从哺乳动物细胞中提取修饰的微管以通过冷冻电子显微镜研究微管 - 蛋白质复合物

通过冷冻电子显微镜对微管相互作用蛋白进行结构研究对于了解细胞机制至关重要。制备与冷冻电镜网格上相互作用的蛋白质结合的均质微管对于成功至关重要。该协议简单，便宜，并且允许以足够的数量和质量制备具有受控翻译后修饰的微管，用于冷冻电子显微镜。

微管对温度非常敏感。因此，保持含微管的溶液温暖以防止解聚非常重要。首先，在DMEM细胞培养基中培养转基因HCT116细胞系，直到获得6至12个汇合板。

用10毫升PBS轻轻洗涤细胞以除去任何细胞培养基。通过在室温下用补充有五毫摩尔EDTA的冰冷PBS孵育细胞五分钟，然后使用细胞刮刀将细胞从板上分离。将细胞收集在冰上的50毫升管中，并以250G旋转10分钟。

注意收获细胞的体积，管上的体积刻度。将收获的细胞沉淀重悬于等体积的裂解缓冲液中，并通过超声处理裂解细胞。超声处理后，对于SDS-PAGE分析，在含有18微升水和5微升5X SDS样品缓冲液的管中加入两微升裂解物。

将剩余的裂解细胞移液到离心管中，并在超速离心机转子中以100， 000G在4摄氏度下旋转一小时以清除裂解物。使用注射器，在不干扰顶部的颗粒和浮动层的情况下去除清除的裂解物。将两微升澄清的裂解物加入含有18微升水和5微升5X SDS样品缓冲液的管中。

小心地冲洗颗粒，并通过旋转P-10移液器吸头穿过颗粒来舀起一点颗粒。然后，加入200微升水和50微升SDS缓冲液。将 1 毫摩尔 GTP 和 20 微摩尔紫杉醇加入收集的上清液中以聚合微管并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟以使微管组装。

通过将600微升甘油加入400微升裂解缓冲液中来制备缓冲液，并用20微摩尔紫杉醇补充混合物。将缓冲液预热至 37 摄氏度。将800微升缓冲液加入超速离心管中。

然后，将补充GTP-紫杉醇的裂解物小心地移液到缓冲缓冲液的顶部。将管放入超速离心机转子中，在 100， 000 摄氏度下以 30 G 旋转 30 分钟。标记管的朝外边缘，以轻松识别微管沉淀应形成的位置。

离心后，使用移液器小心地除去缓冲液，不要干扰沉淀。小心地在沉淀旁边加入裂解缓冲液，旋转试管几次以从沉淀和管壁中去除尽可能多的甘油，然后吸出并重复洗涤步骤三次。用切好的尖端将洗涤的沉淀轻轻地重悬在 50 微升预热的重悬缓冲液中，并将管置于 37 摄氏度。

在18微升水和5微升5X SDS样品缓冲液中加入2微升重悬的颗粒级分。通过安装吸墨纸来准备跳入式冷冻机设备。将设备温度设置为 30 摄氏度，加湿设置为 100%，让设备平衡 30 分钟。

为两种应用准备跳式冷冻机的设置。对于第一次应用，将力设置为 10、2 秒印迹时间和零秒等待时间。对于第二次应用，将力设置为 10、6.5 秒印迹时间和 10 秒等待时间。

将碳面朝上的网格放入金属辉光放电器车辆中。辉光以 30 毫安的速度将冷冻电子显微镜或 EM 网格放电 60 秒。用液氮冷却聚苯乙烯容器组件，通过将乙烷气体冷凝到冷金属杯中，在金属杯中制备液态乙烷。

用稀释缓冲液以等体积稀释微管相互作用蛋白，然后将其应用于网格以降低细胞浓度。将搅拌机置于 37 摄氏度。如果在冷冻装置附近没有加热块，请在绝缘聚苯乙烯盒中使用温暖的金属块。

用低沉镊子拿起一个发光放电的网格，然后将它们按入跳入冰箱。将装有液态乙烷的聚苯乙烯容器放置在小型冰箱中，并运行准备好的程序。首先，将3.5微升微管溶液涂在网格上。

让跳水冰箱吸干网格。然后，立即涂抹3.5微升稀释的蛋白质。最后，让柱塞吸干并沉入液乙烷中冻结网格。

将网格转移到网格存储盒中，并将其储存在液氮杜瓦瓶中直至成像。通过库马斯染色SDS凝胶评估提取的微管的质量和浓度。相对BSA量的非线性回归线，来自P2泳道中约50千道尔顿的微管带与BSA曲线的插值，表明最终浓度为每毫升1.42毫克。

这与两个人用分光光度计测量的数字非常吻合。新鲜提取的微管用于制作冷冻电镜样品。微管在显微照片上看起来完整而丰富。

每个显微照片的微管密度不应太高，以避免微管相互交叉。破碎的微管表明微管解聚，或者微管的浓度太密集。与MATCAP结合的微管具有粗糙的边缘，其特征在于微管表面上的电子致密点。

MATCAP结合和MATCAP未结合的微管也可以在计算的2D类中区分。用这种方法制作冷冻电镜网格可以研究与特定相互作用的蛋白质结合的微管的结构。这可以导致更好地了解结构细胞生物学中的机制。