Name: 从哺乳动物细胞中提取修饰的微管以通过冷冻电子显微镜研究微管 - 蛋白质复合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习从哺乳动物细胞中提取修饰微管的方法，用于冷冻电子显微镜研究微管-蛋白质复合物结构。该方案简单经济，可获得高质量均一微管样品，助力细胞生物学机制研究。

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我们感谢Sixma、Brummelkamp和Perrakis课题组的所有成员，感谢他们富有成效的科学讨论以及营造的愉快工作环境；特别感谢Jan Sakoltchik（&#34;person 2&#34;）协助确定了图3C中所示的蛋白浓度。我们还要感谢荷兰癌症研究所（NKI）冷冻电镜平台以及莱顿大学荷兰电子显微学中心（NeCEN）提供的支持。本研究得到了荷兰科学研究组织（NWO）Vici项目资助（编号016.Vici.170.033），授予T.R.B.。A.P.和T.R.B.为Oncode研究所研究员，研究经费来自荷兰科学研究组织ENW（OCENW.M20.324）。L.L.获得奥地利科学基金（FWF JB4448-B）资助。本研究还得到了荷兰癌症协会的机构资助以及荷兰卫生、福利与体育部的支持。

注意：有关本实验方案中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 细胞培养
注意：所有细胞培养操作均应在无菌的层流罩中进行。
<ol>
	<li>按照本方案，首先解冻一个&#160;37℃冷冻细胞小瓶 &#176;C 水浴。此处，我们使用一种经过基因改造的 HCT116 细胞系，该细胞系缺乏已知的三种去酪氨酸化酶 VASH1、VASH2 和 MATCAP，用于制备酪氨酸化微管蛋白。</li>
	<li>准备一个 &#216; 含10 mL适当细胞培养基的10 cm培养皿 
	注意：本方案中，使用添加了10% v/v FCS（胎牛血清）和青霉素/链霉素抗生素的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）（培养基），用于培养经基因改造的HCT116细胞系。</li>
	<li>计数细胞，并接种约 2.5 &#215; 106 活细胞（约20%汇合度）接种于已准备好的10 cm培养皿中。轻轻摇晃培养皿使细胞均匀分布。将培养皿置于37℃培养箱中孵育。 &#176;含5%（v/v）CO₂的细胞培养箱2 待细胞生长至80%–90%融合度。 
	注：对于 HCT116 细胞，通常需要 3 天，但具体时间可能因接种密度和所用细胞系的不同而有所差异。</li>
	<li>使用移液器或真空抽吸装置弃去细胞培养基，并用 5 mL PBS 洗涤培养皿 2 次。 
	&#8203;注意：加入 PBS 时应避免用力过猛冲击细胞单层，以免导致细胞从培养板上脱落。</li>
	<li>加入1-2 mL胰蛋白酶，将细胞置于培养箱中孵育2-5分钟，以使细胞脱落。</li>
	<li>向培养板中加入 2 mL 培养基以终止胰蛋白酶反应。</li>
	<li>将细胞悬液均分为三至五份，重新接种至培养基中以扩增细胞，直至获得6-12个汇合的15 cm培养皿。</li>
</ol>
2. 收获
<ol>
	<li>用 10 mL 磷酸盐缓冲液（1×）轻轻洗涤细胞，以去除任何细胞培养基。</li>
	<li>将细胞与 3 mL 含 5 mM EDTA（无菌/过滤）的冰浴 PBS 在室温下孵育 5 分钟，随后使用细胞刮刀使细胞从培养板上脱离。</li>
	<li>将细胞收集至冰上的 50 mL 离心管中，并离心（10 分钟，250 × g）。
	<ol>
		<li>使用 50 mL 离心管上的体积刻度记录收获细胞的体积。 
		&#8203;注意：收获细胞体积通常在约 0.5 mL 至 4 mL 之间。暂停步骤：将细胞沉淀在液氮中速冻，并在 −20 °C 下保存直至使用。请注意，细胞沉淀仅可保存数周至数月。若保存时间更长，可能导致微管产量降低或完全无法获得微管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微管提取
注意：步骤 3.1 至 3.5 的所有操作需保持在冰上；从步骤 3.6 开始的所有操作应保持温暖（30–37 °C）。
<ol>
	<li>准备 10 mL 冰冷的裂解缓冲液，其中含有 100 mM PIPES/KOH (pH 6.9)、2 mM EGTA/KOH、1 mM MgCl2、1 mM PMSF 和一片蛋白酶抑制剂（mini型）。</li>
	<li>用体积比为 1:1 的裂解缓冲液重悬收集的细胞沉淀（若不确定确切体积，宁可使用较少的裂解缓冲液，而非过多）。</li>
	<li>通过超声处理裂解细胞：超声 15 秒，间歇 45 秒，振幅 30，共进行四个循环（具体条件需根据实验确定，并依据所用超声仪进行调整）。
	<ol>
		<li>超声处理后，取样用于 SDS-PAGE 分析：2 µL 裂解液 + 18 µL 水 + 5 µL 5x SDS 上样缓冲液。 
		注意：在标准光学显微镜下检查细胞是否已完全裂解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将裂解后的细胞转移至离心管中，在超速离心机转子中于 4 °C 下以 100,000 × g 离心 1 小时，以澄清裂解液。 
	注意：确保转子所有孔位干燥且清洁，以保证离心机正确平衡。</li>
	<li>使用注射器小心吸取上清裂解液，注意不要扰动沉淀及顶部的浮层。
	<ol>
		<li>取一份澄清裂解液样品：2 µL 裂解液 + 18 µL 水 + 5 µL 5x SDS 上样缓冲液。</li>
		<li>小心冲洗沉淀，并用 P10 移液枪头在沉淀中轻轻旋转，取少量沉淀；加入 200 µL 水和 50 µL SDS 缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向上一步所得上清液中加入 1 mM GTP 和 20 µM 紫杉醇，以促进微管聚合；对于 1 mL 体积，加入 10 µL 2 mM 紫杉醇和 10 µL 100 mM GTP。 
	警告：紫杉醇可能引起皮肤刺激、严重眼损伤、呼吸道刺激、遗传缺陷、对胎儿造成损害以及器官损伤。长期或反复接触会导致器官损害。切勿吸入、喷洒或产生粉尘。操作时应佩戴腈橡胶手套，防止皮肤接触。</li>
	<li>将添加了 GTP 和紫杉醇的上清液在 37 °C 下孵育 30 分钟，使微管充分组装。</li>
	<li>在孵育期间，使转子和超速离心机预热至 30 °C。</li>
	<li>制备垫层缓冲液：将 0.6 mL 甘油加入 0.4 mL 裂解缓冲液中，并补充 20 µM 紫杉醇。将垫层缓冲液预热至 37 °C。</li>
	<li>向超速离心管中加入 800 µL 垫层缓冲液，然后小心地将含 GTP 和紫杉醇的裂解液上清液加至垫层缓冲液上方。 
	注意：移液时务必轻柔，避免垫层缓冲液与裂解液混合。</li>
	<li>在超速离心机转子中于 30 °C 下以 100,000 × g 离心 30 分钟。标记离心管朝外的一侧，以便识别微管沉淀形成的位置。</li>
	<li>使用移液器小心移除垫层缓冲液，注意不要扰动微管沉淀。
	<ol>
