Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Materialien
Puffer
<ol><li>Waschpuffer: 1 X sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium oder Magnesium</li>
	<li>Fixationspuffer: 1% Paraformaldehyd in PBS</li>
	<li>Permeabilisationspuffer: 0,1% Triton X-100 in PBS</li>
	<li>Sperrpuffer: 1% Rinderserumalbumin in PBS</li>
	<li>Zellwachstumsmedium: DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), Penicillin/Streptomycin und L-Glutamin</li>
</ol>ausrüstung
<ol start="6"><li>Laminare Durchflusshaube</li>
	<li>Befeuchtter Inkubator (37°C, 5%CO2)</li>
	<li>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop; hier, Nikon Eclipse Ti Laser</li>
</ol>Materialien und Reagenzien
<ol start="9"><li>Kammerzellenkultur-Dias</li>
	<li>Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI (zur Färbung von Kernen)</li>
	<li>Mikroskopabdeckung Glas</li>
	<li>Zarte Aufgabentücher</li>
	<li>Pipettierer und Spitzen</li>
</ol>Assay Spezifische Reagenzien
<ol start="14"><li>Anhimierbare Zellen (primäre Zellen oder Zelllinien); hier wurden Maus-Fibroblasten verwendet, die mit CD1d transfiziert wurden (LCD1).</li>
	<li>Primäre Antikörper zum Nachweis zellulärer Ziele; hier wurden Ratten-Anti-Maus-CD107a (LAMP-1) und Maus-Anti-Maus-CD1d verwendet.</li>
	<li>Fluorophorkonjugierte sekundäre Antikörper, die für primäre Antikörper-Isotypen spezifisch sind; hier wurden Ratten-Anti-Ratten-IgG-konjugierte Alexafluor 488 und Anti-Maus-IgG-konjugierte Alexafluor 647 verwendet.</li>
</ol>2. Protokoll
Vorbereitung auf Antikörperfärbung
Säzellen
<ol><li>Setzen Sie die Zellen des Interesses an Wachstumsmedien aus.</li>
	<li>Dann säen Sie 500 l der Zellsuspension/pro Brunnen in die Brunnen einer 4-Well-Kammerrutsche. (Hier wurden LCD1-Zellen mit 2,5x105 Zellen/Kammer in 500 l Wachstumsmedien gesät. Die Saatdichte kann zwischen den Zelllinien variieren).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kammer über Nacht in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C, damit die Zellen am Glas haften können.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Medien aus jedem Brunnen aspirieren und dann die Zellen 1X mit 500 L PBS waschen.</li>
</ol>fixierung
<ol start="5"><li>Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 500 l 1% Paraformaldehydlösung in jeden Brunnen und inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nach der Inkubation das Paraformaldehyd in einen geeigneten Behälter für gefährliche Flüssigkeitsabfälle einsammeln.</li>
	<li>Waschen Sie dann die Zellen 3 mal mit 500 L PBS, um alle Reste des Fixiermittels zu entfernen.</li>
</ol>Permeabilisierung
<ol start="8"><li>Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie bei Raumtemperatur 15 Minuten lang mit 500 L Permeabilisationspuffer/Well inkubieren.</li>
	<li>Dann waschen Sie die Zellen kurz 3 mal mit 500 l PBS.</li>
</ol>Blockieren
<ol start="10"><li>Inkubieren Sie die Zellen in jedem Brunnen mit 500 l Blockierpuffer für 1 Stunde bei 4°C, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.</li>
</ol>Primäre Antikörper-Inkubation
<ol start="11"><li>Saugen Sie den Sperrpuffer aus den Schiebekammern.</li>
	<li>Fügen Sie dann den Zellen 500 l verdünnte Primärantikörperlösung hinzu. (Hier wurde Anti-CD107a (LAMP-1) 1:500 verdünnt und Anti-CD1d unverdünnt verwendet (1H6 monoklonaler Antikörper wurde freundlicherweise von Dr. Randy Brutkiewicz zur Verfügung gestellt).)</li>
	<li>Inkubieren Sie die Dias über Nacht bei 4°C.</li>
</ol>Hinweis: Wenn Sie nach mehr als einem Ziel suchen, stellen Sie sicher, dass die primären Antikörper unterschiedliche Isotypen sind. Die empfohlenen Antikörperkonzentrationen variieren zwischen den Herstellern und sollten vor der Anwendung titriert werden.
Sekundäre Antikörperinkubation
<ol start="14"><li>Aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung aus den Brunnen.</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnenkammern 4 mal mit 500 l PBS.</li>
	<li>Fügen Sie dann jedem Brunnen 500 l der verdünnten Sekundärantikörperlösung hinzu. (Hier wurden sowohl die sekundären Antikörper - Anti-Maus-IgG Alexafluor 647 als auch Anti-Ratten-IgG Alexafluor 488 1:2000 im Sperrpuffer) verdünnt.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur 1 h im Dunkeln bebrüten.</li>
	<li>Nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung ansaugen.</li>
	<li>Waschen Sie die Kammern 4 Mal mit 500 L PBS, um alle ungebundenen sekundären Antikörper zu entfernen.</li>
</ol>Hinweis: Die empfohlenen Antikörperkonzentrationen variieren je nach Hersteller und sollten vor der Anwendung titriert werden. Bei der Suche nach mehr als einem Ziel müssen sekundäre Antikörper mit verschiedenen Fluorophoren mit einzigartigen Anregungs-/Emissionsspektren konjugiert werden. Beachten Sie auch die Anregung/Emission des nuklearen Gegenflecks (d.h. DAPI) bei der Auswahl der Fluorophore. Die Fluorophorauswahl kann durch die Laserkonfiguration des verwendeten Konfokalmikroskops beeinflusst werden. Die Laserkonfiguration der Maschine bestimmt, welche Fluorophore für das Experiment geeignet sind.
