Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

Prozessübersicht
Der typische 51Cr-Release-Assay zur Messung des Zelltodes umfasst folgende Schritte:
<ol><li>Zunächst werden die Zielzellen mit Na2[51Cr]O4beschriftet. Dies unterscheidet sie von den Effektorzellen im Assay.</li>
	<li>Während die Zielzellen etikettiert werden, werden die Effektorzellen gesammelt und mit der seriellen Verdünnungstechnik wird eine abnehmende Titration der Effektorzellen in einer runden unteren 96-Well-Assay-Platte erzeugt.</li>
	<li>Am Ende der Zielzellkennzeichnung werden die Zellen zuerst gewaschen und dann eine feste Anzahl von Zellen der Assayplatte hinzugefügt, die bereits eine Reihe von Verdünnungen von Effektorzellen enthält.</li>
	<li>Als Nächstes wird der Zellmix des Zieleffektors für einen definierten Zeitraum inkubiert, um eine ausreichende Zellinteraktion mit den Zielzellen zu ermöglichen, um die Zelllyse zu mediat.</li>
	<li>Schließlich werden die Kulturüberstande geerntet und in Röhren gesammelt. Der 51-Cr-Betrag wird mit einem Gammazähler quantifiziert.</li>
	<li>Am Ende werden die Daten gesammelt und verwendet, um die "prozentuale spezifische Zelllyse" der Zielzellen zu berechnen.</li>
</ol>1. Kennzeichnung von Zielzellen mit 51Cr
<ol><li>Zunächst bereiten Sie die Zielzellen (hier- menschliche Melanom-Zelllinie WM793) zu einer einzelzelligen Suspension vor.</li>
	<li>Entfernen Sie dazu zunächst die Medien aus dem Gewebekulturkolben.</li>
	<li>Dann waschen Sie die Zellen mit 5 ml 1X PBS.</li>
	<li>Versuchen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml Trypsin für 2 min auf die Platte legen.</li>
	<li>Tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen.</li>
	<li>Fügen Sie dem Kolben 5 ml RPMI-Medien hinzu und pipen sie das Medium nach oben und unten, um die Zellen zu lösen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und zentrieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 1200 U/min. Dekant den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml Medien in das Pellet und sanft Pipetten sie die Medien nach oben und unten, um die Zellen in Suspension zu bringen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Übertragen Sie 1x106 Zellen in ein neues 15 ml konisches Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 1200 U/min und dekanieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Kurz wirbeln Sie das Rohr, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückgelassenen Mediums wieder aufzuhängen.</li>
	<li>Fügen Sie der WM793-Zielzellsuspension 100 CIs von 51Cr direkt hinzu. Hinweis: Für die jeweilige Radioaktivität sollte ein spezieller Laborraum eingerichtet werden. Darüber hinaus sollte es eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des 51Cr während aller Schritte sowie eine ordnungsgemäße Beschilderung geben, um anzugeben, wo Proben mit 51Cr aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pfannkuchensonde ausgestattet ist, ist ebenfalls notwendig, um den Raum für eine mögliche Kontamination zu vermessen.
</li>
	<li>Fügen Sie ein kleines Stück radioaktives Klebeband in die Röhre, um anzuzeigen, dass die Röhre jetzt radioaktiv ist.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr in einen 37°C Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie 1 h. Streichen Sie das Rohr alle 15-20 Minuten, um die Aufnahme der Zielzelle des Chroms zu erhöhen.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubationszeit die Zielzellen mit 5 ml FBS, um überschüssige 51Cr zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 U/min für 5 min. Decant radioaktive FBS waschen in entsprechenden Abfallbehälter.</li>
	<li>Das Pellet wieder aufhängen und ein zweites Mal mit FBS waschen. Überprüfen Sie das Pellet auf eingebaute Radioaktivität mit einem Geigerzähler.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet in 10 ml komplettem Medium wieder auf und erreichen Sie eine Zellkonzentration von 105 Zellen/ml. Hinweis: Der Zellzählschritt nach der 51Cr-Kennzeichnung wird hier weitgehend aus Sicherheitsgründen weggelassen. Es kann davon ausgegangen werden, dass die WM793-Zellkonzentration mit der vor der 51Cr-Kennzeichnung identisch war.