		<li>取一份垫层缓冲液样品：2 µL + 18 µL 水 + 5 µL 5x SDS 上样缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用温热的裂解缓冲液小心洗涤沉淀 3 次，以去除甘油。将温热缓冲液轻轻加至沉淀旁边（避免直接冲刷沉淀），轻轻旋转离心管数次，尽可能去除沉淀及管壁上的甘油，然后吸除液体并重复该步骤。 
	注意：若甘油未充分洗去，电镜观察时载网会迅速熔化，可能导致颗粒剧烈移动，产生模糊图像。</li>
	<li>制备重悬缓冲液，成分如下：100 mM PIPES/KOH (pH 6.9)、2 mM EGTA/KOH 和 1 mM MgCl2，并将缓冲液预热至 37 °C。</li>
	<li>用剪切过的枪头在约 50 µL 预热的重悬缓冲液中轻柔重悬已洗涤的沉淀，并将离心管保持在 37 °C。
	<ol>
		<li>取一份重悬后的沉淀样品：2 µL + 18 µL 水 + 5 µL 5x SDS 上样缓冲液。 
		&#8203;提示：剪切枪头可防止微管断裂。准备一个预热至 37 °C 的金属加热块，并将其置于聚苯乙烯盒中，以便在不使样品管冷却至室温的情况下方便转移。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 冷冻电镜载网制备
<ol>
	<li>安装冷冻载网装置的吸水纸，将冷冻载网装置预热至 30 °C，并将湿度设置为 100%。静置约 30 分钟，使温度和湿度达到平衡。</li>
	<li>将冷冻载网装置的设置调整为两次加样，并运行一次完整程序，以确认各项参数设置正确。确保第一次加样的压力为 10， blot 时间为 2 秒，等待时间为 0 秒；第二次加样的压力为 10，blot 时间为 6.5 秒，等待时间为 10 秒。</li>
	<li>在 30 mA 条件下对 cryo-EM 载网进行辉光放电处理，持续 60 秒。</li>
	<li>使用液氮（LN2）冷却聚苯乙烯容器组件，并通过将乙烷气体冷凝至低温金属杯中制备液态乙烷。</li>
	<li>配制稀释缓冲液，成分如下：100 mM PIPES/KOH（pH 6.9）、2 mM EGTA/KOH 和 1 mM MgCl2，并将缓冲液预热至 37 °C。</li>
	<li>在加样至载网前，将微管相互作用蛋白用稀释缓冲液按 1:1 v/v 比例稀释，以确保降低盐浓度（我们使用的最终 NaCl 浓度为 50 mM）。将混合液保持在 37 °C。</li>
	<li>用冷冻镊子夹取一张已进行辉光放电处理的载网，并将其固定在冷冻载网装置中。</li>
	<li>将装有液态乙烷的聚苯乙烯容器放入冷冻载网装置中，运行预设程序：首先向载网上加样 3.5 µL 微管溶液，让冷冻载网装置对载网进行 blot 处理；随后立即加样 3.5 µL 新鲜稀释的蛋白溶液；最后，让装置完成 blot 并将载网迅速浸入液态乙烷中实现快速冷冻。</li>
	<li>将冷冻后的载网转移至载网储存盒中，并置于液氮（LN2）杜瓦瓶中保存，直至进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li>
<li>Peris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-dependent+microtubule+disassembly+driven+by+tubulin+tyrosination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination.</a> Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).</li>
<li>McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cytoplasmic+dynein+motility+by+dynactin-cargo+adapter+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes.</a> Science. 345 (6194), 337-341 (2014).</li>
<li>Barisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+detyrosination+guides+chromosomes+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis.</a> Science. 348 (6236), 799-803 (2015).</li>
<li>Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microtubule+motors+by+tubulin+isotypes+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications.</a> Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).</li>
<li>Nogales, E., Kellogg, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+the+high-resolution+cryo-EM+visualization+of+microtubules+and+their+binding+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).</li>
<li>Manka, S. W., Moores, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+structure+by+cryo-EM%3A+Snapshots+of+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability.</a> Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).</li>
<li>Chaaban, S., Carter, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dynein-dynactin+on+microtubules+shows+tandem+adaptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding.</a> Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).</li>
<li>Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+of+dynein+microtubule-binding+domains+shows+how+an+axonemal+dynein+distorts+the+microtubule%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule.</a> eLife. 8, 47145(2019).</li>
<li>Walton, T., Wu, H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+microtubule-bound+axonemal+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure of a microtubule-bound axonemal dynein.</a> Nature Communications. 12, 477(2021).</li>