3. Montage von Abdeckungen
<ol><li>Entfernen Sie zunächst die Kammern vorsichtig von der Rutsche.</li>
	<li>Halten Sie dann die Folie im Winkel über einem empfindlichen Aufgabenwischen und entfernen Sie die Flüssigkeit von den Rändern, ohne die Zellen zu berühren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 Tropfen Antifade-Montagemedium, das den kerntechnischen Fleck DAPI enthält, auf jeden Zellabschnitt ein.</li>
	<li>Als nächstes legen Sie einen 20 mm x 60 mm Coverslip über den Schlitten, indem Sie ihn mit den Fingerspitzen über die Kanten halten. (Vermeiden Sie blasenbildung über den Zellen, da sie die Bildgebung stören).</li>
	<li>Wischen Sie jedes zusätzliche Montagemedium an den Seiten mit einem zarten Aufgabenwisch ab und lagern Sie die Dias im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zu einer Woche.</li>
</ol>4. Konfokale Bildgebung
Bildproben auf einem konfokalen Laserscanmikroskop. Für die in Abbildung 2 dargestellten Daten wurde die Nikon Eclipse Ti A1R mit der Software NIS Elements Advanced Research verwendet. Im folgenden Abschnitt wird das Verfahren zum Erfassen von Bildern mit der oben genannten Software beschrieben.
<ol><li>Um mit der Bildgebung der Zellen zu beginnen, öffnen Sie die 'NIS Elements Advanced Research Software', indem Sie auf das 'NIS-Softwaresymbol'klicken.</li>
	<li>Als nächstes klicken Sie im Kontrollfenster auf die Registerkarte "TiPad" und wählen Sie das gewünschte Ziel für die Bildgebung aus. (Hier wurde das erste 40x Objektiv verwendet).</li>
	<li>Laden Sie den Dia mit Zellen auf die Bühne und zentrieren Sie ihn unter der Linse.</li>
	<li>Jetzt, auf der Registerkarte 'A1plus Compact GUI', richten Sie die Laser passend für die verwendeten Fluorophore ein. Klicken Sie auf das Zahnradsymbol, um das Farb- und Spektraleinstellungsmenü zu öffnen und die benötigten Kanäle auszuwählen und den Laser für jeden Kanal einzustellen.</li>
	<li>Wählen Sie dann die entsprechenden Emissionen im Dropdown-Menü unter dem ersten dichroitischen Spiegel aus.</li>
	<li>Als nächstes, unter 'A1plus Compact GUI' Fenster, klicken Sie auf 'Ch. Series', um die Line-Channel-Serie einzurichten, die festlegt, ob die verwendeten Laser gleichzeitig oder sequenziell auf die Probe feuern. (Hier wurden sequentielle Pässe gewählt, beginnend mit Kanal 1, gefolgt von Kanal 2, dann 4).</li>
	<li>Danach beginnen Sie mit dem Scannen, indem Sie oben auf das Symbol "Pfeilspitze"klicken. An diesem Punkt, während die Bildgebung live ist, klicken Sie unter 'A1plus Compact GUI' Fenster auf die Schiebeskala und ändern Sie die Lochgröße, um sicherzustellen, dass das Fokuslicht nicht mehr angezeigt wird. (Hier wurde die niedrigste verfügbare Einstellung (0,5) verwendet.</li>
	<li>Passen Sie als Nächstes die Einstellungen "Hochspannung"und"Offset"unter jedem Laser auf entsprechende Werte an, indem Sie die Gleitwaagen verwenden, um die Erkennung der spezifischen Färbung zu ermöglichen und gleichzeitig mögliche Hintergrundfärbungen zu begrenzen. Wenn eine positiv befleckende Probe verfügbar ist, beginnen Sie mit der Abbildung dieser Probe für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass die Lasereinstellungen optimale Signal-Rausch-Verhältnisse liefern. Achtung: Eine hohe Laserintensität über einen längeren Zeitraum kann zu Photobleichungen führen.
</li>
	<li>Nachdem Sie die optimalen HV- und Offsetwerte für jeden Laser eingestellt haben, klicken Sie auf die Registerkarte "ND-Erfassung"und wählen Sie dann das 'Z'-Symbol aus, um die Parameter für die Z-Serie einzurichten. Als nächstes, beim Erfassen eines Live-Bildes der Probe, setzen Sie zuerst den unteren Rand des Bildes, indem Sie den unteren Rand des Bildes finden und auf die Schaltfläche"unten"klicken, dann finden Sie die obere Position des Beispiels und klicken Sie auf die Schaltfläche "oben". Legen Sie die Schrittgröße fest, indem Sie für jeden Schritt die bevorzugte Schrittgröße in die Größe von m eingeben oder angeben, wie viele Schritte insgesamt erforderlich sind.</li>
	<li>Nachdem die Parameter der Z-Serie eingestellt wurden, wählen Sie die gewünschte Größe/Pixelauflösung des Bildes aus. Klicken Sie dazu auf das Fenster 'A1plus Compact GUI' und wählen Sie unter dem Symbol 'Größe'die gewünschte Auflösung aus. Um das Rauschen des Bildes zu verringern, kann man das Dropdown-Menü neben dem Symbol'' wählen, um die ausgewählte Anzahl von Bildern zu durchschnittlichzumittelieren.</li>
	<li>Klicken Sie nun auf die Registerkarte 'Jetzt ausführen' im' ND-Erfassungsmenü', um mit der Bildgebung des Beispiels zu beginnen.</li>
	<li>Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild, indem Sie auf 'Datei' und dann 'Speichern unter' klicken, wodurch die Bilddatei mit der Erweiterung'.nd2'exportiert wird. Wiederholen Sie schließlich den Vorgang für jede der anderen Stichproben.</li>
</ol>