</li>
</ol>2. Vorbereiten von Effektorzellen
<ol><li>Es können verschiedene Effektorzellen verwendet werden, z. B. menschliche oder Maus-T-Zellen und NK-Zellen. In diesem Beispiel wurden PBMCs verwendet, die durch Standarddichtegradientenzentrifugation (bis zu einer Konzentration von 5x106) aus Vollblut isoliert wurden.</li>
	<li>Zunächst fügen Sie jedem Brunnen einer der Reihen (hier Reihe A, siehe Tabelle 1) einer 96-well-Rundbodenplatte 100 L Gewebekulturmedium hinzu. Hier werden keine Effektorzellen hinzugefügt, und sie dienen als "Leer" zur Bestimmung der "minimalen/spontanen 51Cr-Freisetzung" aus den Zielzellen.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> Tabelle 1: 51Cr Release Assay Layout: Reihe A- Zielzellen (104 Zellen / 100 l) nur mit Medien inkubiert (erzeugt 'leer' zur Bestimmung der "minimum/spontan 51Cr Release"). Zeilen B bis C- Brunnen mit unterschiedlichen Effektor: Zielzellen (E:T)-Verhältnisse, die von 50:1 bis 1,5:1 reichen. Zeile H- Zielzellen (104 Zellen/100 l) inkubiert mit 1% NP-40 (NP-40 lyses die Zielzellen, erzeugung "maximale oder insgesamt 51Cr Freisetzung"). Jedes E:T-Verhältnis wird in dreifacher Auslage für jeden Versuchszustand getestet. Spalte 1-3- unstimulierte PBMCs und Spalte 4-6- CpG-stimulierte PBMCs.
<ol start="3"><li>Als nächstes erzeugen Sie eine 2-fache serielle Zellverdünnung der PBMCs (in Dreifacharbeit für jede Versuchsbedingung), um eine Effektorzellkonzentration von 5x105 bis 15.625 Zellen/100 l Medien zu erhalten (hier Zeilen B bis G). Hinweis: In diesem Beispiel ist das Anfangseffektor: Zielzelle (E: T) Verhältnis ist 50:1. Dieses Verhältnis kann jedoch je nach experimentellen Besonderheiten angepasst werden.
</li>
	<li>Lassen Sie die letzte Zeile leer (hier Zeile H), indem Sie diesen Brunnen keine Effektorzellen hinzufügen. (Diese Zeile wird verwendet, um die "Gesamtanzahl/min oder (ca. p. m)" oder die "maximale 51Cr-Version") zu generieren.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den 37°C-Inkubator, bis die Zielzellen bereit sind, hinzugefügt zu werden.</li>
</ol>3. Hinzufügen von 51Cr beschrifteten WM793-Zielzellen zum Assay
<ol><li>Nach der Inkubationszeit die Zielzellen aus dem Inkubator entfernen und mit 5 ml FBS waschen, um überschüssige 51Cr zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 U/min für 5 min, mit einer bestimmten Zentrifuge.</li>
	<li>Entfernen Sie die FBS-Waschanlage (radioaktiver Überstand) in einen geeigneten Abfallbehälter.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in einem frischen 5 ml FBS wieder aufhängen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 1200 U/min für 5 min.</li>
	<li>Schließlich das Pellet in 10 ml des kompletten Mediums wieder aussetzen.</li>
	<li>Gießen Sie die 51Cr-markierte WM793-Zellsuspension (105 Zellen/ml) in ein Einweg-Reagenzreservoir.</li>
	<li>Fügen Sie dann 100 l dieser beschrifteten Zielzellen zu jedem Brunnen der 96-Well-Effektor-Zellplatte hinzu, wobei eine Mehrkanalpipette verwendet wird.</li>
	<li>Als Nächstes fügen Sie 100 L von 1% NP-40 (in Wasser) in die Reihe der Brunnen, die frei von Effektorzellen sind (hier Zeile H). 1% NP-40 wird die Zielzellen lysieren, und somit dienen diese Brunnen als Kontrollen, um die "Gesamtanzahl/min, oder (c. p. m)" oder die maximale 51Cr-Freisetzung zu bestimmen.</li>
	<li>Befestigen Sie deckel auf Platte, indem Sie ein kleines Stück gasdurchlässiges Klebeband auf jeder Seite der Platte hinzufügen und legen Sie ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel, um anzuzeigen, dass es 51Cr enthält.</li>
	<li>Kurz gesagt, zentrieren Sie die Platte bei 1200 U/min. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu. Hinweis: Es ist wichtig, eine Zentrifuge zu verwenden, die für den Umgang mit radioaktiven Proben markiert ist.
