Name: 使用斑马鱼振动惊吓反应筛查系统评估化学品的毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 了解使用斑马鱼胚胎振动惊吓反应行为检测法评估化学品神经肌肉毒性与致死性的高通量体内毒性筛选技术。该方法利用Danio rerio模型快速识别干扰神经或肌肉功能的化合物，具有成本低、可定制且易于维护的优势，适用于PrecisionTox联盟等多模型生物毒性通路研究与人类毒性预测。

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我们衷心感谢IBCS-BIP鱼类设施和筛选中心支持团队提供的出色技术支持。本工作获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在资助协议编号965406（PrecisionTox）下的资助。本出版物仅反映作者的观点，欧盟对其中所含信息的任何使用不承担任何责任。

所有斑马鱼的饲养和操作均遵循德国动物保护标准，并已获得德国巴登-符腾堡州卡尔斯鲁厄政府行政区（Regierungspräsidium Karlsruhe, Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT）的批准。
1. 准备待测化学品的储备溶液
<ol>
	<li>用化合物名称/缩写、储备液浓度和配制日期标记玻璃小瓶（或化学试剂分装管）。例如，CdCl2_2.5 g·L-1_210813。</li>
	<li>在室温（RT）下，将化学试剂分装管以 2000 x g 离心 1 分钟。</li>
	<li>在通风橱内，使用精度为 0.001 g 的天平称取化合物（如需要），并转移至已标记的小瓶中。若化合物为液体，使用移液器和塑料吸头将其加入小瓶。 
	注：例如，在 图2 所示结果示例中使用的三卡因甲磺酸盐储备液，需称取 400 mg 至标记小瓶中。</li>
	<li>使用移液器和塑料吸头加入溶剂（例如，无菌纯水或二甲基亚砜（DMSO），根据化合物的理化性质选择）。如条件允许，优先选用水作为溶剂。 
	注：例如，对于三卡因储备液，配制了 100 mL 水中含 15.3 mM 的溶液。</li>
	<li>密封小瓶，轻轻振荡，并检查是否有沉淀产生。</li>
	<li>如有需要，使用移液器和塑料吸头在玻璃小瓶中配制稀释的储备液。 
	&#8203;注：例如，三卡因储备液无需进一步稀释。</li>
	<li>将储备液储存于 -20 °C，直至使用。</li>
	<li>将剩余的化学试剂分装管按此前相同条件储存。</li>
	<li>在实验记录本中记录储备液分装信息。</li>
</ol>
2. 收集和培育斑马鱼胚胎
<ol>
	<li>从群体交配的自然产卵中，在10 cm组织培养皿中收集处于卵裂期（2-8细胞期）的胚胎。</li>
	<li>挑选质量合格的一批胚胎：未受精或死亡的卵比例少于10%。</li>
	<li>清洗培养皿（去除未受精卵、碎片、鳞片等杂质）。</li>
	<li>每10 cm组织培养皿中放置60个胚胎，加入15 mL E3培养基（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4）25。</li>
	<li>将培养皿放入已铺好吸水纸（用水浸湿）的加湿培养盒中。</li>
	<li>在28.5 °C的培养箱中培养胚胎至72小时后受精（hpf）。</li>
</ol>
3. 准备受试化学品的工作稀释液
<ol>
	<li>从 -20 °C 冰箱中取出储备液，使其解冻。</li>
	<li>若化合物溶解度足够高，可在玻璃瓶中用 E3 培养基配制系列稀释液，每种浓度每个重复 1 mL。确保稀释液浓度为所需暴露浓度的 10 倍，以避免在暴露开始时更换胚胎的全部培养基。若溶解度较低，则直接按所需暴露浓度配制系列稀释液，每种浓度每个重复 10 mL。</li>
	<li>检查是否有沉淀产生（如有必要）。若出现沉淀，应记录，并进一步稀释以达到下一个较高浓度，再次检查沉淀情况。重复此步骤，直至无沉淀产生。</li>
	<li>检测暴露溶液的 pH 值。若 pH 值不在 7.0–8.5 范围内，应记录，并使用含 5 mM HEPES/pH 7.4 的 E3 培养基重新配制溶液，用 HCl 或 NaOH 调节 pH 值。</li>
	<li>根据当地法规处理未使用的暴露培养基。</li>
</ol>