Konfokale Fluoreszenzfärbung ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu extrem hochwertigen Bildern von Proben führt, die ähnlich wie bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie hergestellt werden. Kurz gesagt, Proben werden fixiert, permeabilisiert und dann blockiert. Primäre Antikörper gegen ein Protein oder Proteine von Interesse dürfen binden, dann werden fluorophorkonjugierte sekundäre Antikörper verwendet, um die Färbung zu visualisieren. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie hat Anwendungen in vielen Forschungsbe...

konfokale fluoreszenzmikroskopie: eine technik zur bestimmung der lokalisierung von proteinen in maus-fibroblasten

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Quelle: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201 2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201
Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist eine bildgebende Technik, die eine höhere optische Auflösung im Vergleich zur herkömmlichen "Weitfeld"-Epifluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Konfokale Mikroskope sind in der Lage, eine verbesserte x-y optische Auflösung durch "Laserscanning" zu erreichen - typischerweise eine Reihe von spannungsgesteuerten Spiegeln (Galvanometer oder "Galvo"-Spiegel), die Laserbeleuchtung auf jedes Pixel der Probe zu einem Zeitpunkt leiten. Noch wichtiger ist, dass konfokale Mikroskope eine überlegene z-axiale Auflösung erreichen, indem sie ein Loch verwenden, um aus fokussiertem Licht zu entfernen, das von Orten stammt, die sich nicht in der zu scannenden Z-Ebene befinden, wodurch der Detektor Daten von einer bestimmten Z-Ebene sammeln kann. Durch die hohe Z-Auflösung, die in der konfokalen Mikroskopie erreichbar ist, ist es möglich, Bilder aus einer Reihe von Z-Ebenen (auch z-stack genannt) zu sammeln und ein 3D-Bild durch Software zu konstruieren.
Bevor Sie den Mechanismus eines konfokalen Mikroskops diskutieren, ist es wichtig zu überlegen, wie eine Probe mit Licht interagiert. Licht besteht aus Photonen, Paketen elektromagnetischer Energie. Ein Photon, das auf eine biologische Probe einwirkt, kann mit den Molekülen interagieren, die die Probe umfassen, auf eine von vier Arten: 1) das Photon interagiert nicht und durchläuft die Probe; 2) das Photon reflektiert/gestreut wird; 3) das Photon wird von einem Molekül absorbiert und die absorbierte Energie wird als Wärme durch Prozesse freigesetzt, die kollektiv als nicht-radioativer Zerfall bekannt sind; und 4) das Photon wird absorbiert und die Energie wird dann schnell als sekundäres Photon durch den als Fluoreszenz bekannten Prozess übersendet. Ein Molekül, dessen Struktur die Fluoreszenzemission zulässt, wird als Fluorophor bezeichnet. Die meisten biologischen Proben enthalten vernachlässigbare endogene Fluorophore; daher müssen exogene Fluorophore verwendet werden, um Merkmale hervorzuheben, die für die Probe von Interesse sind. Während der Fluoreszenzmikroskopie wird die Probe mit Licht der entsprechenden Wellenlänge für die Absorption durch das Fluorophor beleuchtet. Bei der Aufnahme eines Photons wird ein Fluorophor als "erregt" bezeichnet und der Absorptionsprozess wird als "Erregung" bezeichnet. Wenn ein Fluorophor Energie in Form eines Photons aufgibt, wird das Verfahren als "Emission" bezeichnet, und das emittierte Photon wird Fluoreszenz genannt.
Der Lichtstrahl, der zur Erregung eines Fluorophors verwendet wird, wird durch die Objektivlinse eines Mikroskops fokussiert und konvergiert an einem "Fokalpunkt", wo er maximal fokussiert ist. Jenseits des Brennpunkts weicht das Licht wieder ab. Die ein- und austretenden Balken können als kegelndes Kegelpaar visualisiert werden, das sich am Brennpunkt berührt (siehe Abbildung 1, linkes Panel). Das Phänomen der Beugung setzt eine Grenze, wie eng ein Lichtstrahl fokussiert werden kann - der Strahl konzentriert sich tatsächlich auf einen Punkt von endlicher Größe. Zwei Faktoren bestimmen die Größe des Brennpunkts: 1) die Wellenlänge des Lichts und 2) die Lichtaufnahmefähigkeit der Objektivlinse, die sich durch ihre numerische Blende (NA)auszeichnet. Der brennpunktige "Spot" erstreckt