<li>Sindelar, C. V., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic-level+mechanism+for+activation+of+the+kinesin+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).</li>
<li>Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+origin+of+microtubule+dynamic+instability+and+its+modulation+by+EB+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins.</a> Cell. 162 (4), 849-859 (2015).</li>
<li>Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBs+Recognize+a+nucleotide-dependent+structural+cap+at+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends.</a> Cell. 149 (2), 371-382 (2012).</li>
<li>Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+the+structural+basis+of+microtubule+depolymerization+by+kinesin-13s%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s.</a> Nature Communications. 9, 1662(2018).</li>
<li>Kellogg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+model+of+microtubule-tau+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Near-atomic model of microtubule-tau interactions.</a> Science. 360 (6394), 1242-1246 (2018).</li>
<li>Brotzakis, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+ensemble+of+a+Tau-microtubule+complex+reveals+regulatory+Tau+phosphorylation+and+acetylation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms.</a> ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).</li>
<li>Kellogg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+distinct+mechanisms+of+action+of+taxane+and+non-taxane+microtubule+stabilizers+from+cryo-EM+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).</li>
<li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+assembly+purification+of+microtubules+without+assembly-promoting+agents+and+further+purification+of+tubulin%2C+microtubule-associated+proteins%2C+and+MAP+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments.</a> Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+tubulin+and+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of tubulin and cilia.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), 028159(2017).</li>
<li>Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+detyrosination+cycle%3A+Function+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes.</a> Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).</li>
<li>Nieuwenhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasohibins+encode+tubulin+detyrosinating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vasohibins encode tubulin detyrosinating activity.</a> Science. 358 (6369), 1453-1456 (2017).</li>
<li>Aillaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasohibins%2FSVBP+are+tubulin+carboxypeptidases+%28TCPs%29+that+regulate+neuron+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation.</a> Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).</li>
<li>Landskron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modification+of+microtubules+by+the+MATCAP+detyrosinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase.</a> Science. 376 (6595), (2022).</li>
<li>Erck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vital+role+of+tubulin-tyrosine-ligase+for+neuronal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).</li>
