Name: 基于远交系小鼠的牙髓炎动物模型及其组织学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: 学习使用NMRI远交系小鼠建立可重复的牙髓炎动物模型，通过牙髓暴露和Zymosan诱导炎症，结合标准化组织学流程进行定量分析。该模型支持72小时内时间依赖性炎症研究，为牙科炎症生物学研究提供可靠工具。

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本研究为自筹资金。作者感谢信德省健康科学大学组织学系穆罕默德·阿迪尔先生在组织学方面提供的帮助。

本动物实验的设计遵循 ARRIVE 指南。该动物实验已获得杜大学健康科学动物研究与伦理机构审查委员会批准（批准文件编号：AR.IRB-06/DUHS/Approval/2016/05）。实验方案共包括 70 只 NMRI 小鼠。实验动物来源于杜大学先进生物与动物研究中心中央动物房设施。本方案的样本量依据先前的一项研究8确定。
1. 动物
注意：用于研究的动物体重为 26–30 g，在标准笼具中饲养，环境条件如下：温度 ±21 °C，相对湿度 ±55%，光照/黑暗周期为 12 小时/12 小时，并可自由获取过滤饮用水和标准饲料（正常颗粒饲料）。定期监测动物是否出现攻击行为、不适或刺激症状。若出现疼痛或不适，将使用双氯芬酸钠（按动物体重 26–30 g 计算，皮下注射 200 µL，剂量为 167–192&#160;mg/kg）。所有动物在进行任何实验前均适应环境两周。每组十只动物分别饲养在标记适当的笼具中。为进行动物识别，使用标记物在其尾部做标记。
<ol>
	<li>将动物（n=70）随机分为两组：A组（n=35）和B组（n=35）。</li>
	<li>在A组中，仅通过暴露牙髓诱导牙髓炎（参见步骤4.1.1至步骤4.1.9）。</li>
	<li>对B组动物，在暴露的牙髓上施用Zymosan溶液（参见步骤4.2.1至步骤4.2.3）。</li>
</ol>
2. 酵母聚糖溶液
<ol>
	<li>按照以下所述的先前已发表的方法制备Zymosan溶液18。</li>
	<li>使用磷酸盐缓冲液（PBS）将1 mL的Zymosan配制成1 mg/mL的溶液。</li>
	<li>在121 °C下高压灭菌15分钟。</li>
	<li>让溶液在室温下冷却1小时。</li>
	<li>在4 °C、300 × g 条件下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并用预冷的无菌PBS重悬沉淀，重复离心洗涤三次。</li>
	<li>将溶液于4 °C保存，以备后续使用。 
	注意：该溶液必须在30天内使用，超过此期限后应予以丢弃。</li>
</ol>
3. 下颌回缩夹
<ol>
	<li>使用 0.7 mm 不锈钢正畸钢丝制作下颌牵张夹。</li>
	<li>取一段 100 mm 长的钢丝，在其中心位置弯制成一个直径为 5 mm 的环。</li>
	<li>从环的两侧各向两端 5 mm 处，将钢丝两部分整体向外弯曲 15 mm，呈直角，避免形成锐角弯折。</li>
	<li>从弯曲处起 25 mm 处制作一个凹槽，并将剩余末端向外翻折。可参考 图 1A 进行操作。</li>
</ol>
4. 动物模型
<ol>
	<li>实验组 A（n = 35）
	<ol>
		<li>通过腹腔注射 Ketamine-Xylazine 混合液（87.5 mg/kg Ketamine + 12.5 mg/kg Xylazine）对动物进行麻醉，剂量为 0.1 mL/20 g。</li>
		<li>所有操作均使用10倍倾斜长臂体视显微镜进行（图1B）。调整倾斜臂角度，使动物上颌切牙回缩后可被直接观察到（图1C）。</li>
		<li>捏紧夹具，并将带凹槽部分置于夹具两侧的上颌与下颌门齿之间。</li>
		<li>松开夹具后，使用胶带固定其两端（图1C）。</li>
		<li>用非操作手使用牙科镊子撑开动物的面颊（图1D、E）。 
		注意：避免施加过大压力。镊子造成的损伤可能导致动物致命性出血甚至死亡。</li>
		<li>在电动微型马达驱动下，使用E型低速手机连接#1/4号圆形碳钢车针，在10倍放大条件下于右侧上颌第一磨牙中央钻至约一半深度，制备I类洞型。此时可能观察到牙髓阴影（图1D、E）。</li>
		<li>以缓慢转速轻柔地以扫动方式操作车针。使用电动马达控制转速（RPM）。</li>
		<li>使用K型15号根管锉暴露牙髓（图2B）。 
		注意：使用#15号根管手动器械时必须极为轻柔，否则将导致根分叉穿孔，而该穿孔仅在制备组织学切片后方可被发现。#1/4号圆形碳钢车针直径为0.25 mm，#15K型锉针宽度为0.15 mm。因此，牙髓暴露尺寸应为0.15 mm（图2C）。</li>