sich nicht nur in der x-y-Ebene, sondern auch in z-Richtung und ist in Wirklichkeit ein Brennvolumen. Die Abmessungen dieses Brennvolumens definieren die maximale Auflösung, die durch optische Bildgebung erreicht wird. Obwohl die Anzahl der Photonen innerhalb des Brennvolumens am größten ist, enthalten die konischen Lichtpfade oberhalb und unterhalb des Fokus auch eine geringere Dichte von Photonen. Jedes Fluorophor im Lichtpfad kann so angeregt werden. In der konventionellen (Weitfeld-)Epifluoreszenzmikroskopie tragen die Emissionen von Fluorophoren oberhalb und unterhalb der Brennebene zur außerfokussierenden Fluoreszenz bei (ein "hazy background"), was die Bildauflösung und den Kontrast reduziert, wie in Abbildung 1 der rote Würfel, der die Fluorophoremission über der Brennebene (roter Stern) darstellt, die zu einer nicht fokussierten Fluoreszenz führt (oben rechts). Dieses Problem wird in der konfokalen Mikroskopie durch die Verwendung eines Lochs gemildert. (Abbildung 2, unten rechts). Wie in Abbildung 3 dargestellt, ermöglicht das Loch Emissionen, die vom Brennpunkt ausgehen, den Detektor (links) zu erreichen, während die nicht fokussierte Fluoreszenz (rechts) am Erreichen des Detektors gehindert wird, wodurch sowohl die Auflösung als auch der Kontrast verbessert werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> Abbildung 1. Optische Auflösung der Epifluoreszenz versus konfokale Mikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Lichtstrahl, der zur Anregung eines Fluorophors verwendet wird, wird durch die Objektivlinse eines Mikroskops fokussiert und konvergiert bei einem Brennvolumen und weicht dann ab (links). Der rote Stern stellt die Brennebene einer Probe dar, die abgebildet wird, während das rote Quadrat die Fluorophoremission über der Brennebene darstellt. Bei der Aufnahme eines Bildes dieser Probe mit einem Epifluoreszenzmikroskop wird die Emission des roten Quadrats a-fokus sichtbar und trägt zu einem "hazy background" (oben rechts) bei. Konfokale Mikroskope haben ein Loch, das die Erkennung von Licht verhindert, das außerhalb der Brennebene emittiert wird, wodurch der "hazy background" (unten rechts) eliminiert wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> Abbildung 2. Locheffekt in der konfokalen Mikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Obwohl die höchste Intensität des Anregungslichts am Brennpunkt der Linse (links, rot oval) liegt, erhalten andere Teile der Probe, die sich nicht im Brennpunkt befindet (rechts, roter Stern), Licht und Fluoreszenz. Um zu verhindern, dass Licht aus diesen nicht fokussierten Bereichen zum Detektor gelangt, befindet sich ein Bildschirm mit einem Loch vor dem Detektor. Nur das von der Brennebene emittende Infokuslicht (links) kann durch das Loch reisen und den Detektor erreichen. Das nicht fokussierte Licht (rechts) wird mit dem Loch blockiert und erreicht den Detektor nicht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> Abbildung 3. Hauptkomponenten eines konfokalen Laserscanmikroskops. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Einfachheit halber wird sich die mechanistische Beschreibung eines konfokalen Mikroskops auf die des Nikon Eclipse Ti A1R beschränken. Obwohl es geringfügige technische Unterschiede zwischen verschiedenen konfokalen Mikroskopen geben kann, dient das A1R sowohl als gutes Modell für die Beschreibung der konfokalen Mikroskopfunktion. Der anregungslichtstrahl, der durch eine Reihe von Diodenlasern erzeugt wird, wird vom primären dichroitischen Spiegel in das Objektiv reflektiert, der das Licht auf die abgebildete Probe fokussiert. Der primäre dichroitische Spiegel reflektiert selektiv das Anregungslicht und lässt gleichzeitig Licht bei anderen Wellenlängen passieren. Das Licht trifft dann auf die Scanspiegel, die den Lichtstrahl x-y x-y über die Probe fegen und gleichzeitig ein einzelnes (x,y) Pixel beleuchten. Fluoreszenz, die von Fluorophoren am beleuchteten Pixel emittiert wird, wird von der Objektivlinse erfasst und durchläuft den primären dichroitischen Spiegel, um eine Reihe von Photomultiplierröhren (PMTs) zu erreichen. Sekundäre dichroitische Spiegel leiten