<li>Pagnamenta, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+tubulin+detyrosination+causes+structural+brain+abnormalities+with+cognitive+deficiency+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).</li>
<li>Peris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+tyrosination+regulates+synaptic+function+and+is+disrupted+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease.</a> Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li>
<li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+porcine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from porcine brain.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 15-28 (2011).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+posttranslational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61826(2020).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Li, G., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+at+low+temperature%3A+evidence+that+tubulin+recycling+limits+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).</li>
<li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics%3A+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22GMPCPP.+Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue.</a> GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li>
<li>Sindelar, C. V., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+kinesin%27s+force-generating+cycle+visualized+at+9-%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution.</a> Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).</li>
<li>Kellogg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+cryo-EM+structure+of+PRC1+bound+to+the+microtubule%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).</li>
<li>Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP%CE%B3S+microtubules+mimic+the+growing+microtubule+end+structure+recognized+by+end-binding+proteins+%28EBs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).</li>
<li>Manka, S. W., Moores, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-repeats+in+doublecortin+make+distinct+mechanistic+contributions+to+microtubule+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51534(2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方法描述了如何快速从细胞系中提取内源性微管蛋白，并随后在冷冻电镜载网上对这些微管进行制备。微管具有温度敏感性：在低温环境下会解聚，而在温暖环境中则会聚合31。因此，超声处理和初步离心澄清步骤（步骤1.1–1.5）必须在4 °C下进行，以使微管蛋白溶解。如果某些因素对微管的稳定作用非常强，导致其在此步骤中无法解聚，则这些微管及其稳定因子将在初始澄清离心后被保留在沉淀中而被弃除。在微管（重新）聚合之后，必须始终将含有聚合微管的溶液保持在温暖条件下。我们从HCT116细胞中提取了微管，这些细胞缺乏VASH1、VASH2和MATCAP蛋白。其他细胞系以及组织也可用于微管提取29，但其污染物、微管蛋白异构体及产量可能与本文所述存在显著差异。此外，可通过过表达携带修饰酶的质粒，引入特定的微管蛋白修饰。
其他方案18,27,28,29,30通过多次微管聚合与去聚合循环，获得不含其他相互作用蛋白的微管。本文中，我们对该方案进行了简化，仅进行一次微管聚合。由于仅进行单次聚合，这些微管可能与其它微管相互作用蛋白共沉淀。然而，我们发现该方案所获得的微管已足够满足冷冻电镜（cryo-EM）实验的需求。若特定实验需要更高纯度的样品，可增加聚合与去聚合循环次数以获得更纯的微管，但可能会降低微管的得率。本方案中，我们使用紫杉醇（paclitaxel）诱导微管聚合。然而，紫杉醇可能使微管晶格偏向特定的扭转和上升构象，从而干扰目标蛋白与微管的结合亲和性。若紫杉醇不适用，可选用其他微管稳定试剂；例如非紫杉烷类分子如peloruside，或不可水解的GTP类似物如GMPCPP17,32。
为了在冷冻电镜载网上对结合微管的蛋白质进行结构研究，需要将足量的目标蛋白质结合到微管上。一个常见的问题是，原本在溶液中稳定的蛋白质复合物在载网上会解离。为在载网上形成蛋白质复合物，关键步骤是首先将微管铺在载网上，然后以低盐浓度将微管结合蛋白加到已覆盖微管的载网上，从而直接在载网上组装蛋白质复合物。其他研究者也报道过类似的低盐33,34方案以及两步加样34,35,36方案，可用于成功实现微管装饰。较低的盐浓度可能通过降低静电荷，使蛋白质复合物更倾向于形成稳定的相互作用。然而，由于盐浓度较低，目标蛋白质存在沉淀的风险。因此，强烈建议在冷冻载网前的短时间内才将蛋白质置于生理相关或接近生理的盐浓度条件下。这种两步加样方案可能有助于防止蛋白质复合物在滤纸吸液或浸入冷冻过程中解离。在本方案中，我们使用了Vitrobot。然而，更快的玻璃化方法（如VitroJet）、无滤纸吸液的载网（如Puffalot）或兼具这两种特性的设备（如chameleon）有可能克服对两步加样的依赖，但目前这些方法尚未广泛用于测试。