</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in einen 37°C Inkubator mit einem kleinen Stück Bleiabschirmung über die Platte für zusätzliche Sicherheit. Inkubieren Sie für 16 h, um eine Zielzelllyse zu ermöglichen. Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach verwendeten Effektorzellen und möglichem Tötungsmechanismus zwischen 4 und 18 h variieren.
</li>
</ol>4. Ernte der Übertreibungen
<ol><li>Am Ende der Inkubationszeit entfernen Sie vorsichtig das Band um den Rand der Platte und entfernen Sie den Deckel.</li>
	<li>Als nächstes legen Sie den Ernterahmen auf die Platte, um sicherzustellen, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Baumwollstecker vorhanden sind. Dadurch wird die Sammlung eines zellfreien Überstandes sichergestellt.</li>
	<li>Nun drücken Sie langsam und sanft die Baumwollstopfen in die Brunnen.</li>
	<li>Nach ca. 10 Sekunden den Druck auf die Baumwollstecker loslassen und dann die Baumwollstecker auf Rohrstreifen übertragen.</li>
	<li>Legen Sie jedes dieser Rohre in ein sekundäres FACS-Rohr.</li>
	<li>Schließlich laden Sie FACS-Röhren auf den Gammazähler und führen Sie die Proben aus, um die Menge von 51Cr zu quantifizieren, die in jedem Zustand freigesetzt wird. Die Proben werden in der Regel 1 Minute lang gemessen, was eine einfache Bestimmung der "Zählungen/Minute" ermöglicht.</li>
	<li>Zeichnen Sie sorgfältig die Reihenfolge auf, in der die Rohre in den Zähler geladen wurden.</li>
</ol>5. Datenanalyse
<ol><li>Hier wurden den ersten drei Spalten unstimulierte PBMCs hinzugefügt und cpG-stimulierte PBMCs (CpG ODN, (1 g/ml) für 24 h) zu den Spalten 4-6 hinzugefügt. Siehe Tabelle 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>pro</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>1832</td>
			<td>1986</td>
			<td>1971</td>
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>c</td>
			<td>1677</td>
			<td>1739</td>
			<td>1428</td>
			<td>5454</td>
			<td>5055</td>
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>1638</td>
			<td>1552</td>
			<td>1734</td>
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>1658</td>
			<td>1580</td>
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>f</td>
			<td>1579</td>
			<td>1472</td>
			<td>1483</td>
			<td>2028</td>
			<td>1779</td>
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>g</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td>
			<td>1184</td>
			<td>1801</td>
			<td>1654</td>
			<td>1565</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>h</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ⅰ</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt von A1,A2,A3 -&gt;</td>
			<td>1164.67</td>
			<td>Spontanc.p.m</td>
			<td></td>
			<td>1058.33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>J</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt von B1,B2,B3 -&gt;</td>
			<td>1929.67</td>
			<td>9.91%</td>
			<td></td>
			<td>7907.33</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>50:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>kb</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt von C1,C2,C3 -&gt;</td>
			<td>1614.67</td>
			<td>5.83%</td>
			<td></td>
			<td>5259</td>
			<td>53.67%</td>
			<td>25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>l</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt d1,D2,D3 -&gt;</td>
			<td>1641.33</td>
			<td>6.17%</td>
			<td></td>
			<td>3869</td>
			<td>35.91%</td>
			<td>12.5:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>m</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt von E1,E2,E3 -&gt;</td>
			<td>1525.67</td>
			<td>4.68%</td>
			<td></td>
			<td>2730.33</td>
			<td>21.36%</td>
			<td>6.25:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt von F1,F2,F3 -&gt;</td>
			<td>1511.33</td>
			<td>4.49%</td>
			<td></td>
			<td>1858.67</td>
			<td>10.22%</td>
			<td>3.12:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>O</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt von G1,G2,G3 -&gt;</td>
			<td>1278.33</td>
			<td>1.47%</td>
			<td></td>
			<td>1673.33</td>
			<td>7.86%</td>
			<td>1.56:1</td>
		</tr>
<tr>
<td>seiten</td>
			<td colspan="2">Durchschnitt h1,H2,H3 -&gt;</td>
			<td>8884.67</td>
			<td>Maximal c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>8885.67</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Unstim PBMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CpG-Stim PBMC</td>
			<td>E:T-Verhältnis</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: 51Cr-Release-Assay-Daten: Datenwerte "Anzahl pro Minute" / "c. p. m", durchschnitts c. p. m-Werte und berechnete prozentspezifische Lysewerte.