		<li>保持牙髓暴露状态，以诱导牙髓炎形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验组 B（n = 35）
	<ol>
		<li>重复步骤4.1中的所有操作，并额外执行以下步骤。</li>
		<li>使用微量移液器（0.2–2 µL）将0.2 µL预先配制的Zymosan溶液滴加至暴露的牙髓表面。 
		注意：滴加Zymosan溶液时需格外小心。若溶液意外溢入口腔，可能导致动物死亡。因此，应使用纱布覆盖牙齿，以吸收多余的Zymosan溶液（图2D）。</li>
		<li>保持处理后的牙髓开放，利用Zymosan溶液诱导牙髓炎。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 样品制备
<ol>
	<li>在0、6、9、12、24、48和72小时，每组分别通过吸入二氧化碳处死五只动物19。</li>
	<li>使用一个7.25 L的安乐死&#160;舱。</li>
	<li>不要预先向舱内充入CO2。</li>
	<li>直接将动物放入舱内。</li>
	<li>以每分钟30%至70%舱体积的速率注入100% CO2。</li>
	<li>将CO2的流速保持在5 L/min。</li>
	<li>对CO2进行预热，并使其与舱内空气充分混合。</li>
	<li>观察动物在23分钟内是否出现意识丧失的迹象。</li>
	<li>监测动物呼吸停止以及眼球变灰的情况。</li>
	<li>在呼吸停止后，继续通入CO2至少1分钟。</li>
	<li>在将动物从舱内取出前确认其死亡，确保无呼吸且眼球呈苍白状。</li>
	<li>在实施安乐死后立即分离动物头部。</li>
	<li>将0小时处死动物左侧未经处理的上颌第一磨牙作为对照。</li>
	<li>将上颌骨置于适当标记的15 mL锥形管中，用10%缓冲福尔马林固定保存2天。</li>
</ol>
6. 组织学
<ol>
	<li>将固定的颌骨置于10%甲酸中脱钙3天。 
	注意：第3天后，检查手术刀是否能够切割颌骨。如果仍不够软，需再次浸入10%甲酸中，并每日检查，直至可用手术刀切割。</li>
	<li>使用22号刀片切割颌骨。切口应平行于咬合平面，沿矢状面进行，刀片紧贴上颌磨牙腭侧尖的腭侧（图3A）。</li>
	<li>用碳素墨水标记所有牙齿的咬合面。 
	注意：此标记有助于在切片过程中识别咬合面（图3B）。</li>
	<li>将切好的颌骨平放在不锈钢底模套内，切面朝下紧贴模底，用石蜡包埋。 
	注意：以这种方式包埋可确保切面首先进入切片机，样本方向正确，并产生如图3E所示的矢状切片。</li>
	<li>从底模中取出含有包埋颌骨的包埋盒，放入切片机中。</li>
	<li>切取3 µm厚的矢状切片，并将其贴附于洁净、带电荷的显微镜载玻片上（图3C）。</li>
	<li>在复式显微镜下观察未染色的切片。 
	注意：持续观察切片，直至在咬合面上可见到髓腔。若切片沿上颌第一磨牙长轴的矢状面正确切取，则可观察到完整的髓室，显示一个或两个牙根及髓腔（图3E）。从此时起，理论上每一切片可制备50张切片，因为暴露尺寸为0.15 mm（3 µm = 0.003 mm，0.003 × 50 = 0.15）。</li>
	<li>对显示一个或两个牙根以及完整髓腔的选定切片，进行标准的苏木精-伊红染色步骤。</li>
	<li>在复式显微镜下观察染色后的切片。</li>
	<li>在每个时间点选择五张最佳切片，以便观察最大范围的髓腔空间。</li>
</ol>
7. 统计学分析
<ol>
	<li>使用标准统计软件进行统计分析。 
	注意：对于定量组织形态学分析，根据已发表的评分标准（表 1）8，对每个时间点观察的切片进行评分。采用Kruskal-Wallis H检验并以Bonferroni校正（p=0.0018）比较不同时间点的评分结果；采用Mann-Whitney U检验（p ≤ 0.05）比较A组与B组。所有统计分析均使用标准统计软件完成。</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本方案首次在已发表文献中建立了NMRI小鼠的3型牙外伤模型（不可逆性牙髓炎）。同时详细描述了酵母聚糖诱导的牙髓炎症的组织学分析，并提供了一种可重复的动物下颌组织切片制备方法。
按照本方案，已在NMRI小鼠中成功建立了一种3型牙外伤模型。既往相关研究多在大鼠、兔和犬上进行1,2,3,4。由于口腔空间较大，大型动物更易于建立牙髓炎模型。尽管小鼠等小型动物口腔空间极为狭窄，但其优势在于可实现较大的样本量且伦理问题较少20,21。在小鼠品系中，C57BL/6和BALB/c品系已有广泛报道5,6,...