4. 将胚胎暴露于待测化学品
<ol>
	<li>检查培养皿中72 hpf（小时后受精）的胚胎，移除死亡或未孵化的胚胎。如果某批次胚胎中未孵化的卵超过5%，则弃用该批次。</li>
	<li>在每个6 cm组织培养皿中放入10个胚胎，并加入9 mL E3培养基（暴露板）。</li>
	<li>用化合物名称、暴露浓度和重复编号标记暴露板。例如，&#34;CdCl2 1 mg·L-1 01&#34;。根据需要设置足够的仅含E3培养基的对照板以及溶剂对照板（见第5节）。</li>
	<li>从最低浓度开始，向每块板中加入1 mL暴露溶液，并轻轻摇晃培养皿。对于溶解度较低的化合物，需将培养皿中的全部10 mL液体更换为暴露溶液（见步骤3.2）。</li>
	<li>记录化合物溶液添加到胚胎中的时间顺序。</li>
	<li>将培养皿置于28.5 °C的加湿培养箱中孵育48小时，直至胚胎达到120 hpf。</li>
</ol>
5. 进行振动惊吓实验
注意：按照步骤 4.5 中记录的相同顺序分析平板。每次运行都应包括一个 E3 对照平板。
<ol>
	<li>打开计算机和振动装置（蓝色LED灯应亮起）。</li>
	<li>在电子表格中准备配置文件，如图1D所示，并作为补充文件1附上。记录每个孔位（化合物、浓度、重复次数）的暴露信息。</li>
	<li>打开通用用户界面（GUI）程序（可从 https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit 获取，项目ID 43215）。</li>
	<li>在GUI程序中选择不同位置，观察摄像头移动情况，以检查摄像头运动是否正常。</li>
	<li>从培养箱中取出待测样品板。将样品板放置在5个位置上（见图1A，&#34;loudspeakers&#34;），并让胚胎静置数分钟。</li>
	<li>点击Record；将弹出窗口供选择配置文件。</li>
	<li>选择在步骤5.2中为此运行准备的相应配置文件。</li>
	<li>确认样品描述与各位置（1-5）上的样品相对应。</li>
	<li>测量将自动进行（每位置10秒）。当程序施加声音脉冲时，LED灯会亮起。每位置记录10秒可获取足够的数据，用于估算刺激前后胚胎的游泳速度和移动距离，并防止对后续刺激产生习惯化。</li>
	<li>当记录完成后，摄像头返回位置1，软件开始压缩文件。在此期间，更换为下一组待测样品。</li>
	<li>返回步骤5.2，开始下一轮记录。</li>
	<li>当所有样品板测量完毕后，收集暴露溶液。使用筛网保留胚胎。</li>
	<li>通过在冰/异丙醇（5%）浴中快速冷却处死胚胎。</li>
	<li>根据当地法规处理暴露溶液和死亡胚胎。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>使用 VirtualDub (1.10.4) 打开视频数据。</li>
	<li>通过视觉观察记录对声音脉冲有反应的胚胎数量（当控制 LED 灯亮起时）。</li>
	<li>将数据输入电子表格。根据 补充文件 2 中提供的模板记录化合物名称、重复次数、化合物浓度以及静止胚胎的百分比，该模板包含 图 2C 所示的示例数据集。 
	注意：该模板具有灵活的结构，原则上可用于其他生物体和终点的数据。它描述了每个浓度下的反应，并提供了终点描述以及后续浓度-反应建模中生成参数的定义。</li>
	<li>使用 KNIME 工作流（KNIME Analytics 4.626）并结合嵌入式 R 脚本（R 版本 3.6，R 包 plotrix、drc 和 bmd27,28）进行基准浓度（BMC）分析。 
	注意：原则上，评估也可直接在 R 中进行。但为了方便起见，并支持作为基于网络的服务进行评估，分析已整合为符合 KNIME 服务器规范的工作流。KNIME 工作流的输出结果见 补充文件 3。有关 KNIME 工作流生成的统计参数的详细信息，请参考该模板。用于评估拟合优度以及接受所确定 BMC 值阈值的统计参数见 表 1。该 KNIME 工作流本身可通过 GitHub 获取（https://github.com/precisiontox/range-finding-drc）。浓度-反应关系采用四参数对数逻辑模型进行拟合。其中两个曲线拟合参数可设为固定值。通常情况下，对于百分比数据，可将最大值固定为 100；若未观察到背景效应，可将最小值固定为 0%。</li>
</ol>