重建的冷冻电镜密度图的最终分辨率可能受到多种因素影响，包括微管结合蛋白相对于微管的运动以及所达到的微管装饰程度。较高的微管装饰度通常有利于获得更高分辨率的三维密度重建结果。然而，这一过程可能受到若干因素的限制，例如微管结合蛋白纯化过程中所能达到的最高蛋白浓度、微管相互作用蛋白在不发生聚集情况下所能耐受的最低盐浓度，以及微管相互作用蛋白的结合模式（例如，该蛋白可能跨越多个微管蛋白二聚体，从而阻碍1:1的结合比例）。尽管微管装饰稀疏可能会降低冷冻电镜重建的分辨率，但计算分析方法可以在很大程度上克服这些问题，最近报道的一个微管-蛋白复合物结构即为范例，该结构的微管装饰极为稀疏8。
我们在此描述的方案提供了一种快速、低成本的方法，用于制备适用于冷冻电镜（cryo-EM）研究的微管。与 commercially available porcine brain tubulin 相比，来源于 MATCAP 缺陷型和 vasohibin 缺陷型 HCT116 细胞的微管完全酪氨酸化（fully tyrosinated）图4）。商业化的HeLa微管蛋白是一种昂贵的试剂，原则上其酪氨酸化程度相对均一，且含有较少的其他修饰4 例如谷氨酸化，但不同批次之间可能存在差异，且修饰只能部分实现 体外从定制细胞系中提取微管的一个优势在于，可以灵活地过表达或敲除微管蛋白修饰酶（如微管蛋白去酪氨酸酶），从而获得更为均一的微管群体。这有助于提高冷冻电镜样品的标记效果和均一性，最终提升由此样品获得的冷冻电镜密度图及分子结构的解析便捷性和质量。

微管是细胞骨架的重要组成部分，参与细胞迁移和分裂等多种功能，同时也对细胞内结构的组织起重要作用。为了适应不同的功能需求，微管会与多种微管相关蛋白（MAPs）、酶及其他蛋白质相互作用，我们将这些蛋白质统称为&#34;微管相互作用蛋白&#34;。这些蛋白质与微管的结合可受到不同微管蛋白修饰的调控，通常被称为&#34;微管蛋白密码&#34;1。此类选择性结合的例子包括有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）2以及动力蛋白-动力激活蛋白复合物中p150的CAP-Gly结构域3，它们更倾向于与酪氨酸化的微管蛋白结合；而着丝粒相关蛋白E（CENP-E）驱动蛋白4和驱动蛋白-25则更偏好缺乏C末端酪氨酸的微管蛋白。
尽管有多种方法可用于研究微管-蛋白质相互作用，但冷冻电子显微镜（cryo-EM）通常被用于在近原子分辨率下研究这些相互作用6,7。近年来，cryo-EM 结构揭示了诸如动力蛋白（dynein）8,9,10 和驱动蛋白（kinesin）11 等大型马达蛋白、EB312,13 和 MCAK14 等 +TIP 蛋白、Tau15,16 等其他蛋白质，甚至紫杉醇（paclitaxel）、peloruside 和 zampanolide17 等小分子如何与微管相互作用。为了研究微管-蛋白质相互作用，微管通常从猪脑中提取18。此后，大多数体外（in vitro）研究，包括 cryo-EM 微管结构解析，均使用猪脑来源的微管蛋白（tubulin）。因此，这些研究结果掩盖了不同组织和细胞类型之间微管蛋白修饰异质性的重要意义19。当研究某种需要或偏好特定修饰才能结合微管的蛋白质时，这一局限性尤为突出。例如，去酪氨酸化酶 MATCAP 作用的底物——酪氨酸化微管蛋白（tyrosinated tubulin），即是一个典型例证。
去酪氨酸化是一种微管蛋白修饰，指α-微管蛋白C末端的酪氨酸氨基酸缺失，该修饰与有丝分裂、心脏及神经元功能相关20。尽管完全酪氨酸化的微管是MATCAP的理想底物，但由于猪脑来源的商用微管中存在血管抑制蛋白（vasohibins）21,22 和 MATCAP23 去酪氨酸化酶的活性22,23,24,25,26，完全酪氨酸化的微管在其中几乎不存在。尽管市面上可购得的HeLa细胞来源微管主要含有酪氨酸化微管，但仍可能发生去酪氨酸化修饰，因此该来源的微管在制备用于冷冻电镜分析的均一性样品时适用性较低。
为了促进 MATCAP 与微管的结合，并为结构分析制备均一的样品，我们寻求一种完全酪氨酸化的微管来源。为此，我们构建了一种缺乏 MATCAP 和血管抑制蛋白（vasohibin）的细胞系，用于提取完全酪氨酸化的微管。提取过程基于已建立的成熟方案，这些方案通常通过微管的反复聚合与解聚循环从脑组织或细胞中提取微管蛋白18,27,28,29,30，而本方法仅包含一次聚合步骤，并通过甘油垫进行离心。以 MATCAP 为例，我们进一步展示了这些微管如何用于冷冻电镜（cryo-EM）研究。在制备冷冻电镜载网时，本文描述了一种在低盐浓度条件下的两步加样方法。本论文中的方法可实现足量且高纯度的可定制化微管提取，适用于冷冻电镜分析，并详细提供了如何利用这些微管在冷冻电镜载网上构建蛋白-微管复合物的操作流程。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168381</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547255</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>300 目 Quantifoil 多孔碳铜网 R1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td>冷冻电镜载网制备</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108418</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3899</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>乙烷气体</td><td></td><td></td><td>冷冻电镜载网制备</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Serana</td><td>s-FBS-EU-015</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>甘油</td><td>VWR</td><td>24.397.296</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Fisher Scientific</td><td>G8877-1G</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP 基因敲除细胞</td><td>自制</td><td>野生型 HCT116 细胞 RRID: CVCL_0291</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck</td><td>1.05033</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>MgCl₂</td><td>Merck</td><td>105833</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>微管结合蛋白</td><td>自制</td><td></td><td>冷冻电镜载网制备</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD microlance</td><td>300600</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-212517</td><td>注意：有毒，用于微管提取</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100mL</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Merck</td><td>P8203</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>PMSF（溶于乙醇）</td><td>Roche</td><td>16837091001</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>SDS 上样缓冲液</td><td>自制</td><td></td><td>质量评估</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD plastipak</td><td>309658</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>Ultra 蛋白酶抑制剂片（小装量）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0975224</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>Whatman 吸水纸</td><td>Whatman</td><td>47000-100</td><td>冷冻电镜载网制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td></td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>GloQube</td><td>Quorum</td><td></td><td>冷冻电镜载网制备</td></tr><tr><td>载网储存盒</td><td>SWISSCI</td><td>41018</td><td>冷冻电镜载网储存</td></tr><tr><td>加热块（电热或金属）</td><td></td><td></td><td>用于预热缓冲液</td></tr><tr><td>细胞培养孵箱</td><td>NUAIR</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>液氮杜瓦瓶</td><td></td><td></td><td>冷冻电镜载网储存</td></tr><tr><td>夹网镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0508-L5-PS</td><td>冷冻电镜载网制备，顶部钻孔以适配 Vitrobot</td></tr><tr><td>聚苯乙烯盒&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于保持缓冲液温度</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q700</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>标准光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>质量评估</td></tr><tr><td>TLA 100.3 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>微管提取</td></tr><tr><td>TLA 120.2 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>微管提取</td></tr><tr><td>TLA 100.3 转子专用离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>TLA 120.2 转子专用离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>347356</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima MAX-XP</td><td>微管提取</td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>FEI, ThermoFisher Scientific</td><td>mark IV</td><td>冷冻电镜载网制备</td></tr><tr><td>Vitrobot 聚苯乙烯组件（含金属乙烷杯）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>200703</td><td>冷冻电镜载网制备</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td>细胞培养</td></tr></tbody></table>

从哺乳动物细胞中提取修饰微管以通过冷冻电镜研究微管-蛋白质复合物

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

微管是细胞骨架的重要组成部分，参与细胞内结构组织、细胞分裂和细胞迁移。根据不同的翻译后修饰，微管可与多种相互作用蛋白形成复合物。这些微管-蛋白复合物常与人类疾病相关。了解此类复合物的结构有助于阐明其作用机制，可通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）进行研究。为了获得用于结构研究的此类复合物，关键在于提取含有或缺乏特定翻译后修饰的微管。本文介绍一种从基因修饰的哺乳动物细胞中提取内源性微管蛋白的简化方案，包括微管聚合，随后通过超速离心进行沉淀。提取的微管蛋白可用于制备载有微管的冷冻电镜载网，微管上结合有目标纯化的微管结合蛋白。作为示例，我们展示了从基因工程改造、缺失三种已知微管去酪氨酸化酶的细胞系中提取完全酪氨酸化微管的方法。随后，这些微管被用于在冷冻电镜载网上与酶失活的微管相关微管去酪氨酸化酶形成蛋白复合物。

我们通过冷冻电镜（cryo-EM）研究了结合于酪氨酸化微管的微管素去酪氨酸酶 MATCAP。为此，我们从一种基因修饰的 HCT116 细胞系中提取了完全酪氨酸化的微管，该细胞系缺失所有三种已知的去酪氨酸化酶 VASH1/2 和 MATCAP。我们使用 6–12 个汇合的 15 cm 培养皿，从约 0.5–4 mL 细胞沉淀中提取微管（图1）。第二次离心步骤（步骤 3.11）后，可获得一个可见但微小且透明的沉淀物（图1I）。微管的得率通常约为 ~75 µg如果沉淀不可见，可能表明先前步骤中存在问题，例如微管聚合温度不正确、所用GTP或紫杉醇的质量问题，或添加了过多的裂解缓冲液，导致微管蛋白浓度过低而无法聚合。为评估提取的微管的质量和浓度，我们对样品进行了考马斯亮蓝染色的SDS凝胶分析（图 2A）。这些分析表明，所提取的微管相对纯净。根据BSA定量推算出的微管浓度约为1.4 mg/mL，与分光光度计测得的数值吻合良好。图2B,C).