已有多种动物模型被用于牙髓炎的研究1,2,3,4。其中，C57BL/6 和 BALB/c 小鼠模型在牙髓炎研究中被专门报道5,6,7,8。这两种均为近交系小鼠，对繁殖条件有严格要求7,9。本实验方案中使用的 NMRI 小鼠属于远交系，相较于近交系具有多项优势。其建立和维持成本较低，繁殖率高，免疫能力更强，死亡率更低，从而实现种群更早且更大的更替10。因此，在操作和经费上更具可行性11。此外，我们的结果表明，该模型所诱发的牙髓炎症疾病表型与既往在近交系小鼠中报道的模型相似5,6,8。并且，NMRI 小鼠可耐受牙髓暴露于酵母聚糖（Zymosan）长达 72 小时，并发展出可观察的疾病表型。这为研究牙髓炎提供了可替代其他近交系小鼠的可行模型12。
Zymosan 是酵母细胞壁的提取物 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 主要由几丁质、甘露聚糖、甘露糖蛋白和β-葡聚糖组成13. 酵母聚糖和 白色念珠菌 具有相似的细胞壁结构，并可被宿主先天免疫系统识别 通过 C型凝集素，病原体识别受体，Dectin-114Dectin-1 主要由树突状细胞和巨噬细胞表达，可识别真菌病原体中的β-葡聚糖，并通过 Syk/CARD9 信号通路促进炎性介质的生成。15因此，Zymosan 是研究暴露效应的一种可行替代方法。 C. albicans 而不是使用该生物体研究牙髓疾病16这一点得到了我们先前发表结果的支持，该结果表明在暴露于酵母聚糖的牙髓组织中可早期检测到 Dectin-1 转录本。类似地，也观察到表达 Dectin-1 的 CD68+ 阳性巨噬细胞。12.
以往文献中描述的组织学技术通常不足以使新手研究人员有信心地重复实验。因此，往往需要进行大量试错，导致在优化组织学操作过程中造成不必要的动物损耗。本方案对切片制备技术进行了标准化，并已成功应用于大鼠17。本文详细描述了牙髓炎模型的所有关键步骤，包括可重复的下颌牵开方法、通过牙髓暴露诱导牙髓炎、使用酵母多糖（Zymosan）诱导牙髓炎症，以及后续的组织学分析。

