Name: 在啮齿动物中实施微创脑肿瘤切除术以实现高活力组织采集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习微创脑肿瘤切除术在啮齿动物中的应用，结合自动化组织保存系统实现高活力组织采集。该技术支持术后动物存活，便于进行纵向疾病研究和治疗评估。

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所有动物实验均经马里兰大学和约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会批准。本研究采用6至8周龄的C57BL/6雌性小鼠。小鼠来自商业来源（见材料表）。所有操作均遵守生物安全二级（BSL-2）规定，包括佩戴口罩、手套和防护服。
1. 颅内肿瘤初始移植
<ol>
	<li>在研究的初始阶段，按照先前已发表的文献7，向每只小鼠颅内注射 100,000 个细胞（GL261 小鼠胶质瘤细胞系），细胞悬浮于 4 µL 磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，注射深度为 2.5 mm。</li>
	<li>在肿瘤植入后第 9 天，使用 in vivo 成像系统8 对每只小鼠的肿瘤信号进行定量。 
	注意：如有需要，可根据肿瘤负荷将小鼠分为两组。在本研究中，两组分别为：（1）肿瘤负荷相对较小的小鼠（平均生物发光信号 = 5.5e+006 ± 0.1e+006 光子/秒，n = 10）和（2）肿瘤负荷相对较大的小鼠（平均生物发光信号 = 1.69e+007 ± 0.2e+007 光子/秒，n = 10），（p &#60; 0.05，Mann-Whitney 检验）9。</li>
	<li>将每组再分为两个可比的亚组。 
	注意：在本研究中，两个亚组分别为：未治疗小鼠（n = 5）和接受 MIRS 手术切除肿瘤的小鼠（n = 5），（p &#62; 0.05，Mann-Whitney 检验）9。</li>
	<li>从切除手术当天开始，根据肿瘤生长模式，以相应的频率使用 in vivo 成像系统追踪肿瘤进展。 
	注意：对于 GL261 细胞系，应在切除手术当天开始追踪，并随后每 3–6 天进行一次。</li>
</ol>
2. 使用MIRS进行肿瘤切除
<ol>
	<li>使用异氟烷-氧气混合气体麻醉小鼠2 在诱导室中使用混合气体，或腹腔注射赛拉嗪/氯胺酮溶液。
	<ol>
		<li>若使用气体麻醉剂，将气体流速设置为1.0 mL/min，蒸发器浓度设置为2.0%，以进行麻醉诱导，通常在麻醉舱内需要3–5分钟（参见 材料表).</li>
		<li>若使用注射用麻醉剂，通过注射0.2 mL麻醉溶液（每千克体重80-100 mg氯胺酮和每千克体重10-12.5 mg赛拉嗪，参见 材料表腹腔内注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过捏压脚趾评估动物镇静是否充分。在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。在操作前给予镇痛剂（0.03–0.06 mg/kg 皮下注射布托啡诺）。</li>
	<li>将小鼠置于立体定位仪上（参见 材料表在确认完全麻醉后。 
	注意：如果使用气体麻醉剂，将小鼠的鼻部置于鼻罩中，使其持续吸入异氟烷-氧混合气体。2 操作过程中混合物的比例（1.5%）。</li>
	<li>移除之前的缝合钉，然后使用脱毛膏或剃须的方式去除毛发。使用氯己定/聚维酮碘溶液与酒精交替擦拭的方式对皮肤进行消毒。接着，用无菌手术刀沿先前的手术瘢痕做一条1 cm的纵行正中切口。</li>
	<li>通过载物台适配器/手柄架将MIRS手柄连接到立体定位臂上，以增强稳定性和精确性。</li>
	<li>设置MIRS仪器（参见 材料表) 使用以下设置（图1).
	<ol>
		<li>将电源线组插入后侧面板上的电源线插座。通过拨动开关打开或关闭系统电源（1 = 开，0 = 关）。</li>
		<li>将氮气管的一端（随控制台提供）插入控制台背面面板上的公头接头中。顺时针旋转连接螺母以拧紧连接。 
		注意：软管的另一端需连接至氮气供应源。</li>
		<li>在将软管连接至氮气供应源之前，需确认供应压力不超过100 psig，此为设备控制台推荐的输入供应压力。 
		注意：当脚踏板启动后，控制台在接通氮气供应时将自动产生负压。</li>
		<li>固定真空端口的盖子并进行密封，以避免真空系统出现任何泄漏。抽吸系统中的任何泄漏都会影响MIRS控制台的性能。</li>
		<li>如果在设置或引物过程中吸力低于17，请检查控制台前面的吸力旋钮是否已调至最大值（100），确保吸力系统无泄漏，并确认氮气输入压力正确。</li>
		<li>将灰色脚踏板插头插入控制台上的灰色插座中，直至发出咔嗒声并牢固就位。 
		注意：脚踏开关连接器以特定方向与控制台连接，且具有防错键设计。</li>
		<li>将蓝色手柄连接器插入其对应的蓝色插孔中，直至听到咔嗒声并牢固就位，以完成手柄与主机的连接。 
		注意：手柄连接器以特定方向与控制台连接，且具有定位键。</li>
		<li>使用系统前，应先对每个手柄进行预冲洗：从小碗中吸取无菌液体，经由开口、管路和手柄，最终进入集液瓶，以确保管路和手柄内部得到润滑，从而减少组织堵塞的发生。</li>