Startle Assay for Toxicity Evaluation in Zebrafish Embryo

我们没有需要披露的内容。

我们介绍了使用自行构建的斑马鱼胚胎振动惊吓反应检测装置进行化学化合物评估的工作流程和数据分析方法。该工作流程可生成可靠的数据，用于计算表征化合物毒性的典型参数，例如基准浓度/剂量（BMC/BMD）。该装置具有模块化设计，可根据通量和空间需求进行灵活调整。由于系统采用低成本基础组件，并基于相对简单的构建方案，因此相较于现有的商业系统，提供了一种经济的替代方案。现有商业系统通常同时设计用于多种检测类型，依赖专有软件，且价格相对较高。
这些商用系统以及其他定制系统均支持对多孔板中的单个胚胎或幼体进行评估（例如，12孔34、16孔32,35、24孔20,33,36、48孔37、96孔38,39,40,41,42，甚至384孔[作为4×96孔]43），但孔内空间受限，使得对逃避反应某些参数（如移动距离）的分析更具挑战性。此外，在部分实验装置中，成像仅限于多孔板中的部分孔位，从而降低了通量36,39。在培养皿中进行成像可更准确地评估逃避反应参数，并能够同时记录多个胚胎的行为（例如，在6 cm培养皿中最多可记录30个胚胎）。通常情况下，基于培养皿的成像每次运行仅限一个培养皿44,45,46,47,48（少数例外可并行对6个培养皿中各一个幼体进行成像49，或在2个分隔的培养皿中对4个幼体进行成像50），这一局限性可通过并行设计（如本研究中的方案）加以解决。我们已在表2中总结了本研究所用系统以及其他商用和定制化解决方案的一些特征20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50, 
51,52。
该方法的一个优势在于其检测结果可同时捕获致死效应和行为变化，从而提高毒性评估的性能。例如，尽管斑马鱼胚胎急性毒性试验（FET）5 已被证明能够较好地预测成年鱼急性毒性试验53 的毒性，但若加入行为学检测指标，其预测准确性可进一步提升54。其原因在于神经活性化合物在鱼胚胎中引起的死亡率较低，这可能是由于胚胎缺乏导致幼鱼或成鱼毒性增强的呼吸衰竭综合征。然而，通过行为评估仍可识别出神经活性。此外，行为学检测还可捕捉到肌毒性与耳毒性效应，以及其他更细微的生理性毒性效应，这些效应虽未致死，但会影响生物体的行为表现。
进行实验时，必须确保化合物的正确操作，并使用发育均一的斑马鱼胚胎批次。因此，使用玻璃小瓶储存化合物可最大程度减少化学物质（尤其是疏水性化合物）因吸附到塑料材料而导致的浓度下降。对于具有高吸附潜力的化合物与&#34;塑料&#34;聚苯乙烯，孵育过程也可采用玻璃培养板。在用于收集胚胎和清除死亡胚胎的组织培养皿中对卵进行清洗，是确保胚胎正常发育的关键步骤。正常的发育速度至关重要，因为发育延迟可能影响被评估行为所依赖的神经网络的成熟度14,33。此外，为了能够比较化合物的作用效果，卵应来源于同一品系，因为已有报道指出不同品系的斑马鱼具有不同的行为特征38,55,56,57。在暴露过程中，应将胚胎置于加湿的培养环境中孵育，以避免E3培养基过度蒸发，从而改变所测试的化合物浓度。