<table><tbody><tr><td>基模</td><td>Histo-line Laboratories，意大利</td><td>R4166C2:D23</td><td>用于将样本包埋于石蜡中</td></tr><tr><td>1/4号圆形碳钢钻头</td><td>美国德克萨斯州威奇托福尔斯</td><td>389101</td><td></td></tr><tr><td>Motic BA310 复合显微镜</td><td>Motic Inc. Co. Ltd, 中国香港</td><td>https://moticmicroscopes.com/products/ba310e</td><td></td></tr><tr><td>双氯芬酸钠 25mg/mL</td><td>Indus Pharma (DYCLO)</td><td>https://sahar.ph/product/dyclo-diclofenac-sodium-25-mg-ml-im-iv/</td><td>200&amp;micro;皮下注射 L</td></tr><tr><td>E型低速手机 Rose201-M4</td><td>中国佛山</td><td>https://www.beingfoshan.com/zh/h-pd-353.html</td><td></td></tr><tr><td>包埋盒&amp;nbsp;</td><td>Histo-line Laboratories，意大利</td><td>R4004</td><td></td></tr><tr><td>安乐死舱</td><td>ConductScience，美国伊利诺伊州</td><td>CS-EUTH2A</td><td>7.25 升容量，适用于小鼠和大鼠［体重不超过 500 克］</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>巢蛋白</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>158127</td><td>缓冲的&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲酸&amp;nbsp;</td><td>BDH 实验室用品，普尔，英格兰&amp;nbsp;</td><td>28428</td><td>10%</td></tr><tr><td>匀浆器&amp;nbsp;</td><td>Omni Mixer 匀浆器，Omni International，佐治亚州，美国</td><td>https://omni-inc.com/high-shear-lab-homogenizers/omni-th-0-2ml-100ml/omni-tissue-homogenizer-th</td><td></td></tr><tr><td>印度墨水</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>198285</td><td></td></tr><tr><td>K型15号根管锉</td><td>Mani，日本</td><td>https://www.mani.co.jp/en/product/dental_01.html</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮-赛拉嗪混合剂</td><td>Brookes Pharma Pvt Ltd / Mylab (Pvt.) Ltd.</td><td></td><td>87.5 mg/kg 氯胺酮 + 12.5 mg/kg 赛拉嗪</td></tr><tr><td>Microtome HM 315 R</td><td>德国 Microm</td><td>901100</td><td></td></tr><tr><td>Micro-motor Marathon-III</td><td>BT-Marathon，Saeyang Microtech Co., Ltd. 韩国</td><td>https://www.saeyang.com/theme/basic/sub/product/view.php?it_id=1752202111</td><td>以最大速度的1/3使用</td></tr><tr><td>微量移液器 0.2-2 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>吉尔森，法国</td><td>https://www.gilson.com/default/&lt;br/&gt; 移液器-p2-0-2-2-微升-金属&lt;br/&gt; -ejector.html?srsltid=AfmBOoobE&lt;br/&gt; 0iSWY_902ZHGZ7AoJ6wzN5PI&lt;br/&gt; 0H4V4vkxHQgK1mq7Wg2kkbS</td><td>0.2-2 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>社会科学统计软件包</td><td>IBM，纽约州阿蒙克</td><td>SPSS for Mac 版本 23.0&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜BMK-3 led</td><td>明治科技，日本</td><td>https://meijitechno.com/product/bmk-3-led-stereo-microscope/</td><td></td></tr><tr><td>22号手术刀片</td><td>Feather外科手术刀，Feather Safety Razor有限公司，日本大阪</td><td>FB. 12</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 Z4250</td><td>1 mg/mL，来自 1 mL Zymosan</td></tr></tbody></table>

基于远交系小鼠的牙髓炎动物模型及其组织学分析

An Animal Model of Pulpitis Based on an Outbred Mice Strain and Its Histological Analysis

此前未见关于使用海军医学研究所（NMRI）小鼠建立牙髓炎模型的报道。在本实验方案中，我们介绍了一种采用NMRI小鼠的动物模型，并提供了详细的牙髓炎模型组织学操作步骤，以确保可重复性。本研究共纳入70只NMRI小鼠，随机分为两组：A组（n=35），仅通过牙髓暴露诱导牙髓炎；B组（n=35），在牙髓暴露后应用酵母多糖（Zymosan）。对右侧上颌磨牙进行牙髓暴露后，于预定时间点（0、6、9、12、24、48和72小时）处死动物，取上颌骨进行组织学及定量组织形态学分析。组织学分析显示，两组炎症反应均随时间呈逐渐加重趋势。两种动物模型均可用于观察长达72小时的炎症过程。本文所介绍的技术具有良好的可重复性，有助于牙髓炎组织学研究的标准化。

