仓鼠卵巢细胞的快速抗体糖工程

该方案可用于筛选多种糖基化酶对目标蛋白糖谱的影响，并有助于更好地了解酶的功能。该方案的性质允许以瞬时但高通量的方式筛选糖基化酶。糖基化谱的改变可以改善抗体活性，从而提高最终产品的功效。

生物制药公司密切监测糖基化作为关键质量属性。异常糖基化是癌症等疾病的标志。因此，这种方法与药理学和生物医学研究有关。

该协议假设用户具有几种实验技术的经验，包括哺乳动物细胞转染和蛋白质印迹。最好从较少的样本开始，并在第一个实例中使用停止点。首先评估中国仓鼠卵巢细胞的密度和活力。

然后，用70%乙醇和RNase抑制剂溶液仔细清洁生物安全柜和所有设备，以避免污染。接下来，将细胞以100倍G沉淀五分钟，并以每毫升细胞密度5倍10的细胞密度将其重悬于预热的培养基中。将八微升DsiRNA预混液或对照转移到无菌电穿孔比色皿中。

将800微升细胞悬浮液加入同一比色皿中，混合并传递电穿孔脉冲。然后，将细胞悬浮液从比色皿转移到六孔板的一个孔中，避免使用泡沫状材料。将细胞孵育10分钟而不摇动。

孵育后，加入800微升预热培养基，使最终体积达到每孔1.6毫升。在培养箱中培养转染的细胞，同时以150 RPM振荡。48小时后，收获上清液和细胞。

IgG纯化后，将洗脱液A加入到三千道尔顿分子量截止离心浓缩器中，并在4摄氏度下以13，300倍G离心40~50分钟。一旦残余体积等于或小于50微升，离心就完成了。弃去流通液，加入500微升预冷的1X PBS以稀释残留的上清液。

使用相同的条件再次离心样品，直到残留50微升残留上清液。为了获得100X稀释的上清液，加入500微升预冷的1X PBS并重复离心过程。将上清液浓缩到40微升中约每升约2.5克的最终浓度，以确保与聚糖分析方法的相容性。

对于聚糖分析，将200微升磁珠溶液转移到2毫升PCR管中。将其放在磁性支架上，将磁珠与上清液分离，并小心地除去上清液。然后，从磁性支架中取出试管，加入纯化的蛋白质样品和涡旋。

接下来，将供应变性缓冲液加入样品管中，并在60摄氏度下孵育8分钟。保持样品管打开，以获得最佳反应性能。孵育后，加入PNGase F并在60摄氏度下再孵育20分钟，以从纯化的抗体中切割聚糖。

释放N-聚糖后，关闭样品管并涡旋。然后，将乙腈加入样品管中，涡旋，并在室温下孵育一分钟。将样品管放在磁性支架中，以将磁珠与溶液分离。

然后，使用移液器，小心地除去上清液而不接触珠子。将含荧光团的聚糖标记溶液加入通风橱中的样品中，并通过涡旋混合。在60摄氏度下用打开的盖子孵育20分钟后，通过在乙腈中洗涤样品三次以除去多余的染料。

然后，在双蒸馏水中洗脱标记的聚糖。将样品管置于磁性支架中，并收集富含纯化和标记的聚糖的上清液。接下来，准备所有必需的标准品和样品并将其装载到指定的托盘位置。

运行聚糖分析方案，并使用适当的软件分析和鉴定样品中存在的聚糖。蛋白质印迹分析显示，用三种Fut8 DsiRNA构建体的混合物转染的细胞中Fut8蛋白表达降低。来自敲低细胞的聚糖结构也显示出岩藻糖基化减少。

这种趋势在无乳糖基化结构中最为明显，在半乳糖基化结构中观察到的程度较小。与单个方波脉冲相比，使用两个方波脉冲的电穿孔观察到核心岩藻糖基化减少两倍，而细胞活力没有显着差异。总体而言，增加短干扰RNA浓度对核心岩藻糖基化有很大的干扰，而不是增加收获时间。

水和乙腈之间的比例决定了聚糖是在溶液中还是在微球中。在洗涤步骤中记住这一点至关重要，以避免从溶液中意外去除标记的聚糖。后续实验可能涉及使用基于细胞的测定来表征纯化的单克隆抗体，以量化抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性。