das Emissionslicht auf das entsprechende PMT. Von der Probe in das Objektiv gestreutes Anregungslicht wird durch den primären dichroitischen Spiegel zurück zur Probe reflektiert und somit am Eindringen in den Nachweis gehindert. Lichtpfad und erreichen die PMTs (siehe Abbildung 3). Dadurch kann die relativ schwache Fluoreszenz ohne Kontamination durch Licht quantifiziert werden, das vom Anregungslichtstrahl gestreut wird, der typischerweise um Größenordnungen intensiver ist als die Fluoreszenz. Da das Loch Licht von außerhalb des Brennvolumens blockiert, kommt das Licht, das beim Detektor ankommt, von einer schmalen, ausgewählten Z-Ebene. Daher können Bilder aus einer Reihe benachbarter z-Ebenengesammelt werden; diese Bilderserie wird oft als "Z-Stack" bezeichnet. Mit der entsprechenden Software kann ein z-Stackverarbeitet werden, um ein 3D-Bild der Probe zu erzeugen. Ein besonderer Vorteil der konfokalen Mikroskopie ist die Fähigkeit, die subzelluläre Lokalisation der Färbung zu unterscheiden. Zum Beispiel die Unterscheidung zwischen Membranfärbung und intrazellulärer Färbung, die bei der konventionellen Epifluoreszenzmikroskopie (1, 2, 3) sehr anspruchsvoll ist.
Die Probenvorbereitung ist eine wichtige Facette der konfokalen Bildgebung. Eine Stärke der optischen Mikroskopie-Techniken ist die Flexibilität, lebende oder feste Zellen abzubilden. Beim Versuch, 3D-Bilder zu erzeugen, ist die Verwendung fester Zellen aufgrund der Anzahl der Bilder, die für einen Z-Stack erworben werden müssen, der Schwierigkeit, die Zellgesundheit zu erhalten, und der Bewegung von lebenden Zellen und ihren Organellen typisch. Das Verfahren zur Fixierung und Färbung von Zellen zur konfokalen Fluoreszenz ähnelt dem, das konventionell bei der Immunfluoreszenz verwendet wird. Nach der Kultur in Kammerrutschen oder auf Abdeckungen werden Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, um die zelluläre Morphologie zu erhalten. Die unspezifische Antikörperbindung wird mit Rinderserumalbumin, Milch oder normalem Serum blockiert. Um die Spezifität der sekundären Antikörper aufrechtzuerhalten, sollte die verwendete Lösung nicht von derselben Art stammen, bei der die primären Antikörper erzeugt wurden. Die Zellen werden mit primären Antikörpern inkubiert, die das Antigen von Interesse binden. Bei der Kennzeichnung mehrerer zellulärer Ziele müssen die primären Antikörper jeweils von einer anderen Spezies abgeleitet werden. Antikörper, die ein Antigen kennzeichnen, werden dann durch fluorophorkonjugierte sekundäre Antikörper gebunden. Fluorophorkonjugierte Sekundärantikörper sollten so ausgewählt werden, dass sie mit den Wellenlängen der Lasererregung im konfokalen Mikroskop kompatibel sind. Bei der Visualisierung mehrerer Antigene sollten sich die Anregungs-/Emissionsspektren der Fluorophore so weit unterscheiden, dass ihre Signale durch mikroskopische Analysen diskriminiert werden können. Die gebeizte Probe wird dann zur Bildgebung auf einem Dia montiert. Ein Montagemedium wird verwendet, um Photobleichungen und Probenaustrocknung zu verhindern. Auf Wunsch kann ein Montagemedium verwendet werden, das einen nuklearen Gegenfleck enthält (z.B. DAPI oder Hoechst) (4).
Im folgenden Protokoll wurden Maus-Fibroblasten, die auf CD1d (LCD1) transfiziert wurden, mit Antikörpern gefärbt, die CD1d und CD107a (LAMP-1) erkennen. CD1d ist ein wichtiger Histokompatibilitätskomplex 1 (MHC 1)-ähnlicher Rezeptor, der auf der Oberfläche von Antigen-Präsentierenden Zellen vorhanden ist, die Lipidantigene darstellen. LAMP-1 (lysosomal assoziiertes Membranprotein-1) ist ein Transmembranprotein, das hauptsächlich in lysosomalen Membranen vorkommt. Für die richtige Antigen-Präsentation wird CD1d durch das niedrige pH-Lysosomalfach geschmuggelt, so dass LAMP-1 als Marker des lysosomalen Fachs für dieses Protokoll verwendet wird. Durch die Untersuchung der LCD1-Zellen mit Anti-CD1d und Anti-LAMP-1, die in verschiedenen Arten hergestellt wurden, können sekundäre Antikörper mit einzigartigen Fluorophoren verwendet werden, um die Lokalisation jedes Proteins in der Zelle zu bestimmen und ob CD1d in der LAMP-1-positiven lysosomalen Fächern.