每次实验均应纳入E3对照组，以确定本批次实验胚胎的基线反应水平。通常，每5次测量设置一组对照，即运行一板对照样本。如图2D所示，该方法还可用于检测因发育延迟或其他因素（如遗传背景影响）导致反应不佳的批次。若出现对刺激无预期反应的情况，还需注意是否存在换能器故障的可能。通常情况下，惊吓反应呈S形浓度-反应关系，可采用对数逻辑斯蒂模型进行曲线拟合。然而，在少数出现双相反应的情况下，可能需要采用其他模型，例如高斯模型或Cedergreen模型。这些模型可在R语言的drc和bdm27,28程序包中找到。
对振动刺激无反应可能仅表明胚胎死亡或因普遍的细胞毒性导致生命功能严重受损，但也可能反映更特异性的毒性作用，即针对刺激感知、整合及运动输出的神经回路。其他可能的化合物效应包括干扰神经肌肉接头或肌肉结构与功能。为了区分这些可能性，需要进行进一步的检测。例如，可通过双折射检测来评估肌肉的结构完整性58,59，也可利用转基因品系评估肌肉和神经功能的扰动情况60,61。然而，已记录的视频数据本身已可用于对胚胎形态和行为反应进行更详细的分析，从而提供初步的附加信息。是否仅有C形弯曲反应受损，还是所有运动能力均受影响？是否存在神经肌肉活动的残余表现，例如微弱或颤抖的尾部运动？此类行为改变是否伴随形态学变化，如水肿或体轴弯曲程度增加？此外，还可评估诸如C形弯曲反应的潜伏时间或逃避反应期间移动距离等参数（参见例如&#160;Ref. 44）。
本文所述的筛选方案可实现快速且可靠的化合物毒性评估，并具有特异性检测非致死性神经毒性、耳毒性和肌毒性化合物的额外优势。所提供的分析流程易于实施，并可提供可靠的读数结果。已有研究通过修改振动惊跳实验中使用的刺激方案，进一步探究化合物对惊跳行为更复杂层面的影响，例如前脉冲抑制（PPI）39,44 和习惯化过程32,33，这些方案也可适配于本研究所采用的基于电动换能器的刺激装置。
基于惊吓反应的筛选系统的一个主要应用是在化学筛选中评估化合物的作用，这对于人类毒性评价和药物开发均具有重要意义1,4,62。同时，通过检测水生生物的早期生命阶段，所获得的结果对生态毒理学风险评估具有直接的相关性63,64。此外，惊吓反应系统还可用于遗传筛选中的行为表型分析65,66,67,68,69。我们提出的这一系统易于实施且具有良好的适应性，可为计划在上述多个应用领域开展特定筛选项目的中小型实验室提供经济可行的实验配置。