		<li>通过控制面板选择仅抽吸或抽吸结合切割模式，然后使用脚踏板启动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将23 G MIRS套管插入钻孔，深度为2.5 mm。</li>
	<li>通过踩下与套管相连的脚踏板启动切除过程。使用手柄上的控制旋钮完成一个或多个完整的切除循环（360°）。 
	注意：进行的循环次数越多，切除的肿瘤组织体积越大。</li>
	<li>切除过程完成后，将23 G MIRS套管从钻孔中撤出，并用5 mL的1×PBS冲洗管路，以清除任何残留碎屑。</li>
	<li>将小鼠从立体定位仪上取下，并使用钉皮器或4-0缝合材料缝合伤口（参见 材料表).</li>
	<li>将小鼠放于加热垫上或保温灯下，待其从麻醉状态恢复后再放回笼中。</li>
	<li>实验结束后，冲洗导管 通过 灌流。交替使用冷培养基和空气 &#34;推&#34; 将所有切除的组织放回收集罐中。从系统上取下收集罐，并用提供的盖子盖紧。</li>
	<li>完成步骤 2.12 后，将套管的远端尖端插入 3% H2O2 以24–25 in Hg的负压抽吸，使吸液管路回抽至吸引收集瓶，并静置60–90秒。使用无菌培养基间歇性地脉冲式通入空气和培养基进行冲洗。</li>
	<li>观察小鼠术后是否出现任何神经学症状（如异常的抽搐运动或癫痫发作）。</li>
	<li>对出现严重神经功能缺损（表现为嗜睡、消瘦外观、弓背或运动失调）的小鼠实施安乐死。 
	注意：本研究中，使用200 mg/kg的市售安乐死溶液（参见 材料表用于对每只小鼠实施安乐死。</li>
</ol>
3. 组织采集 通过 TPS
<ol>
	<li>将肿瘤样本浸入含有红细胞裂解液的组织培养皿中（参见材料表），在室温下孵育5分钟。 
	注意：从MIRS获取并转移至TPS的组织主要以单细胞形式存在，同时伴有少量组织碎片。</li>
	<li>将一个70 µm滤膜（参见材料表）置于50 mL锥形管上，使用5 mL注射器的推杆将肿瘤样本通过滤膜。</li>
	<li>用移液管吸取RPMI-1640培养基，协助细胞及任何组织团块通过滤膜。</li>
	<li>在4 °C条件下，以428 × g离心5分钟，随后用移液器弃去上清液。</li>
	<li>将每份样本重悬于5 mL预先配制的RPMI-1640培养基中。</li>
	<li>为提高组织活性，特别是当初始观察到较大组织团块时，向每份样本中加入所需体积的酶混合液（包含DNAse I、胶原酶IV、分散酶、木瓜蛋白酶和EDTA，参见材料表），使用涡旋振荡器混匀。 
	注意：步骤3.6为可选步骤。酶混合液的组成（每份样本总体积为5 mL）：DNAse I II型300 µL，胶原酶/分散酶150 µL（可切割纤连蛋白、胶原酶IV、I及非极性氨基酸），木瓜蛋白酶250 µL（非特异性蛋白酶），0.5 M EDTA 6 µL。</li>
	<li>将样本置于摇床培养箱中，在200 rpm、37 °C条件下孵育20分钟。</li>
	<li>孵育20分钟后，在4 °C条件下以428 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将单细胞悬液通过70 µm细胞滤网过滤，并在4 °C条件下以274 × g离心3分钟。使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞活力分析10（参见材料表）。 
	注意：第0天的细胞活力范围为30%–70%，并在2–3天内显著提高。</li>
	<li>根据所需的活力检测方法，继续进行步骤4、5或6。</li>
</ol>
4. 贴壁培养细胞的培养
<ol>
	<li>在经过认证的层流罩中，用含血清的贴壁培养基（如DMEM、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）溶液）重悬细胞沉淀，并将细胞接种至贴壁细胞培养瓶中。</li>
	<li>将细胞置于受控的培养环境（37 °C，5% CO2）中培养。</li>
</ol>
5. 悬浮培养细胞（神经球）
<ol>
	<li>在经过认证的层流罩中，用无血清的完全干细胞培养基11重悬细胞沉淀，并接种至悬浮培养瓶中。</li>
	<li>将细胞置于受控的培养环境（37 °C，5% CO2）中培养 2–3 天，以促进神经球的形成。</li>
	<li>在培养基中观察到神经球后，使用胰蛋白酶-EDTA 或 Accutase（见材料表）处理，获得单细胞悬液用于传代。 
	注意：只要在收获过程中格外小心，并使用支持神经干细胞生长的适当培养基，收获组织中的干细胞应在数天内形成神经球。</li>
</ol>
6. 准备用于重新植入的细胞
<ol>
	<li>用4 µL的1x PBS重悬沉淀，浓度为每4 µL含100,000个活细胞。</li>
	<li>立即采用颅内肿瘤植入法（步骤1）注射到未处理小鼠体内。</li>
</ol>
7. 组织学分析
<ol>
	<li>切除后立即取出脑组织，并用4%多聚甲醛（PFA）固定24小时12。</li>
	<li>将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，直至其充分浸透蔗糖（沉降至容器底部）。</li>
	<li>将脑组织转移至70%乙醇溶液中。</li>
	<li>按照先前发表的文献方法进行石蜡包埋、切片及标准苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色13。 
	注意：用于染色的每个切片厚度为10 µm。</li>
</ol>