In diesem Experiment wurden Maus-Fibroblasten, die das Oberflächenglykoprotein-Gen CD1d exzessierten, fixiert, immungefärbt und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Abbildung 4 zeigt ein repräsentatives Bild, das mit dem obigen Protokoll erstellt wurde. Im oberen Bereich von A werden einkanalige Bilder dargestellt, die das Färbemuster jedes einzelnen Ziels zeigen. Diese Bilder bestehen aus einem einzelnen Abschnitt (Slice) des z-Stacks, der erfasst wurde. Das rechte Panel zeigt die ...

Konfokale Fluoreszenzmikroskopie: Eine Technik zur Bestimmung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Fibroblasten

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist ein spezialisiertes bildgebendes Verfahren zur Lokalisierung eines Proteins oder Antigens von Interesse in einer Zell- oder Gewebeprobe, indem das Antigen mit einem Antikörper-konjugierten Fluoreszenzfarbstoff markiert und das Fluoreszenzsignal nachgewiesen wird. Sie bietet eine höhere räumliche Auflösung als die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, mit Hilfe von zwei Lochblenden, die in den Brennebenen der Objektivlinse platziert sind, was ihr den Namen konfokal gibt. Es ermöglicht dem Anwender, die Färbung auf subzellulärer Ebene zu visualisieren, wie z.B. die Unterscheidung zwischen Oberflächenmembranfärbung und intrazellulärer Färbung. Ein konfokales Mikroskop folgt einem ähnlichen Grundprinzip wie ein klassisches Fluoreszenzmikroskop. Der Strahl einer Lichtquelle, in der Regel ein konfokaler Laser, wird von einem dichroitischen Spiegel reflektiert und durch eine Objektivlinse auf die Probe fokussiert. Dieses Licht regt die Fluorophore an, eine andere Wellenlänge zu emittieren, die durch die Objektivlinse und den dichroitischen Spiegel zurück zu einer Kamera oder einem Okular wandert. Die erhöhte Auflösung eines konfokalen Mikroskops ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von zwei Lochblenden zurückzuführen, bei denen es sich um sehr kleine Löcher handelt, durch die Licht auf dem Anregungs- und Emissionslichtweg dringt. Die Lochblenden sind strategisch in der Brennebene der Objektivlinse platziert. Wechseln wir nun zu einem Schema der Mikroskopanordnung in der Seitenansicht, um den Strahlengang zu überprüfen. Nach dem Durchgang durch die Anregungslochblende hat der Anregungslichtstrahl den Effekt, dass er von einem Brennpunkt ausgeht, was es der Objektivlinse ermöglicht, das Licht dann ebenfalls auf einen Punkt auf der Probe zu fokussieren. Der Emissionsstrahl von diesem Brennpunkt konvergiert an der Emissionslochblende, wodurch er durchgelassen werden kann. Während der Anregung werden nun auch Fluorophore innerhalb des Strahlengangs, oberhalb und unterhalb des Brennpunkts, leicht angeregt. Während das vom Brennpunkt ausgehende Emissionslicht durch die Lochblende fällt, konvergieren die Emissionen der unscharfen Punkte vor oder nach der Lochblende und werden daher blockiert, was zu einer verringerten Hintergrundfluoreszenz führt. Der Anregungs-Emissions-Detektionszyklus muss für jeden Bildpunkt in der interessierenden Region wiederholt werden, was auf verschiedene Arten erfolgen kann. Beim konfokalen Laserscanning werden beispielsweise Galvanometer-Scanning-Spiegel verwendet, die das Anregungslicht in verschiedenen Winkeln ablenken. Daher wird der Lichtstrahl über die Probe in der XY-Ebene geschwenkt. Bei der konfokalen Spinning-Scheibe wird eine Scheibe mit einer Anordnung von Lochblenden verwendet, die sich dreht, um die Anordnung der Lochblenden zu verschieben. Auf diese Weise können jedes Mal mehrere kleine Bildpunkte in der Probe beleuchtet werden, die beim Drehen der Scheibe allmählich den gesamten Bereich abdecken. Infolge der Lochblenden stellt das XY-Bild am Detektor eine schmale Z-Ebene dar. Daher können Bilder aus einer Reihe aufeinanderfolgender Z-Ebenen gesammelt werden, die häufig als Z-Stapel bezeichnet werden. Aus diesen Bildern kann eine entsprechende Software eine 3D-Darstellung des Fluoreszenzsignalmusters in der Probe erzeugen. In diesem Protokoll beobachten Sie die Immunfärbung von Mausfibroblasten, gefolgt von der Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop, um ein Zelloberflächenprotein und ein lysosomales Protein unterschiedlich sichtbar zu machen. Zu Beginn resuspendieren Sie die interessierenden Zellen mit sterilen Techniken in 500 Mikrolitern Wachstumsmedium pro Vertiefung und säen sie dann in die Vertiefungen eines Objektträgers mit vier Vertiefungen. Hier