<ol start="2"><li>Die gesammelten Daten (Anzahl pro Minute, d.h. c.p.m) wurden in die Zellen einer Kalkulationstabelle in der gleichen Weise eingegeben, wie die Proben in der Originalplatte angeordnet waren.</li>
	<li>Zunächst wurden die Durchschnittswerte der Triplicate berechnet. Tabelle 2 - Zellen I3 bis P3, für nicht stimulierte PBMCs und Zellen I6 bis P6, für CpG-stimulierte PBMCs.</li>
	<li>Nach der Ermitteltur der Durchschnittswerte wurde der prozentuale Anteil der spezifischen Lyse für jede Bedingung anhand der folgenden Formeln <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg">
</li>
	<li>Der Prozentuale Anteil der spezifischen Lyse wurde für jede Bedingung berechnet (Tabelle 2 - Zellen J4 bis O4, für nicht stimulierte PBMCs und J7 bis O7, für nicht stimulierte PBMCs).</li>
</ol>

Der hier beschriebene Assay hat eine erhebliche Flexibilität, da je nach gestellter Frage eine Vielzahl von Effektor- und Zielzellen eingesetzt werden kann. Beispielsweise kann die Spezifität der Effektorzellen durch die Verwendung verschiedener Zielzellen oder den Mechanismus der Effektorzelltötung durch die Verwendung von Zellen mit einem Mangel an bestimmten Proteinen oder die Verwendung von proteinspezifischen Inhibitoren bestimmt werden. Ein großes Problem mit dem 51Cr Release Assay ist das Potenzial für ...

assay für zelltod: chrom release assay der zytotoxischen fähigkeit

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

Quelle: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, und Thomas S. Griffith1,2,3,4 1 Mikrobiologie, Immunologie und Krebsbiologie Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 2 Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 3 Institut für Urologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 4 Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Eine der Hauptfunktionen der Zellen des Immunsystems ist es, Zielzellen zu entfernen, die mit Viren infiziert wurden oder sich in eine Tumorzelle verwandelt haben. In-vitro-Assays zur Messung der zytotoxischen Kapazität von Immunzellen sind seit vielen Jahren ein Grundnahrungsmittel in Laboratorien. Diese Assays wurden verwendet, um die Fähigkeit von T-Zellen, NK-Zellen oder anderen Immunzellen zu bestimmen, Zielzellen in einer antigen-spezifischen oder -unspezifischen Weise abzutöten. Todesliganden (z. B. FasLigand oder TRAIL), Zytokine (z. B. IFNg oder TNF) oder zytotoxische Granulate (z. B. Perforin/Granzym B), ausgedrückt durch Effektorzellen, sind einige Möglichkeiten, wie der Tod von Zielzellen induziert werden kann. Mit der Explosion in der Tumorimmuntherapie Forschung in den letzten Jahren, gibt es wachsendes Interesse an der Suche nach Wirkstoffen, um die zytotoxische Aktivität von Immunzellen zu erhöhen, um die Patientenergebnisse zu verbessern. Umgekehrt sind einige Krankheiten durch die überausuberliche Aktivität der zytotoxischen Aktivität der Immunzelle gekennzeichnet, was zu Bemühungen führt, Wirkstoffe zu identifizieren, um diese Reaktionen zu mildern. So kann ein Assay, bei dem der Anwender eine beliebige Anzahl verschiedener Effektorzellen, Zielzellen und/oder Ansprechmodifikatoren problemlos in das experimentelle Design integrieren kann, als wertvolles Mittel zur schnellen Beurteilung der zytotoxischen Kapazität von Effektorzellen und/oder oder die Reaktionsfähigkeit der Zielzelle.