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</ol>

BT 获得了美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助，是 Accelerating Combination Therapies* 的共同所有人，且 Ashvattha Therapeutics 公司已获得其一项专利的授权。GW 获得了 NIH 资助（R01NS107813）。HB 担任 Insightec 公司的付费顾问，并担任该公司医学顾问委员会主席。此安排已根据约翰斯·霍普金斯大学的利益冲突政策进行了审查并获得批准。HB 获得了 NIH、约翰斯·霍普金斯大学以及慈善资金的研究资助，并担任 CraniUS、Candel Therapeutics, Inc.、Accelerating Combination Therapies*、Catalio Nexus Fund II, LLC*、LikeMinds, Inc*、Galen Robotics, Inc.* 和 Nurami Medical* 的顾问。（*包括股权或期权）。

肿瘤切除术是神经外科肿瘤学治疗低级别和高级别脑肿瘤患者的核心手段。脑肿瘤患者的细胞减灭和肿瘤去瘤体积与神经功能改善及总体生存率提高密切相关1,2,5,6。尽管既往已有文献描述过啮齿类动物模型中的手术切除方案，但这些方案存在若干局限性，可能干扰实验结果的可靠性以及临床前模型的整体可转化性。例如，以往报道的手术切除方案通常包括开颅术，需钻3-4个小型骨孔以形成骨瓣，随后依靠研究者经验对肿瘤组织与正常脑组织在颜色和质地上的差异进行细致辨别和区分6。此类操作耗时较长，且要求研究人员具备熟练使用手术显微镜、操作手术器械、识别肿瘤边界相对于周围正常脑组织的能力，并能实现充分的止血。此类操作常导致显著的失血及动物死亡。此外，在同一实验中，不同动物间实现切除肿瘤体积一致的标准化切除具有挑战性。当由多名操作人员共同执行该操作时，这种连续性和一致性更加难以...