verwenden wir Maus-Fibroblasten, die transfiziert wurden, um das Antigen-präsentierende Molekül CD1d zu exprimieren. Damit die Zellen am Glas haften können, legen Sie den Objektträger in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie ihn über Nacht. Saugen Sie morgens das Medium aus jeder Vertiefung an und waschen Sie die Zellen dann einmal einige Sekunden lang mit 500 Mikrolitern PBS. Um die Zellen zu fixieren, geben Sie 500 Mikroliter 1%ige Paraformaldehydlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie nach der Inkubation das Paraformaldehyd in einem geeigneten Behälter für gefährliche flüssige Abfälle und entfernen Sie dann alle Reste des Fixiermittels, indem Sie die Zellen einige Sekunden lang dreimal mit PBS waschen. Um das Eindringen von Antikörpern in die Zellen zu ermöglichen, geben Sie 500 Mikroliter Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank. Waschen Sie die Zellen nach der Permeabilisierung dreimal kurz mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Blockierungspuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Bereiten Sie die primären Antikörper, Anti-CD1d und Anti-LAMP-1, in geeigneten Arbeitskonzentrationen vor. Aspirieren Sie dann den Puffer aus den Vertiefungen und bedecken Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 500 Mikrolitern verdünnter Primärantikörperlösung und inkubieren Sie den Objektträger dann über Nacht auf einer ebenen Fläche bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen werden die Sekundärantikörper, in diesem Fall ein Anti-Maus- und ein Anti-Ratten-Antikörper mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Tags, in einem Blockpuffer auf geeignete Arbeitskonzentrationen verdünnt. Als nächstes aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung aus den Vertiefungen und waschen die Zellen dann viermal mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie dann 500 Mikroliter der verdünnten Sekundärantikörperlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen Sie die Vertiefungen viermal mit 500 Mikrolitern PBS, um alle ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen. Um die Proben nach der letzten Wäsche zu montieren, lösen Sie die Kammern vorsichtig vom Objektträger und entfernen Sie sie. Um das restliche PBS zu entfernen, halten Sie den Objektträger schräg über ein empfindliches Tuch und entfernen Sie die Flüssigkeit von den Rändern, ohne die Zellen zu berühren. Sobald das überschüssige PBS entfernt ist, geben Sie einen Tropfen Antifading-Eindeckmedium, das den Kernfleck DAPI enthält, auf jeden Zellabschnitt. Nehmen Sie als Nächstes ein 20 x 60 Millimeter großes Deckglas und senken Sie das Deckglas mit nur den Fingerspitzen langsam an beiden Kanten ab, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Blasen über den Zellen bilden. Wischen Sie überschüssiges Montagemedium auf den Objektträgern mit einem zarten Arbeitstuch ab und lagern Sie die Objektträger bis zu einer Woche lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Um mit dem Imaging der Zellen zu beginnen, klicken Sie zunächst auf das NIS-Software-Symbol auf dem Desktop. Sobald Sie sich im Steuerungsfenster befinden, klicken Sie oben auf die Registerkarte TiPad und wählen Sie das gewünschte Objektiv für die Bildgebung aus. Legen Sie dann den Objektträger mit den Zellen auf den Tisch und zentrieren Sie ihn unter der Linse. Richten Sie anschließend auf der Registerkarte A1plus Compact GUI neben der Registerkarte TiPad die Laser ein, die für die verwendeten Fluorophore geeignet sind. Klicken Sie auf das Zahnradsymbol, um das Menü mit den Farb- und Spektraleinstellungen zu öffnen. Sobald das Menü für die Farb- und Spektraleinstellungen geöffnet ist, wählen Sie die gewünschten Kanäle aus und stellen Sie den Laser für jeden Kanal ein. Wählen Sie dann die entsprechenden Emissionen im Dropdown-Menü unter dem ersten dichroitischen Spiegel aus. Klicken Sie anschließend im A1plus Compact GUI-Fenster auf Ch.Series, um die Linienkanalserie einzurichten, die festlegt, ob die verwendeten Laser gleichzeitig oder nacheinander auf die Probe feuern. Starten Sie danach den Scanvorgang, indem Sie auf das Pfeiltipp-Symbol oben klicken. Klicken Sie zu diesem Zeitpunkt, während das Bild live ist, im A1plus Compact GUI-Fenster auf die Schiebeskala und ändern Sie die Lochblendengröße, um sicherzustellen, dass unscharfes Licht begrenzt wird. Stellen Sie als Nächstes die Hochspannungs- und Offset-Einstellungen unter jedem Laser auf ein