新提取的微管可直接用于制备冷冻电镜样品。在显微照片中，微管应呈现完整且丰富。为进一步进行冷冻电镜分析，每张显微照片中微管密度应较低，以避免微管相互重叠（图3A）。微管断裂或不可见可能表明微管已发生去聚合（例如由于温度过低或GTP水解），或提示 blotting 与浸入冷冻参数设置不当。微管周围的背景较密集，推测含有未聚合的微管蛋白。
MATCAP 的分子量为 53 kDa，其球状催化结构域略小于微管蛋白单体。因此，MATCAP 在微管上的结合情况可通过视觉检测。未结合 MATCAP 的微管显示出“光滑”的边缘，而结合了 MATCAP 的微管则呈现“粗糙”的边缘，其特征是在微管表面出现电子致密的点状结构。图3B）。在计算得到的二维分类中，也可区分与MATCAP结合及未结合的微管，但由于形状和大小的差异，这一结果可能因其他微管相互作用蛋白而有所不同。图3C）为了确认该密度确实属于目标蛋白，可以利用实验测定或预测的结构进行验证。我们还建议制备仅含微管的对照载网用于比较，以判断微管是否成功聚合并以足够高的浓度完整提取，以及 plunge freezing 过程是否操作正确。我们注意到，在进行第二次 MATCAP 应用的载网上，微管的丰度有所降低。
<img alt="DNA 沉淀过程；实验室实验；注射器、试管、试管中可见沉淀物" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验步骤的可视化示意图。（A）裂解前的细胞沉淀；（B）超声处理后、离心前的超速离心管中的细胞；（C）超声处理后、离心后的超速离心管中的细胞；（D）含有澄清上清液的注射器；（E）去除上清液后残留的沉淀，包括一层“白色漂浮层”；（F）用于 SDS 考马斯亮蓝凝胶的含有细胞碎片沉淀的 P10 吸头；（G）加入 GTP/紫杉醇前的上清液；（H）加入 GTP/紫杉醇孵育后、位于超速离心管中甘油垫上方的上清液；（I）第二次离心步骤后得到的纯净微管沉淀。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示蛋白质条带的 SDS-PAGE 凝胶图像；BSA 浓度及统计分析结果图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：微管纯度及浓度测定。（A）考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 凝胶，显示提取流程中各步骤取样的结果以及 BSA 浓度比较。S1 和 P1 分别代表第一次离心步骤后的上清液和沉淀；S2 和 P2 则分别对应第二次离心步骤的上清液和沉淀。（B）基于（A）中 BSA 相对量绘制的非线性回归曲线。P2（微管）泳道中约 50 kDa 微管蛋白条带的插值表明最终浓度为 1.42 mg/mL。（C）由两名操作者对重悬微管（P2）进行分光光度分析，并根据 TUBA1A 与 TUBB3 的合并消光系数（0.971）校正，所得浓度均值与标准差为 1.46 mg/mL ± 0.14 mg/mL。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子显微镜，纳米结构成像；示意图；纳米颗粒排列与分析研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：示例显微图像。（A）展示与MATCAP结合的微管的示例显微图像。绿色框标示的微管结构完整、已被修饰，可用于冷冻电镜（cryo-EM）分析。橙色框标示的微管虽结构完整且已被修饰，但其位置紧邻左侧的微管，因此较不适合纳入冷冻电镜分析。红色框内的微管存在交叉和断裂现象，应从冷冻电镜分析中排除。（B）左侧面板中绿色圆圈标示的微管的放大视图。红色箭头指示仅在施加MATCAP的样品显微图像中出现的黑色斑点，因此这些斑点很可能对应于结合在微管上的MATCAP。（C）从图A中挑选出的微管颗粒的示例二维分类结果，显示高修饰度和低修饰度的微管，以及另一个数据集中未观察到MATCAP修饰的二维分类结果（最右侧面板）。比例尺 = （A）50 nm，（B）25 nm，（C）10 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="点印迹分析；抗微管蛋白抗体；蛋白质检测；实验结果；三重敲除HCT116细胞、HeLa细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：MATCAP缺陷型及VASH1/2缺陷型三重敲除（TKO）HCT116细胞、商品化猪脑及HeLa细胞来源微管蛋白的免疫印迹分析。 缩略语：TKO = 三重敲除；mAb = 单克隆抗体；pAb = 多克隆抗体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种从哺乳动物细胞中提取内源性微管蛋白的实验方案，这些细胞可缺乏或含有特定的微管修饰酶，从而获得富含特定修饰的微管。随后，我们描述了如何将提取的微管与纯化的微管结合蛋白进行孵育，以制备用于冷冻电子显微镜观察的载网样品。