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤。尽管近年来在神经外科、靶向药物开发和放射治疗方面取得了进展，但GBM患者的5年生存率仍低于5%，这一数据在三十多年间未得到显著改善1。因此，亟需开发更有效的治疗策略。
为了开发新的治疗方法，人们越来越清楚地认识到，研究性方案需要做到以下三点：（1）采用可转化的临床前模型，准确地再现肿瘤的异质性和微环境；（2）模拟目前胶质母细胞瘤（GBM）患者所采用的标准治疗方案，即包括手术、放疗和化疗在内的综合治疗；（3）考虑切除的肿瘤核心组织与残留的侵袭性肿瘤组织之间的差异2,3,4,5。&#160;然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型要么未实施手术切除，要么采用的手术切除模型相对耗时，导致大量失血或缺乏标准化。此外，由于缺乏与临床相当的手术器械或操作规程，以及缺乏系统性组织采集的成熟平台6（表1），啮齿类动物脑肿瘤的切除手术实施起来具有挑战性。
本方案旨在描述一种使用多功能非消融性微创切除系统（MIRS）和集成化组织保存系统（TPS）对啮齿类动物脑肿瘤进行切除及组织保存的标准化操作范式（图1）。预计这一独特技术将为胶质母细胞瘤（GBM）及其他类型脑肿瘤模型的临床前研究提供一个可广泛采用的标准化平台。研究脑肿瘤治疗或诊断方法的研究人员可在其研究中采用本方案，以实现标准化的肿瘤切除操作。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>PharmCo</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>CoStar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>70 微米滤膜</td><td>Fisher</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore Sigma</td><td>SIG-SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Anased（赛拉嗪注射液，100 mg/mL）</td><td>Covetrus</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>Patterson Scientific</td><td>78935903</td><td></td></tr><tr><td>麻醉废气收集容器</td><td>Patterson Scientific</td><td>78909457</td><td></td></tr><tr><td>实验台防护垫</td><td>Covidien</td><td>10328</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6，6-8 周龄小鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td>品系编号 027</td><td></td></tr><tr><td>ChroMini Pro</td><td>Moser</td><td>型号 1591-Q</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶-分散酶</td><td>Roche</td><td>#10269638001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 血细胞计数板</td><td>Thermo Fisher</td><td>A25750</td><td></td></tr><tr><td>去碎片溶液</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>#130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12 培养基</td><td>Corning</td><td>10-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Posi-Click</td><td>1149K01</td><td></td></tr><tr><td>安乐死溶液</td><td>Henry Schein</td><td>71073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林</td><td>Invitrogen</td><td>INV-28906</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Henry Schein</td><td>101-4336</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>PeproTech EC</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>hFGF-b</td><td>PeproTech EC</td><td>1001-18B</td><td></td></tr><tr><td>诱导室</td><td>Patterson Scientific</td><td>78933388</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发器</td><td>Patterson Scientific</td><td>78916954</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Covetrus</td><td>11695-0703-1</td><td></td></tr><tr><td>Kopf 立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Lightfield 显微镜</td><td>BioTek</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>微量注射装置</td><td>Kopf</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>微型电机钻</td><td>Foredom</td><td>F210418</td><td></td></tr><tr><td>MRI 系统</td><td>Bruker</td><td>7T Biospec Avance III MRI 扫描仪</td><td></td></tr><tr><td>NICO Myriad 系统</td><td>NICO Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Puralube vet ointment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#P4762</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>#14190250</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Millipore Sigma</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;#P4937</td><td></td></tr><tr><td>移液管控制器</td><td>Falcon</td><td>A07260</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Aplicare</td><td>52380-1905-08</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P-8783</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>INV-72400120</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Covetrus</td><td>7319</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>皮肤标记笔</td><td>Time Out</td><td>D538,851</td><td></td></tr><tr><td>缝钉拆除器</td><td>MikRon</td><td>ACR9MM</td><td></td></tr><tr><td>缝合器</td><td>MikRon</td><td>ACA9MM</td><td></td></tr><tr><td>缝钉</td><td>Clay Adams</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>缝线，Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>J494H</td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>83-3911-002</td><td></td></tr><tr><td>TheraPEAKTM ACK 裂解缓冲液（1x）</td><td>Lonza</td><td>BP10-548E</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Corning</td><td>MDT-25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