Diese In-vitro-Assays beinhalten die Vermischung verschiedener Zellpopulationen sowie die Verwendung einer relativ geringen Anzahl von Effektor- und Zielzellen. Eine Notwendigkeit des Assays besteht daher darin, die Zielzellen so zu kennzeichnen, dass sie leicht erkannt und quantitiert werden können, so dass der Benutzer dann die "prozentspezifische Lyse" bestimmen kann, die von den Effektorzellen vermittelt wird. Radioaktivität - insbesondere Chrom 51 (51Cr) in Form von Na251CrO4- ist eine kostengünstige Möglichkeit, zelluläre Proteine innerhalb der Zielzellen schnell und nicht spezifisch zu kennzeichnen (1). Die kurze Etikettierung und die Gesamt-Assay-Zeiten reduzieren das Potenzial für signifikante Veränderungen in der Anzahl und/oder dem Phänotyp der Zielzellen, die das Ergebnis des Tests beeinflussen könnten. Nach dem Verlust der Membranintegrität der Zielzellen infolge der zytotoxischen Aktivität der Effektorzellen werden die 51Cr-markierten Zellproteine innerhalb der Zielzellen in den Kulturüberstand freigesetzt und Quantifizierung. Wie bei jedem Test, der die Funktion von Immunzellen in vitrountersucht, gibt es eine Reihe wichtiger Überlegungen, die Die Leistung des Experiments zu verbessern. Eines der wichtigsten Merkmale ist die Verwendung gesunder Effektor (für maximale zytotoxische Aktivität) und Ziel (für maximale Reaktionsfähigkeit und minimale spontane Tod /51Cr Freisetzung) Zellen. Effektor- und Zielzellkontakt ist erforderlich (was zur allgemeinen Verwendung von rund-bodenden 96-Well-Platten zur Förderung des Zell-Zell-Kontakts führt) (2). Schließlich hängt die Datenanalyse von der Einbeziehung positiver und negativer Zielzellpopulationen ab.
Das folgende Protokoll wird die Schritte zur Durchführung eines Standard-Freisetzungsassaysvon 51 Cr zur Messung der zytotoxischen Fähigkeit einer Population von Effektorzellen skizzieren, obwohl vor kurzem eine nicht radioaktive Version mit Europium entwickelt wurde. 51 Cr ist ein leistungsstarker Strahlenstrahler. Folglich erfordert die Verwendung dieses Tests ein angemessenes Strahlensicherheitstraining, einen speziellen Laborraum, einen Gammazähler und die Entsorgung radioaktiver Proben.
Die allgemeine Abfolge der Ereignisse in diesem Test sind: 1) 51Cr-markierte Ziele vorbereiten; 2) Effektorzellen vorbereiten und zur Platte hinzufügen, während Die Zielzellen etikettieren; 3) Beschriftete Targets zu Platte hinzufügen; 4) Inkubationsplatte; 5) Ernte Überstand; und 6) Daten analysieren, nachdem Proben auf dem Zähler ausgeführt wurden. Die Proben werden üblicherweise in dreifacher Ausführung vorbereitet und dann gemittelt, um etwaige subtile Pipettierunterschiede zu berücksichtigen.
Die richtige PSA ist für diesen Test wichtig. Insbesondere sollte der Benutzer einen Labormantel und Handschuhe tragen. Sicherheitsbrillen können auf der Grundlage des Labors oder der Institution erforderlich sein. Es sollte eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung der 51Cr in allen Schritten vorhanden sein. Schließlich sollte es spezielle Laborräume und Ausrüstung für die Verwendung von 51Cr, einschließlich aller richtigen Beschilderung, um anzugeben, wo Proben mit 51Cr gehalten werden und ein GeigerZähler mit Gamma-Sonde ausgestattet, um den Raum für mögliche verschmutzung.