微管是细胞骨架的重要组成部分，参与细胞内结构组织、细胞分裂和细胞迁移。根据……

通过冷冻电镜研究微管相互作用蛋白的结构对于理解细胞机制至关重要。在冷冻电镜载网上制备均一的、结合了相互作用蛋白的微管是成功的关键。本方案简单、经济，能够制备出具有可控翻译后修饰的微管，其数量和质量均足以满足冷冻电镜研究的需求。微管对温度非常敏感。因此，保持含微管溶液的温度至关重要，以防止其解聚。首先，将基因修饰的HCT116细胞系在DMEM细胞培养基中培养，直至获得6到12个汇合的培养皿。用 10 毫升 PBS 轻柔洗涤细胞，以去除任何细胞培养基。加入含 5 毫摩尔 EDTA 的 3 毫升冰浴 PBS，室温孵育 5 分钟，使细胞从培养板上脱离，随后使用细胞刮刀进行刮取。将细胞收集至预冷的 50 毫升离心管中，置于冰上，并在 250 ×g 下离心 10 分钟。注意观察收获的细胞在离心管体积刻度上的体积。用与细胞沉淀体积相等的裂解缓冲液重悬细胞沉淀，并通过超声处理裂解细胞。超声处理后，进行SDS-PAGE分析时，取两微升裂解液加入另一管中，该管内预先含有18微升水和五微升5X SDS上样缓冲液。用移液器将剩余的裂解细胞转移至离心管中，在超速离心机转子中以 100,000 G、4°C 离心一小时，以澄清裂解液。使用注射器小心吸取上清裂解液，避免扰动沉淀及顶部的浮层。取 2 微升澄清裂解液加入另一管中，该管内含有 18 微升水和 5 微升 5X SDS 上样缓冲液。轻轻冲洗沉淀，用P-10移液枪枪头在沉淀中旋转划取少量沉淀。然后加入200 µL水和50 µL SDS缓冲液。向收集的上清液中加入1 mM GTP和20 µM紫杉醇，以促进微管聚合，并在37°C孵育30分钟，使微管组装完成。通过将 600 微升甘油加入 400 微升裂解缓冲液中来制备垫层缓冲液，并在混合物中添加 20 微摩尔紫杉醇。将缓冲液预热至 37 摄氏度。向超速离心管中加入 800 微升垫层缓冲液。然后，小心地将添加了GTP和紫杉醇的裂解液用移液器加至垫层缓冲液上方。将试管放入超速离心机转子中，在30摄氏度下以100,000 ×g离心30分钟。标记试管朝外的一侧边缘，以便于识别微管沉淀的形成位置。离心后，用移液器小心吸除上清缓冲液，注意不要扰动沉淀。在沉淀附近小心加入裂解缓冲液，轻轻旋转离心管数次，以尽可能去除沉淀及管壁上的甘油，然后吸出液体，并重复洗涤步骤三次。用剪去尖端的枪头在50 µL预热的重悬缓冲液中轻柔重悬洗涤后的沉淀，将离心管置于37 °C环境中。 将重悬的沉淀组分2微升加入18微升水中，并加入5微升5倍浓度的SDS样品缓冲液。安装滤纸，准备冷冻固定装置；将装置温度设为30摄氏度，湿度设为100%；让装置平衡30分钟。为冷冻投入仪设置两种应用条件。第一种应用条件：设力量为10， blot时间为2秒，等待时间为0秒。第二种应用条件：设力量为10，blot时间为6.5秒，等待时间为10秒。将载网碳膜面朝上放入金属辉光放电器中。对冷冻透射电子显微镜（简称冷冻电镜）载网以30毫安电流辉光放电60秒。用液氮冷却聚苯乙烯容器组件，并通过将乙烷气体冷凝至低温金属杯中，在金属杯内制备液态乙烷。将微管相互作用蛋白与稀释缓冲液等体积混合，以降低细胞浓度，然后再将其加入载网上。将混合物置于37摄氏度环境中。若冷冻制样装置附近无加热块，可使用置于隔热聚苯乙烯盒中的温热金属块。用冷冻镊子夹取一块辉光放电处理的载网，并将其卡入冷冻投入仪中。将装有液态乙烷的聚苯乙烯容器放入冷冻投入仪内，运行预先设定的程序。首先，向载网上滴加 3.5 µL 微管蛋白溶液。让冷冻仪的压块吸附载网。然后，立即加入3.5 µL稀释后的蛋白质溶液。最后，让压块吸附并迅速将载网浸入液态乙烷中进行冷冻。将载网转移至载网储存盒中，并在成像前将其保存于液氮杜瓦瓶内。通过考马斯亮蓝染色的SDS凝胶评估所提取微管的质量和浓度。通过对P2泳道中约50千道尔顿微管条带与BSA标准曲线进行插值，获得相对BSA量的非线性回归曲线，表明最终浓度为1.42毫克/毫升。这与两人使用分光光度计测得的数值高度一致。新提取的微管被用于制备冷冻电镜样品。在显微照片中，微管形态完整且数量丰富。每张显微照片中的微管密度不应过高，以避免微管相互交叉。微管断裂表明微管已发生去聚合，或微管浓度过高。与MATCAP结合的微管具有粗糙边缘，其特征为微管表面存在电子致密的点状结构。在计算得到的二维分类中，也可区分与MATCAP结合及未结合的微管。采用该方法制备冷冻电镜载网，可用于研究与特定相互作用蛋白结合的微管结构，从而增进对细胞结构生物学机制的理解。

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从哺乳动物细胞中提取修饰的微管以通过冷冻电子显微镜研究微管 - 蛋白质复合物

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