在啮齿类动物中实施微创脑肿瘤切除以实现高活性组织采集

Implementation of Minimally Invasive Brain Tumor Resection in Rodents for High Viability Tissue Collection

本方案描述了一种用于啮齿类动物脑肿瘤切除及组织保存的标准化操作范式。在临床实践中，最大程度切除肿瘤是大多数脑肿瘤的标准治疗方案。然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型未包含肿瘤切除步骤，或采用的手术切除模型耗时较长，且易导致显著的术后并发症、死亡率或实验结果变异。此外，由于缺乏与临床实践相匹配的手术器械或操作流程，以及缺少标准化组织采集平台，啮齿类动物的肿瘤切除手术对研究者而言具有较大挑战。本方案重点介绍一种多功能、非消融性切除装置及其配套的组织保存系统，该系统源自临床版本设备并经适应性改良。本研究所采用的设备在开口端集成了可调节吸力与圆柱形刀片，可精确探查、切割并吸除组织。该微创切除装置通过协同作用实现其功能 通过 最初植入肿瘤时所用的同一个颅骨钻孔。该方法可最大限度减少活检或切除手术过程中对局部解剖结构的改变，并降低大量失血的风险。这些因素显著缩短了手术时间&#60;每只动物约2分钟），提高术后动物存活率，降低实验组间的变异性，并确保切除组织和细胞具有高活性，可用于后续分析。该过程得益于刀片速度约为1,400周期/分钟，可将组织采集至一个无菌封闭系统中，该系统可充入选定的生理溶液。鉴于手术影响、区域化肿瘤切除标本的保存与严格对比分析，以及腔内给药治疗研究日益重要的地位，这一独特方案将拓展探索脑肿瘤患者围手术期管理及治疗发现中尚未解答问题的机会。

使用MIRS进行手术切除可显著减少肿瘤负荷 
在肿瘤负荷较小的组中，接受切除术的亚组其基线平均生物发光信号为 5.5e+006 光子/秒 ± 0.2e+006。切除术后，平均生物发光信号下降至 3.09e+006 光子/秒 ± 0.3e+006（p &lt;0.0001，Mann-Whitney 检验）9 （图2）。随后数天内生物发光信号逐渐上升，直至小鼠被实施安乐死。同样，在肿瘤负荷较大的组中，接受切除术的亚组其基线平均生物发光信号为 1.68e+007 光子/秒 ± 0.1e+007。切除术后，平均生物发光信号下降至 5.19e+006 光子/秒 ± 0.2e+006（p &lt;0.0001，Mann-Whitney 检验）9。随后数天内生物发光信号同样逐渐上升，直至小鼠被实施安乐死。
使用 MIR...