近年来，斑马鱼已成为评估化学化合物效应的热门模式生物，其应用涵盖从药物开发到环境毒理学等多个研究领域1。作为脊椎动物，斑马鱼在基因组成和整体生理特征方面与人类具有许多相似之处2,3。因此，在该模型中获得的研究结果通常与人类健康直接相关。目前正处于临床试验阶段的多个候选药物，正是通过斑马鱼化合物筛选发现的4。
毒性评估是斑马鱼胚胎阶段测试的重要应用领域之一。经济合作与发展组织（OECD）已制定多项测试指南，用于指导在环境毒性测试中使用斑马鱼5,6。斑马鱼胚胎体积小、发育迅速，非常适合在中高通量规模上进行筛选1,3,4。此类筛选所关注的毒理学终点包括胚胎畸形与致死性7、内分泌干扰8、器官毒性9，以及反映神经毒性的行为学评估10,11。行为学检测之所以可行，是因为斑马鱼胚胎在不同发育阶段会对不同刺激产生多种运动反应。例如，受精后1天（dpf）的胚胎表现出自发性尾部卷曲12，并对一系列光脉冲刺激产生典型的运动序列，即所谓的光运动反应（PMR）10。孵化后（通常发生在受精后48–72小时，hpf），自由游动的裸胚13从约4 dpf开始逐渐发展出对振动刺激的惊跳反应和逃避反应14。这些反应的特征是身体向刺激相反方向发生明显弯曲（即所谓的C形弯或C启动），随后出现较小的反向弯曲并启动游泳行为14,15,16,17。值得注意的是，胚胎行为由多种神经递质系统参与调控的神经回路所控制，因此可用于检测作用于这些系统的化学物质的影响。例如，PMR检测已揭示干扰胆碱能、肾上腺素能和多巴胺能信号通路的化合物效应10，而惊跳反应则涉及胆碱能、谷氨酸能和甘氨酸能神经元16,18。此外，损伤肌肉或神经-肌肉接头的化合物也会影响这些行为，损害内耳/侧线毛细胞的化合物同样会产生影响19,20。因此，观察斑马鱼在刺激下的运动行为不仅可用于评估神经毒性，也可用于评估耳毒性和肌毒性。运动行为评分还可作为一般毒性/致死性评估的替代指标，因为死亡胚胎不会产生运动。由此可见，胚胎运动行为可作为初筛毒性的一种综合性读出指标，在同一实验体系中同时反映致死性和神经肌肉毒性效应。鉴于裸胚在120 hpf之前已具备代谢化合物的能力，该方法还可能检测到代谢转化产物的作用7,21,22。重要的是，根据某些动物保护法规，斑马鱼胚胎在120 hpf之前尚未进入自由摄食阶段，不被视为受保护的生命阶段13。因此，该模型被视为动物毒性测试的一种替代方法。
<img alt="带有扬声器、相机、控制器的声悬浮装置；图像分析；数据图表；培养皿。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：振动惊跳反应系统装置示意图。（A）系统的整体结构。含有暴露于测试化合物胚胎的培养板被放置在电动换能器阵列（“扬声器”）上。相机通过皮带驱动的线性驱动装置依次移动至目标换能器上方的记录位置。（B）换能器/扬声器的局部示意图，顶部放置有组织培养皿。培养板由下方LED光源以4000–5000 lux的光照强度进行照明。在施加刺激时，扬声器旁的LED灯会亮起。（C）相机在刺激胚胎时所记录视频的静态图像。（D）配置文件的截图。（E）记录软件界面的截图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
本文介绍了一种利用自主搭建的简易测试装置评估化合物对振动惊跳反应影响的检测方案，该装置基于电磁换能器产生的振动刺激，并结合自动化的视频记录系统，可同时记录培养皿中多个自由活动胚胎的行为23。该系统具有模块化设计，支持多个培养皿并行进行顺序记录。在当前使用的装置中，五个电磁换能器向其上方放置的、含有20个胚胎的培养皿施加振动刺激（500 Hz，持续时间1 ms）（图1）。培养皿由下方LED光源以4000–5000 lux的照度进行背光照明。每个换能器旁设有LED指示灯，用于标示刺激施加的时间段，同时使用示波器监测所施加刺激的波形和频率（具体细节参见参考文献23）。胚胎行为由高速摄像机（材料表）以每秒1000帧（fps）的速度进行记录，摄像机通过皮带驱动的线性传动装置移动至目标扬声器上方。该记录速度对于准确分辨惊跳反应至关重要。本系统为现有商业系统提供了一种低成本且可个性化调整的替代方案。目前，该精确操作流程已在“精准毒理学”计划24的框架内实施，旨在确定经一系列选定毒物处理的斑马鱼胚胎在进行组学（OMICS）数据采集时的适宜暴露条件。