本方案中，我们介绍了在NMRI小鼠中建立牙髓炎的两种动物模型及其相应组织学方法的详细分步操作流程。合适的设备对于本方案的成功至关重要。其中，10倍倾斜长臂体视显微镜是最关键的设备。使用电动微型马达以约其最大转速的三分之一（35,000 rpm）进行I类洞型预备，使操作更易控制，并无需使用压缩空气。
图1&#160;和图2展示了倾斜长臂体视显微镜在该动物模型中的应用价值。倾斜的镜臂可实现对动物口腔的直接观察。图1A显示了夹颌装置的尺寸。尽管提供了具体测量数值，但无需完全按照该尺寸制作。通过反复尝试，操作者可选择最适合自己使用的尺寸。图2展示了窝洞制备和牙髓暴露的操作步骤。建议采用间歇性窝洞制备方式，以避免产生过多热量。可使用吹气装置散热并清除切割产生的碎屑。在使用K锉进行牙髓暴露前，可用一小块无菌湿纱布清洁窝洞。在用微量移液器滴加Zymosan溶液...

本文介绍了一种在NMRI（Naval Medical Research Institute）小鼠中建立牙髓炎模型的实验方案。此外，还描述了制作下颌牵开夹以及从动物下颌制备组织学切片的步骤。通过遵循标准化的操作流程，可避免方法学和实验结果的变异。

海军医学研究所（NMRI）小鼠此前未见报道用于建立牙髓炎模型。在本方案中，我们……

本研究建立了一种利用NMRI小鼠作为研究牙髓炎发生发展及其潜在机制的模型。现有方法缺乏足够的细节，导致需要反复试验并造成不必要的动物损耗。本方案对牙髓炎的诱导与分析进行了标准化。首先，取一根长度为100毫米、直径为0.7毫米的不锈钢正畸钢丝，在其中心位置弯成一个直径为5毫米的环。从环的两侧各5毫米处将钢丝以直角弯曲，注意避免形成锐角折弯。从每个直角弯折处起量25毫米，做一标记，然后将自由端向外弯折。为诱导牙髓炎，首先将所需数量的小鼠分为 A 组和 B 组。麻醉小鼠后，调节 10 倍长臂体视显微镜，以获得上颌牙齿的直接视野。然后，捏紧夹子，并将带缺口的部分置于上颌与下颌切牙之间的两侧。松开夹子，并用胶带固定自由端。夹子就位后，使用牙科镊子撑开动物的颊部。随后在 10 倍放大倍数下，使用低速手机配编号 1/4 的圆形碳钢钻针，在右侧上颌第一磨牙中央制备深度为牙本质半层的 I 类洞形。以低速轻柔操作钻针，采用扫掠式运动。接下来，使用 15 号 K 型根管锉暴露牙髓。对于 A 组，使牙髓保持暴露以诱导牙髓炎。对于 B 组，在暴露的牙髓上滴加 0.2 µL 的酵母多糖（Zymosan）溶液，并保持牙髓暴露以诱导牙髓炎。动物安乐死后，获取固定后的上颌骨，将其置于10%甲酸溶液中脱钙三天。使用22号刀片沿与𬌗平面平行且与矢状面一致的方向进行切口，然后将刀片置于上颌磨牙腭侧，对准腭尖水平进行切割。用印度墨水标记𬌗面以保持方向定位。将熔化的石蜡倒入不锈钢底模中，将切割后颌骨的切面朝下嵌入模具底部，待蜡块完全凝固。随后将凝固的蜡块从模具中取出，并固定于切片机上。将切片机切片厚度调整为3微米，切取矢状切片，并将切片转移至洁净的带电载玻片上。在复式显微镜下依次检查切片，直至𬌗腔清晰可见。确认完整的髓腔及一至两个根管，以验证矢状切片方向的准确性。两组的组织学图像显示，与对照组织相比，炎症反应在0至72小时内呈进行性增加。高倍镜下的图像证实了红细胞外渗及坏死区域的存在。组织形态学分析显示，两组随时间推移炎症反应均呈进行性加重，不同时间点之间的差异显著，表明炎症反应呈时间依赖性增加。该方案使研究人员能够在预定的时间间隔内评估长达72小时的牙髓炎症反应。在建立本方案的过程中，最大的挑战是优化组织学处理步骤，而这些步骤在已发表的文献中往往缺乏详细的方法学描述。未来的研究可利用此模型探讨牙髓再生策略及对牙髓炎症的靶向调控。

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