人肝细胞癌患者来源类器官模型的建立与优化用于潜在靶点识别及药物发现

我们的实验室致力于研究肝癌的分子发病机制，并鉴定可用于药物开发的新型治疗靶点。我们希望利用患者来源类器官等新型疾病模型，解答癌症如何启动转移并发展为耐药性的问题。目前的实验挑战主要体现在两个方面。

首先，目前尚缺乏一套完整的肝细胞癌类器官构建全流程标准操作方案。其次，培养的肝细胞癌（HCC）类器官体积过小，难以进行后续实验操作。在本方案中，我们详细介绍了优化后的类器官培养、后续传代与冻存操作步骤，以及各步骤中需注意的事项。

我们优化了类器官培养基的成分，以收获具有接近原始组织特征的较大类器官。我们将利用新建立的患者来源类器官监测肿瘤的演化过程，并尝试鉴定肝细胞癌（HCC）治疗中新的分子机制和治疗靶点。开始组织解离时，从未经治疗的患者中采集一至二立方厘米的肝细胞癌（HCC）组织。

然后将组织置于组织保存液中，并在4°C条件下保存直至处理。现在将超低吸附表面细胞培养板放入37°C培养箱中预热一小时。将基底膜提取物在4°C条件下过夜保存。

在超净工作台内的培养皿中，使用手术剪将肿瘤组织剪成小块。将这些组织块转移至一个15毫升的锥形管中，并加入5到10毫升基础培养基。使用正压移液器尽可能洗去血液。

让混合物静置一到两分钟，然后移除部分上清液，包括任何血细胞和漂浮的脂肪凝块。接着，在室温下以 300 G 离心五分钟。然后小心吸取上清液，并向修剪好的组织中加入五毫升预热的消化液。

将试管置于37摄氏度的旋转器中，以实现最佳消化效果。初始消化30分钟后，使用显微镜观察是否存在小型细胞簇。为终止消化过程，向试管中加入5毫升冷的基礎培养基。

然后使用100微米细胞滤网过滤至新的50毫升离心管中。加入冷的基礎培養基至终体积50毫升。接下来，在8摄氏度下以2 × g离心10分钟。

完成后，小心移除上清液。将沉淀物重悬于50毫升冷的基础培养基中，以获得用于类器官接种的细胞沉淀。进行类器官接种前，首先从离心后的肝细胞癌细胞中移除上清液并清洗细胞。

将细胞重悬于每孔50微升的基底膜提取物（BME）中，用于铺板。接着，将细胞悬浮于高级DMEM/F12培养基中。然后轻轻吹打细胞团块，直至形成均匀的悬浮液。

加入BME至悬液中，确保BME浓度在30%至50%之间。现在，将含有细胞簇的50微升BME液滴接种于24孔板的中央。在37°C下孵育20分钟，使液滴凝固。每孔加入500微升预热的培养基，并在37°C细胞培养箱中孵育。

每两到三天更换一次培养基。两周后，将原代分离培养基更换为类器官扩增培养基。培养七至十天后，当类器官达到适当密度时，根据需要对培养物进行后续处理。

传代类器官时，首先将超低吸附表面的细胞培养板置于培养箱中预热。接着，在使用前将冷冻的基底膜提取物（BME）在4摄氏度下过夜解冻。将类器官收获溶液和胰蛋白酶替代物在37摄氏度预热30分钟。

完成准备阶段后，从类器官培养板中移除培养基。然后将类器官悬液转移至15毫升离心管中。接着，根据BME的量按比例加入类器官消化溶液。

为混匀悬浮液，使用1000微升移液器反复吹打并上下抽吸。将离心管在室温下孵育30分钟后，用1毫升移液器小心吸取BME，确保BME完全溶解。

每10分钟观察一次提取物，直至可见清晰的类器官细胞簇。然后在室温下以400 G离心5分钟。尽可能吸除上清液。

为启动肝细胞癌类器官的酶消化，向培养的类器官沉淀中加入一至五毫升预热的胰蛋白酶替代物。将悬浮液在37摄氏度下孵育两分钟。使用显微镜观察类器官是否解离为由2至10个细胞组成的小细胞簇。

为终止消化，加入适量的冷基础培养基。随后在8°C条件下以400 × g离心5分钟。小心尽可能吸除上清液。

将所需数量的类器官重悬于适当的基质中用于接种。每10天根据类器官生长密度进行传代。在培养3天内可观察到肝细胞癌类器官球体的形成。

在建立的首日即可观察到具有圆润边缘和通透性胞质的紧凑类球体。在30%至50%BME中培养时，类器官大小相似且直径最大。而在10%BME中，基底膜提取物（BME）碎片化程度最高，导致形成的类器官最小。

BME在100%浓度时最完整，但形成的类器官直径处于中等水平。增殖中的肝细胞癌（HCC）类器官在连续三代培养后，尺寸均超过500微米。在20天的培养周期内，获得了尺寸超过1000微米的较大肝细胞癌类器官。