<table><tbody><tr><td>细密试验筛，黄铜框架，孔径 250 &amp;mu;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z289744-1EA</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>高速摄像机</td><td>XIMEA</td><td>&amp;nbsp;MQ013MG-ON USB 3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>窄口带螺帽实验室瓶</td><td>VWR</td><td>215-3261</td><td>50 mL 规格的参考编号，最大可提供至 20 L。或性能相当的材料</td></tr><tr><td>移液器吸头，工作体积：10 &amp;micro;L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3010.210</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>移液器吸头，工作体积：1000 &amp;micro;L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3050.100</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>移液器吸头，工作体积：20 &amp;micro;L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3020.210</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>移液器吸头，工作体积：200 &amp;micro;L</td><td>SARSTEDT</td><td>70.3030.100</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>血清移液管，10 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1254.001</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>血清移液管，25 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1685.001</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>血清移液管，5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1253.001</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>组织培养皿，60.0 mm/15.0 mm 透气（聚苯乙烯）</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>组织培养皿，100 mm，悬浮培养用（聚苯乙烯）</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3902.500</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>转移移液管，6 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1175</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>15 mL 管，120 mm × 17 mm，聚丙烯（PP）</td><td>SARSTEDT</td><td>62.554.502</td><td>或性能相当的材料</td></tr><tr><td>50 mL 管，114 mm × 28 mm，聚丙烯（PP）</td><td>SARSTEDT</td><td>62.5472.54</td><td>或性能相当的材料</td></tr></tbody></table>

