琼脂糖珠制备 脓肿分枝杆菌 通过气管内接种免疫活性小鼠

我们正在建立一种慢性脓肿分枝杆菌肺部感染的小鼠模型，用于在临床前研究中测试抗生素的疗效。第一个挑战是克服小鼠对脓肿分枝杆菌的天然抗性。第二个挑战是制备可重复的、包埋于琼脂珠中的细菌批次，用于气管内感染。我们希望分享一份详细的琼脂珠制备与感染操作方案，以便其他实验室能够轻松实施，用于在小鼠中测试新药。

通过使用嵌有细菌的琼脂珠感染，而非游离细菌感染，可在一定程度上克服免疫功能健全小鼠自发清除感染的能力。该模型为评估新型抗生素对抗脓肿分枝杆菌提供了可靠的临床前工具，有助于发现和开发针对肺部感染的急需抗生素。

[讲师] 首先，获取处于对数生长期的脓肿分枝杆菌（mycobacterium abscessus）悬浮培养物，并将其调整至光密度为30。将预先在50摄氏度下平衡的27毫升熔融三胰蛋白胨大豆琼脂（triptych soy auger）转移至含有3毫升细菌悬浮液的试管中。使用移液器混匀悬浮液。小心地将细菌-琼脂混合物移入一个含有60毫升矿物油的烧瓶中。将烧瓶置于次级容器内，并立即使用磁力搅拌器和磁力搅拌子以中等速度开始搅拌。确保油-琼脂混合物中形成可见的涡流，并在室温下持续搅拌6分钟。向次级容器中加入冰块，使悬浮液冷却。随后将浆状混合物转移至250毫升离心管中。在前五个循环中，于4摄氏度下以3,700 G离心6分钟，然后用DPBS重悬琼脂珠沉淀。同时，将一个漏斗式细胞滤筛、连接环和一个50毫升离心管组装成一个整体单元。在第10次洗涤后，重悬沉淀并将其稀释四倍。将稀释后的样品加至滤筛上以过滤珠悬液。缓慢拉动连接在连接环上的30毫升注射器活塞，产生负压以促进过滤。然后在1,000 G下离心稀释后的悬液2分钟以进行浓缩。将珠沉淀收集至50毫升离心管后，于4摄氏度保存，最多可保存一周，但每次实验批次均需制备新鲜的珠。开始操作时，使用定制设计的三维打印倾斜支架固定已镇静的CD-1小鼠。通过缝合线将小鼠的门齿固定在支架中央杆上，使其呈腹侧卧位且头部抬高。将一根金属24号动物喂养针连接至装有脓肿分枝杆菌琼脂珠悬浮液的玻璃注射器上。在推杆上安装尼龙夹或塞子，以确保每只小鼠接种量精确控制为50微升。将金属灌胃针垂直置于小鼠上方，小心地从上方插入并进一步滑入气管。移除尼龙夹或塞子，缓慢将50微升的脓肿分枝杆菌琼脂珠悬浮液注入肺部。让小鼠静置5分钟。随后重复接种操作一次，以确保全部接种物在肺内实现深度且可重复的沉积。含有脓肿分枝杆菌的琼脂珠表达mCherry红色荧光蛋白，粒径范围约为70至250微米。六次独立制备的珠样品中细菌载量表现出高度可重复性。在通过玻璃注射器前后进行的细菌计数显示，细菌载量无显著损失。通过感染后24小时肺组织CFU计数结果表明，该气管内接种方法在三次独立珠制备中具有可重复性。三位独立操作者之间的感染可重复性也通过感染后24小时肺组织CFU计数结果得到验证，所有组间数据保持一致。