geeignetes Niveau ein, indem Sie die Schiebeskalen verwenden, um die Erkennung der spezifischen Färbung zu ermöglichen und gleichzeitig mögliche Hintergrundflecken zu begrenzen. Wenn eine positive Färbeprobe verfügbar ist, beginnen Sie mit der Abbildung dieser Probe für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass die Lasereinstellungen ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis ergeben. Nachdem Sie die optimalen HV- und Offset-Werte für jeden Laser eingestellt haben, klicken Sie auf die Registerkarte ND-Erfassung und wählen Sie dann das Z-Symbol aus, um die Parameter für die z-Serie einzurichten. Wenn Sie als Nächstes ein Live-Bild des Beispiels aufnehmen, legen Sie zunächst den unteren Rand des Bildes fest, indem Sie den unteren Rand des Bildes suchen und auf die untere Schaltfläche klicken. Suchen Sie dann die obere Position des Beispiels und klicken Sie auf die obere Schaltfläche. Legen Sie die Schrittweite fest, indem Sie entweder die bevorzugte Schrittgröße in Mikrometern für jeden Schritt eingeben oder indem Sie angeben, wie viele Schritte insgesamt erforderlich sind. Um die gewünschte Größe/Pixelauflösung des Bildes auszuwählen, klicken Sie auf das Aiplus Compact GUI-Fenster und wählen Sie unter dem Größensymbol die gewünschte Auflösung aus. Um das Rauschen des Bildes zu verringern, können Sie das Dropdown-Menü neben dem Theta-Symbol auswählen, um die ausgewählte Anzahl von Bildern zu mitteln. Klicken Sie anschließend im Menü ND-Erfassung auf die Registerkarte Jetzt ausführen, um mit der Bildgebung der Probe zu beginnen. Nachdem das Imaging abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild, indem Sie auf Datei und dann auf Speichern unter klicken, wodurch die Bilddatei mit der Erweiterung dot-nd2 exportiert wird. Wiederholen Sie abschließend den Vorgang für jede der anderen Proben. In diesem Experiment wurden Mausfibroblasten, die das Oberflächenglykoprotein-Gen CD1d exprimieren, fixiert, immungefärbt und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Dieses Bild zeigt einen einzelnen Ausschnitt eines Z-Stapels bei 40-facher Vergrößerung, in dem CD1d rot gefärbt ist. Die Probe wurde mit LAMP-1, einem lysosomalen Marker, in grün gefärbt. Die Kernfärbung DAPI wurde verwendet, um die Zellkerne zu zeigen. In einem zusammengesetzten Bild, in dem die drei verschiedenen Kanäle verschmolzen sind, resultiert das Erscheinungsbild von Gelb aus der Überlappung der roten und grünen Kanäle und zeigt einen Bereich an, in dem CD1d und LAMP-1 in den Lysosomen kolokalisiert sind. Bereiche, in denen nur eine Farbe vorhanden ist, weisen auf das Vorhandensein von CD1d oder LAMP-1 ohne Co-Lokalisierung hin. Dieses Bild zeigt ein 3D-Rendering der Zellen, die aus Bildern erstellt wurden, die im Z-Stapel aufgenommen wurden, und diese Methode ermöglichte die Erstellung einer Seitenansicht dieser Zellgruppe. Das folgende Bild zeigt einen Ausschnitt aus dem Z-Stapel bei 100-facher Vergrößerung, der die Expressionsmuster dieser beiden Proteine im Detail zeigt. Das rosa umrandete Feld auf der rechten Seite des Bildes zeigt den Querschnitt der X-Koordinate an, die durch die rosa Linie im Bild gekennzeichnet ist, die die Seitenansicht an der rosa Linie darstellt. In ähnlicher Weise zeigt das blau umrandete Feld am unteren Rand des Bildes den Querschnitt der Y-Koordinate, die durch die blaue Linie im Bild gekennzeichnet ist und die Vorderansicht an der blauen Linie darstellt. Das 3D-Rendering des Z-Stapel-Bildes ermöglicht es Benutzern, das Bild in 3D anzuzeigen und alle X-, Y- und Z-Ebenen zu visualisieren. Dies kann verwendet werden, um die Co-Lokalisation der verschiedenen Färbungen in verschiedenen Regionen innerhalb der Zelle zu untersuchen.

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Education

Lehre

JoVE Science Education

Advanced Biology

Fortgeschrittene Biologie

Immunology

Immunologie

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

confocal-microscopy-for-protein-localization

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Diese Sammlung umfasst viele Grundtechniken von Immunologielaboren, einschließlich der Kennzeichnung und Sortierung von Immunzellen. Es werden auch Vermehrungsmethoden für Immunzellen und Antikörper, sowie allgemeine Tests für Immunaktivität einschließlich ELISA gezeigt. Zudem werden Färbungen und Bildgebung für Immungewebe und Zellproben vorgestellt.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

Description

Transcript

Tags