利用斑马鱼振动惊吓反应筛选系统评估化学品的毒性

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

我们开发了一种用于评估斑马鱼胚胎神经肌肉毒性和一般毒性的简易筛选系统。该模块化系统由电磁驱动换能器组成，其上方可放置含有胚胎的组织培养皿。多个此类扬声器-组织培养皿组合可并联使用。电磁换能器产生的振动刺激可诱导胚胎产生特征性的惊吓和逃逸反应。通过皮带驱动的线性传动装置，摄像头被依次定位至每个扬声器上方，以记录胚胎的运动。通过该方法，可对因化合物致死性或神经肌肉毒性导致的惊吓反应改变进行可视化观察和定量分析。本文展示了利用该系统进行化合物筛选的工作流程示例，包括胚胎制备与处理溶液配制、记录系统的操作，以及数据分析以计算在该检测中具有活性的化合物的基准浓度值。该系统基于市售的简单组件进行模块化组装，既经济实惠，又可根据特定实验室配置和筛选需求灵活调整。

图2A 显示了48窝未经处理的野生型胚胎（AB2O2品系）中不动胚胎所占的百分比。平均而言，14.33%的未经处理的野生型胚胎对振动刺激无反应。在4窝中，不动幼体的比例达到50%，但75%的窝中不动幼体的比例低于20%。
图2B、C 展示了在 PrecisionTox 联盟当前采用的振动惊跳实验流程中，针对化合物对运动能力影响的基准浓度/剂量（BMC/BMD29,30）典型计算示例24。BMC10、BMC25 和 BMC50 值分别对应于有 10%、25% 和 50% 胚胎表现出高于本底水平的不动状态时的浓度。该计算仅包含完全不动的胚胎，而不包括仍存在部分反应的胚胎，例如仅出现 C 形弯曲但无后续逃逸游泳动作，或仅有尾部运动的个体（图2B）。实验中将胚胎暴露于 8 个浓度梯度的钠通道抑制剂三卡因甲磺酸盐（tricaine methanesulfonate），该试剂常用于鱼类麻醉31。数据显示，在振动刺激下，胚胎的本底不动水平约为 25%。当三卡因浓度达到 1% 时，运动能力开始下降，并在高于 2.5% 时完全停止。KNIME 工作流计算得出 BMC50 为 164.9 µM，相当于 1.07% 的三卡因浓度，对应的不动水平为 75%（图2C）。曲线上方灰色区域表示较小的 95% 置信区间，表明本实验中运动参数具有良好的可重复性。
图2D展示了一次次优检测运行的示例，其数据不应用于BMC计算。图中显示了五个经E3处理的对照组，每组使用来自同一批次的不同胚胎（AB2O2[野生型品系]重复1-5）。仅第一组表现出接近正常的反应，其不动率约为25%，与文献报道值32以及本研究中所述检测所获得的结果一致（如图2A所示），而其余各组均表现出减弱和/或不完全的行为反应（例如仅出现C型弯曲但未伴随游泳活动，或出现运动但起始时无明显C型弯曲）。此类反应可能源于胚胎发育异常，因发育延迟而处于未成熟状态，从而影响惊跳反应的稳健性14,33。
<img alt="三卡因的浓度-反应曲线图；无运动胚胎的百分比；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：典型结果示例，包含基准剂量（benchmark dose）计算。（A）48窝未经处理的野生型幼鱼（每窝n = 10）在声音脉冲刺激后无反应胚胎的百分比。图中以红色标示平均值（14.33%）和标准差（±16.19%）。（B）在E3培养基中用指定浓度的三卡因处理或仅用E3处理作为对照的胚胎（每组条件n=20）的惊跳反应行为评估。行为分类依据图右侧所示的颜色编码和示意图，每个胚胎仅归属于以下一类：“无运动”：胚胎不表现出任何运动；“尾部运动”：胚胎仅表现出尾部摆动，但无C形弯折或游泳行为；“可运动”：胚胎表现出游泳动作，但对振动刺激无C形弯折反应；“仅C形弯折”：胚胎表现出C形弯折，但无逃逸游泳；“C形弯折+可运动”：胚胎表现出典型的C形弯折行为并随后进行逃逸游泳（典型的完整惊跳反应）。不同行为以每种处理条件下胚胎总数的百分比形式展示。（C）由KNIME工作流生成的BMC计算图，显示各处理浓度下“无运动”胚胎的百分比。蓝色、红色和黑色线条分别表示BMC10、BMC25和BMC50值，即胚胎表现出高于背景水平的无运动比例达到10%、25%和50%时对应的浓度。（D）一次被剔除的实验运行示例。展示了来自同一窝的五组不同AB2O2野生型胚胎（重复1-5）经E3处理的对照组结果。仅重复1组表现出接近正常的反应，其余组的胚胎均未表现出典型的C形弯折+逃逸游泳反应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：用于评估拟合优度的统计参数及接受所测定骨矿物质含量（BMC）值的阈值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：几种振动惊吓反应检测系统特性的选择。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件 1：配置文件的 Excel 模板。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>
补充文件 2：带有示例数据集的 KNIME 输入模板。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：KNIME 输出文件示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们描述了一种基于斑马鱼胚胎振动惊吓反应的化学化合物毒性评估筛选系统的工作流程和数据分析方法。该系统记录斑马鱼胚胎在受到振动刺激时的运动反应，可对总体毒性/致死性以及神经肌肉毒性进行综合评估。