本方案描述了一种通过微创方法结合组织保存系统对啮齿类动物脑肿瘤进行标准化切除的操作流程。该技术对于在啮齿类及其他动物模型中准确模拟临床治疗标准具有重要意义。

本方案描述了一种用于啮齿类动物脑肿瘤切除及组织保存的标准化操作范式。在临床实践中，最大程度的肿瘤……

这是一种在脑肿瘤治疗药物的临床前研究中迫切需要的脑肿瘤切除范式。该方法可通过微创方式实现标准化切除，同时结合自动化组织保存系统。本方案允许动物在手术后存活，从而有助于在同一个体中研究治疗后疾病状态的变化。这有助于进行顺序性和时间推移的治疗应用。利用该技术，我们可以评估疾病的生物学特性，并规划可能的后续管理方案。这在药物发现和新型治疗手段方面具有重要意义和广阔前景。标准化切除、微创方法和自动化组织保存等概念可推广至其他器官系统的肿瘤类型，例如肝肿瘤和头颈部肿瘤。该方案操作简便，系统易于使用。建议阅读已发表的方案，其中包含所有必要步骤及故障排除方法。通过轻捏小鼠脚趾评估其是否已进入麻醉状态，开始实验。在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。随后，将小鼠固定于立体定位仪上。拆除先前手术的缝合钉，并使用氯己定或甜菜碱类消毒剂与酒精交替擦拭对皮肤进行消毒。然后使用无菌手术刀沿先前手术瘢痕做一条一厘米长的纵行正中切口。通过支架适配器将MIRS手柄连接至立体定位臂上。设置MIRS仪器时，将后侧面板上的电源线组插入电源线插座中。通过在零和一之间切换，打开或关闭系统电源。将氮气管的一端插入控制台后侧面板上的公接头中。顺时针旋转连接螺母以拧紧。确保供气压力不超过 100 PSIG，并将软管连接至氮气源。密封真空口的盖子，以避免任何泄漏。检查控制台前面的抽吸旋钮是否已设置为100，抽吸系统无泄漏，且氮气输入压力正确。将灰色脚踏板插头插入灰色插座，直至发出咔嗒声。以同样方式，将蓝色手柄插头插入蓝色插座。通过管路和手柄从管口吸入无菌液体，再进入收集瓶，对每个手柄进行预冲洗，以确保管路和手柄内部得到润滑。在控制台前面板上选择抽吸模式，并使用脚踏板启动。将23-G MIRS套管插入钻孔，深度达2.5毫米。通过按压连接到套管的脚踏板启动切除过程。使用手柄上的控制旋钮执行完整的切除循环。切除过程完成后，撤出23号MIRS套管，并加入5毫升1×PBS冲洗管路，以清除任何残留的碎屑。然后，使用缝合钉关闭切口，并将小鼠从立体定位仪上取下。将小鼠放回加热垫上，使其从麻醉状态恢复，之后再放回笼中。实验结束后，用冷的培养基和空气冲洗套管，以将所有切除的组织推回收集罐中。从系统上取下收集罐并盖上盖子。接着，将套管的远端插入3%过氧化氢溶液中，启动负压吸引，使负压管路回流至负压收集罐。静置60至90秒，并间歇性地脉冲式通入空气和介质以冲洗管路。将肿瘤样本浸入含有红细胞裂解液的组织培养皿中，在室温下孵育五分钟。然后将一个70微米的滤网置于50毫升锥形管上，使用注射器活塞将肿瘤样本推过滤网。用移液管吸取RPMI 1640培养基，冲洗滤网，使细胞及任何组织碎片通过滤网。在4°C条件下，以428 × g离心5分钟。弃去上清液，将每份样品重悬于5 mL制备好的RPMI 1640培养基中。将样品置于摇床培养箱中，在37°C、200 rpm条件下孵育20分钟。孵育后，在4℃条件下以428 × g离心5分钟，弃去上清液。通过70微米细胞筛过滤单细胞，然后在4℃条件下以274 × g离心3分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板进行细胞活力分析。在小鼠中使用MIRS进行手术切除后，无论肿瘤负荷较大或较小的组别，其平均基线生物发光信号均显著降低，表明肿瘤负荷明显减少。与术前肿瘤的MRI图像相比，术后扫描中可在肿瘤接种部位观察到一个大而圆的低信号区域，即为切除腔。在H&E染色切片中，可见清晰的圆形切除腔，其边缘伴有血液产物、炎症细胞以及残留的肿瘤细胞。当对切割孔进行两次旋转时，切除体积显著增加，从而可根据肿瘤负荷优化切除体积。通过MIRS进行肿瘤切除的小鼠与未治疗肿瘤的小鼠生存期比较显示，在小肿瘤组中，生存期从16天延长至22天。同样，在肿瘤负荷较大的组中，中位生存期从12天增加到19天。从组织保存系统中采集的样本在第0天的光学显微镜图像中显示为单个细胞，并伴有少量微小组织碎片。七天后，通过MIRS收获的细胞在悬浮培养中显示出神经球的形成，表明其具有肿瘤启动潜能。操作结束后必须立即清洗并冲洗管路系统，以避免系统堵塞。采用该操作流程后，可在使用微创切除系统进行手术切除后存活的动物身上开展治疗药物的有效性研究，以及诊断和预后标志物的相关研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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来源：Alomari, S.，等．在啮齿类动物中实施微创脑肿瘤切除以实现高活性组织采集．J. Vis. Exp.

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激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

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