变异。
图6展示了心脏切片曝光过度（图6B）和曝光不足（图6C）的示例。应充分注意相机的白平衡设置，使其与相机-光源装置中所用的特定光源相匹配。不正确的白平衡设置可能导致图像偏蓝或偏黄（图6D），或偏品红或偏绿（图6E）。
<img alt="心脏组织活性；通过颜色编码分析显示坏死和存活区域的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：大鼠心脏切片图像。（A）使用ImageProPlus 6.3软件对新鲜心脏切片进行颜色分割分析（B）。（C）TTC染色在冷冻（冷冻24小时）心脏切片中难以区分存活与坏死组织。缩写：TTC = 2,3,5-三苯基-2H-四氮唑氯化物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞分化过程，显微镜图像显示三个阶段；标记为 A、B 和 C 以进行比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：减少反射的技术。 大鼠心脏切片浸入 PBS 中拍摄的图像（A），以及使用偏振滤光片拍摄的图像（B）。(C) 未使用浸液或滤光片时出现反射的心脏切片图像。缩写 = PBS = 磷酸盐缓冲液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肾豆发芽阶段，对比分析，排列在蓝色背景上。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：大鼠脑切片图像。 大鼠脑缺血-再灌注后被切成七个切片，并用 TTC 染色。使用偏振滤光片可获得无反射的图像。（A）来自未受损半球的切片；（B）来自中风受损半球的切片。缩写：TTC = 2,3,5-三苯基-2H-四氮唑氯化物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织样本的比色分析，显示不同滤光片效果的图像，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：大鼠心脏切片图像。 正确（A）与不正确（B-E）拍摄的心脏切片图像。曝光设置不当会导致图像过曝（B）或欠曝（C）。白平衡设置不当会导致图像呈现黄色（D）或绿色色偏（E）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在缺血-再灌注实验后对啮齿类动物组织进行标准化制备的方案，以及建立照明和相机设置以获取高分辨率图像的指南。该方法适用于所有实验性小型动物器官摄影。

微距摄影适用于对各种组织样本进行高倍成像，以开展定性和定量分析。组织……

本方案展示了心脏和脑组织切片与染色的适当方法，同时提供了照明设备、相机设置以及图像采集摄影技术的指导原则。这些方法对于在啮齿类动物组织中进行图像平面测量分析特别有用，也可为一般的科学宏摄影提供参考价值。首先，将充满克雷布斯-亨塞尔特溶液的注射器上的心脏套管取下，并将其连接至另一支装有含0.1%亚甲蓝的温热克雷布斯-亨塞尔特溶液的注射器。以每分钟4毫升的速度，向大鼠心脏灌注4毫升亚甲蓝溶液。断开套管与注射器的连接，并将心脏从套管上取下后，用组织纸轻轻滚动心脏以去除多余的亚甲蓝。去除多余的亚甲蓝后，打开止血钳，取下缝合线周围的塑料管，松开冠状动脉周围的结扎线。接着，将染色的大鼠心脏置于不锈钢切片模具中，将心室切成厚度为两毫米的切片，每只成年大鼠心脏通常可获得六至七片。切片后，将切片转移至一个15毫升的塑料离心管中。然后，向装有心肌切片的管中加入5毫升溶于PBS的1%氯化三苯基四氮唑溶液，在37摄氏度水浴中孵育10分钟，并在5分钟后轻轻混匀。孵育结束后，用心肌切片用PBS至少洗涤2至3次，并准备进行图像采集。从颅骨中取出包括脑干在内的脑组织后，将脑组织腹面朝上置于脑切片矩阵中。根据动物的体重，选择合适尺寸的不锈钢脑切片矩阵。使用刀片固定脑组织的前部和后部。然后，将刀片部分插入第一片与最后一片刀片之间的槽道中。当所有刀片均插入并平行排列后，用手掌同时下压所有刀片，将脑组织切成2毫米厚的冠状切片。接着，用两根手指紧紧捏住刀片两侧，将刀片连同已切好的脑组织一并从切片模具中取出。将脑片逐一放置在托盘中，确保每片脑组织的内表面始终朝上。接着，向脑片上加入温热的1%氯化三苯基四氮唑溶液和PBS，于37°C避光孵育8分钟。孵育结束后，将脑片转移至蓝色塑料托盘中进行成像。将脑切片按从额叶到尾端的顺序排列，并使用解剖刀在矢状面上分离半球。染色后立即对组织切片进行拍照。将所选相机安装在支架上，确保电池已充电，插入存储卡并装好镜头。根据可用的光源，选择合适的白平衡设置，或按照相机说明书中的说明进行色温校准。将心脏切片完全浸入盛有 PBS 的容器中。将脑切片置于无 PBS 或其他液体的干燥托盘中进行排列。将装有切片的容器置于配备宏镜头的相机下方。确保所有切片完全位于视野范围内，并处于同一平面上。将相机调至全手动模式，设置 ISO 为 100，光圈为 F10。调整快门速度以获得最佳的图像曝光，并确保相机焦平面与样本放置表面平行。拍摄样本编号后，旋转圆形偏振滤光片直至反射光消失，使用遥控触发器拍摄组织切片图像，以防止快门释放时相机抖动；然后旋转切片，从另一侧拍摄图像。这张心肌梗死后经亚甲蓝和三苯基四氮唑氯化物染色的心脏切片照片，包含了足够的细节和颜色信息，可用于后续对梗死面积的平面测量分析。心脏组织冷冻24小时会影响其完整性，并降低线粒体功能。因此，心脏的氯化三苯基四氮唑染色并非呈现红色，而是呈淡粉色，且坏死组织与存活组织之间的边界模糊不清。在比较用于减少标本反射的两种方法中，浸没法是最有效的方法，可产生对比度良好且细节清晰的图像。偏振滤光片也有效果，但它会略微降低图像的分辨率和微对比度。未使用浸液或滤光片的心脏切片图像包含大量反射光，不适合进一步分析。在平面测量分析中，应将脑部未受影响的一侧与中风受影响的一侧进行比较。手动设置相机参数可确保所有图像的曝光和白平衡达到最佳，从而实现一致的分析。此处展示了心脏切片图像曝光过度和曝光不足的示例。此外，不正确的白平衡设置会导致图像偏蓝或偏黄，或出现品红色或绿色色偏。科学宏摄影需要可控的照明和适当的成像装置。标准化的方法可确保获得高质量、高细节的数字图像。该方法适用于所有实验性小型动物器官摄影。

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TTC染色，大鼠脑组织，缺血-再灌注损伤，组织切片，坏死组织，存活组织

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