我们开发了一种用于评估斑马鱼胚胎神经肌肉功能及一般毒性的简易筛选系统。该模块化系统由……组成

在筛选化学物质的毒性时，当前实验面临的一个挑战是如何在考虑到完整生物体复杂性的同时，快速、高通量地确定其在体内的毒性效应。通过采用一种行为读出方法，监测斑马鱼胚胎对振动刺激的逃避反应，我们的系统能够识别出干扰神经或肌肉功能的化合物。由于死亡的胚胎不会运动，因此我们也能检测到因非特异性毒性导致胚胎死亡的化合物。我们所介绍的系统构建成本较低，且具有可定制性。该系统易于维护，所有部件均可更换。目前，我们正在PrecisionTox联盟中使用该惊跳反应检测系统，以确定用于组学数据采集的化学化合物剂量。数据来自五种模式生物及人类细胞系，将用于推导毒性通路和生物标志物，以预测人类毒性。首先，在10厘米的培养皿中，通过自然产卵收集处于卵裂期的胚胎，具体为从二细胞期至八细胞期的胚胎。从培养皿中移除未受精的卵、碎屑和鳞片以清洁培养皿。每个含有15毫升E3培养基的培养皿中放置60个胚胎。将所有盛有胚胎的培养皿置于已用湿纸巾准备好的加湿环境中。然后在受精后72小时，于设定为28.5摄氏度的培养箱中孵育。接下来，从-20摄氏度冰箱中取出所需的化学储备溶液，并使其解冻。在玻璃瓶中用E3培养基对每种化学物质进行系列稀释。观察溶液是否有沉淀产生，如有，则记录，并进一步稀释以达到下一个较高浓度。重复检查并稀释，直至无沉淀产生。然后检测并记录暴露溶液的 pH 值。如果pH值超出7.0至8.5范围，用盐酸或氢氧化钠调节至7.4。未使用的暴露培养基应按照当地法规进行处理。首先，收集斑马鱼胚胎，并在28.5摄氏度的培养箱中培养至受精后72小时。同时配制待测化学品至所需浓度。检查受精后72小时的胚胎，移除死亡或未孵化的胚胎。将10个胚胎放入每个六厘米的组织培养皿中，每个培养皿加入九毫升E3培养基。这些培养皿称为暴露板。用化合物名称、暴露浓度和重复编号标记每个暴露板。从最低浓度开始，向每块培养板中加入一毫升暴露溶液，并轻轻摇晃培养板。对于溶解度较低的化合物，用暴露溶液完全替换培养基中的10毫升。记录化合物溶液添加到胚胎中的顺序。然后将培养板置于湿润的孵育盒中，在28.5摄氏度的培养箱内孵育48小时。开始振动惊吓实验时，打开计算机和振动装置。创建一个配置文件的电子表格。记录每个培养板五个位置的处理信息，包括化合物、浓度和重复次数。打开振动惊跳反应检测套件的通用用户界面（GUI）程序。在GUI程序中选择不同位置，以检查摄像头的移动并观察其响应情况。从培养箱中取出样品板，将其放入五个指定位置，并让胚胎静置数分钟。在图形用户界面程序中，点击“Record”，新窗口将出现。在此窗口中，选择先前准备好的配置文件。确认样品描述与每个位置上的样品相符。观察程序激活声脉冲时LED灯亮起的情况。记录完成后，相机会返回至位置一，软件开始压缩文件。将已测量的样品替换为下一组样品，并按演示进行下一次运行。然后使用筛网从所有已测量的培养板中收集曝光溶液，同时保留胚胎。开始数据分析时，使用 VirtualDub 或其他视频查看软件打开视频数据。通过视觉观察并记录对声音脉冲产生反应的胚胎数量。在电子表格中记录化合物名称、重复次数、化合物浓度以及不动胚胎的百分比。使用嵌入 R 脚本的 KNIME 工作流进行基准浓度分析。对未经处理的野生型胚胎在振动刺激下的不活动性进行评估，结果显示其平均不活动性为 14.33%，且在不同产卵批次间存在差异。三卡因对运动能力影响的基准浓度计算表明，在 1% 浓度下运动能力下降，浓度高于 2.5% 时活动完全停止，基准浓度 50 为 164.9 微摩尔。一个次优的实验示例显示出胚胎反应不一致，提示发育问题可能影响惊吓反应的稳健性。

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使用斑马鱼振动惊吓反应筛查系统评估化学品的毒性

本文使用斑马鱼胚胎进行化学毒性筛选。化学毒性与表型读数相关。示例方案展示了开展化学毒性筛选的方法学途径。...

基于胚胎的化学毒性筛选：评估对发育中斑马鱼胚胎的影响

斑马鱼胚胎可用于评估化学化合物的毒性。其胚胎体外发育，对化学物质敏感，能够检测出细微的表型变化。该实验仅需少量化合物，可直接加入含有胚胎的培养板中，使检测系统高效且经济。...

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利用视动反应研究斑马鱼的视觉功能

蛋白质印迹：从样品制备到检测

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一种利用斑马鱼幼虫荧光素酶报告系统进行糖皮质激素信号通路的化学筛选流程

了解使用斑马鱼胚胎振动惊吓反应行为检测法评估化学品神经肌肉毒性与致死性的高通量体内毒性筛选技术。该方法利用Danio rerio模型快速识别干扰神经或肌肉功能的化合物，具有成本低、可定制且易于维护的优势，适用于PrecisionTox联盟等多模型生物毒性通路研究与人类毒性预测。

利用斑马鱼振动惊吓反应筛选系统评估化学品的毒性

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