In dieser Übungsübung werden wir die Fähigkeit bestimmen, die menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), (CpG stimuliert vs. unstimuliert), Melanomzellen abzutöten, indem wir die menschliche Melanomzelllinie WM793 als Modell und den Chromfreisetzungstest verwenden.

In diesem Beispiel töteten Effektorzellen, die mit CpG stimuliert wurden (Abbildung 1, schwarze Kreise),die Zielzellen effektiver ab, da das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen zunahm. Dieser Anstieg wurde in den nicht stimulierten PBMCs(weiße Kreise)nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine CpG-Stimulation für die beobachtete Erhöhung der Zielzelllyse notwendig ist.
<img alt="Figure 1" class="x...

Assay für Zelltod: Chrom Release Assay der zytotoxischen Fähigkeit

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

In diesem Video sehen Sie, wie Sie den Chrom-Release-Assay durchführen und das zytotoxische Potenzial der Effektorzellen bestimmen. Immunzellen sind dafür verantwortlich, potenziell schädliche Zellen wie Krebs oder virusinfizierte Zellen aus dem Körper zu identifizieren und zu entfernen, was ein integraler Bestandteil der Immunantwort ist. Mehrere Immunzellen, wie T-Zellen und NK-Zellen, besitzen eine Eigenschaft, die als zytotoxisches Potenzial bekannt ist, nämlich die Fähigkeit, Zielzellen zu identifizieren und Proteine zu sezernieren, die den Proteinabbau, die Lyse und den Tod dieser Zielzellen induzieren. Die Quantifizierung des zytotoxischen Potenzials ist entscheidend für die Messung der Aktivierung und Potenz von Immunzellen, und der Chromfreisetzungsassay wird zu diesem Zweck häufig verwendet. Diese Methode ermöglicht es den Anwendern, die durch bestimmte Arten von Immunzellen induzierte Zytoxizität unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, was für die Untersuchung der Krebsimmuntherapie und immunitätsbedingter Krankheiten wertvoll ist. Zu Beginn werden die Zielzellen, wie Krebszellen, mit einem radioaktiven Isotop, Chrom 51, inkubiert, das von den Zellen aufgenommen wird. Als nächstes werden diese radioaktiv markierten Zellen mit den isolierten Immunzellen von Interesse, auch Effektorzellen genannt, in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden kokultiviert, um die Interaktion zwischen den beiden Zelltypen zu erleichtern. Der Gesamtaufbau des Assays umfasst die Inkubation einer bestimmten Anzahl von Zielzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Immunzellen sowie geeignete Kontrollen. Die Co-Kultur ermöglicht es den Effektorzellen, Apoptose und Lyse in den Zielzellen zu induzieren, was zur Freisetzung des intrazellulären Chromiums 51 in den Überstand führt. Dann, zu einem voroptimierten Zeitpunkt, wird der Überstand mit dem freigesetzten Chrom aus allen Bohrlöchern geerntet. Da das Chrom 51 radioaktiv ist, zerfällt es spontan radioaktiv und emittiert Gammastrahlung. Die Gammastrahlung in den Überständen aus allen Vertiefungen in der Assay-Platte stellt eine quantifizierbare Ausgabe der Lyse der Zielzellen dar. Dies wird mit einem Gamma-Zähler gemessen, mit dem dann das zytotoxische Potenzial der Immunzellen bestimmt wird. Zu Beginn werden die Zielzellen, in diesem Beispiel die humane Melanomzelllinie WM793, in einer Einzelzellsuspension präpariert. Dazu wird zunächst das Medium aus dem Gewebekulturkolben entnommen und die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS gewaschen. Dekantieren Sie das PBS und geben Sie dann einen Milliliter Trypsin für etwa zwei Minuten auf den Teller. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen, und geben Sie dann fünf Milliliter RPMI-Medium in den Kolben. Pipettieren Sie das Medium auf und ab, um die Zellen zu sammeln, und geben Sie diese Suspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei 1200 U/min in die Zentrifuge. Entfernen Sie anschließend das Medium aus dem Rohr und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu beschädigen. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Boden des Rohrs, um das Zellpellet aufzubrechen, und geben Sie 10 Milliliter Medium in das Rohr. Pipettieren Sie das Medium dann vorsichtig auf und ab, um die Zellen in Suspension zu bringen. Bestimmen Sie anschließend die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und überführen Sie zwei Milliliter der ursprünglichen Zellsuspension in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge und pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 120 U/min. Gießen Sie nach dem Zentrifugieren das überschüssige Medium aus dem Röhrchen in einen Abfallbehälter. Wirbeln Sie das Röhrchen kurz durch, um das Zellpellet in dem kleinen Volumen des zurückbleibenden Mediums wieder zu resuspendieren. Bereiten Sie sich als Nächstes auf die Verwendung von Chromium 51 vor, indem Sie in einen Laborraum umziehen, der für diese spezielle Radioaktivität vorgesehen ist. Es sollte eine ausreichende Bleiabschirmung für die sichere Lagerung und Verwendung des Chromiums 51 bei allen Schritten sowie eine angemessene Beschilderung vorhanden sein, die darauf hinweist, wo Proben mit Chrom 51 aufbewahrt werden. Ein Geigerzähler, der mit einer Pfannkuchensonde ausgestattet ist, ist ebenfalls notwendig, um im Raum für eine mögliche Kontamination zu dienen. Sobald die Radioaktivität für die richtige Verwendung eingerichtet ist, fügen Sie 100 Mikrocurie Chrom 51 direkt zur Zielzellsuspension hinzu. Fügen Sie dann ein kleines Stück radioaktives Klebeband auf das Röhrchen hinzu, um anzuzeigen, dass die Probe und das Röhrchen jetzt radioaktiv sind. Legen Sie das Röhrchen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit einem Bleischild und inkubieren Sie es eine Stunde lang, wobei Sie das Röhrchen alle 15 bis 20 Minuten schnippen. Während die Zielzellen markieren, bereiten Sie eine Einzelzellsuspension von Effektorzellen vor. In diesem Beispiel wurden mononukleäre Zellen (PDMCs) des menschlichen peripheren Blutes durch Standard-Dichtegradientenzentrifugation aus Vollblut auf eine Konzentration von 5 mal 10 bis 6 isoliert. Übertragen Sie diese Effektorzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir und fügen Sie dann 200 Mikroliter dieser Suspension in jede Vertiefung von Reihe B in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden hinzu. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter RPMI in jede Vertiefung in den Reihen C bis G der Platte. Beginnen Sie nun mit der Durchführung von seriellen Verdünnungen der PBMCs, um eine Reihe von Effektorzellzahlen zu erhalten, indem Sie zuerst 100 Mikroliter der Zellen in den Vertiefungen in Reihe B entfernen und diese zu Reihe C hinzufügen. Verdünnen Sie dann die Effektorzellen weiter, indem Sie 100 Mikroliter Zellen von Reihe C in Reihe D übertragen. Setzen Sie die serielle Verdünnung fort. Sobald Reihe G erreicht ist, bewegen Sie 100 Mikroliter aus den Vertiefungen, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern in jeder Vertiefung in dieser Reihe zu belassen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Gewebekulturmedium in die Vertiefungen in Reihe A, um die spontane Freisetzung von Chrom 51 aus den Zielzellen zu kontrollieren, da dieser Reihe keine Effektorzellen hinzugefügt werden sollten. Legen Sie dann eine Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, bis die Zielzellen zum Hinzufügen bereit sind. Nach der Inkubationszeit nehmen Sie die Zielzellen aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit 5 Millilitern FBS, um überschüssiges Chrom 51 zu entfernen. Legen Sie dann das Röhrchen in eine dafür vorgesehene Zentrifuge und drehen Sie es 5 Minuten lang bei 1200 U/min. Entnehmen Sie die radioaktive FBS-Wäsche in einen geeigneten Abfallbehälter und wiederholen Sie den Waschschritt, indem Sie das Pellet in frischen 5 Millilitern FBS resuspendieren. Stellen Sie das Röhrchen in eine dafür vorgesehene Zentrifuge und drehen Sie die Zellen erneut bei 1200 U/min für 5 Minuten. Entfernen Sie die zweite Wäsche und überprüfen Sie das Pellet mit einem Geigerzähler auf eingeschlossene Radioaktivität. Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern vollständigem Medium und gießen Sie die mit Chrom 51 markierte Zielzellsuspension in ein Einweg-Reagenzreservoir. Geben Sie dann 100 Mikroliter dieser markierten Zielzellen in jede Vertiefung der 96-Well-Effektorzellplatte. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter 1% NP-40 in Wasser in die Vertiefungen in Reihe H, um alle Zielzellen in jeder Reihe zu lysieren. Diese Wells werden als Kontrolle verwendet, um die Gesamtanzahl pro Minute (cpm) zu bestimmen. Nun, da die Platte vorbereitet ist, sichern Sie den Deckel, indem Sie ein kleines Stück Klebeband an jeder Seite der Platte anbringen und ein Stück radioaktives Klebeband auf den Deckel legen, um anzuzeigen, dass er Chrom 51 enthält. Legen Sie dann die Platte in eine Zentrifuge, die für die Handhabung radioaktiver Proben gekennzeichnet ist. Wenn nur eine Versuchsplatte verwendet wird, fügen Sie der Zentrifuge eine Ausgleichsplatte hinzu. Stellen Sie die Zentrifuge auf 1200 U/min ein und bringen Sie die Platte auf Geschwindigkeit. Sobald Sie die Geschwindigkeit erreicht haben, stoppen Sie die Maschine. Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge. Legen Sie dann die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit einem kleinen Stück Bleiabschirmung über der Platte, um zusätzliche Sicherheit zu gewährleisten. Inkubieren Sie 16 Stunden lang, damit die Zielzellen lysieren können. Entfernen Sie am Ende der Inkubationszeit vorsichtig das Klebeband um den Rand der Platte und entfernen Sie den Deckel. Platzieren Sie als Nächstes den Ernterahmen auf der Platte und vergewissern Sie sich, dass die kleinen Filterscheiben für jeden der Wattestopfen angebracht sind. Drücken Sie nun die Wattestopfen langsam und vorsichtig in die Vertiefungen. Lassen Sie nach etwa zehn Sekunden den Druck auf die Wattestopfen ab und übertragen Sie die Wattestopfen dann auf Schlauchstreifen. Setzen Sie jedes dieser Röhrchen in ein sekundäres FACS-Röhrchen ein. Laden Sie abschließend die FACS-Röhrchen auf einen Gamma-Zähler und lassen Sie die Proben laufen, um die Menge an Chrom 51 zu quantifizieren, die unter jeder Bedingung freigesetzt wird. Notieren Sie sorgfältig die Reihenfolge, in der die Rohre in den Zähler geladen wurden. Hier wurden den ersten 3 Lanes unstimulierte PBMCs und den Lanes 4 bis 6 CPG-stimulierte PMBCs hinzugefügt. In diesem Beispiel wurden die Zählungen pro Minute auf die gleiche Weise in die Zellen einer Tabelle eingegeben, wie die Stichproben in der ursprünglichen Platte angeordnet wurden, und die Durchschnittswerte der Triplikate wurden berechnet. Für die erste Bedingung wurden z. B. die Zellen A1, A2 und A3 in Zelle I3 gemittelt. Sobald die Durchschnittswerte bestimmt sind, kann der Prozentsatz der spezifischen Lyse für jede Bedingung mit dieser Formel berechnet werden. Um beispielsweise die prozentuale spezifische Lyse für die nicht stimulierten Zellen zu berechnen, die ein Verhältnis von 50 zu 1 Effektorzellen zu Zielzellen aufwiesen, wurde die spontane CPM, die in diesem Beispiel 1164,67 beträgt, von der experimentellen CPM 1129 subtrahiert. 67. Diese Zahl kann dann durch die Differenz zwischen dem maximalen CPM und dem spontanen CPM dividiert und dann mit 100 multipliziert werden, um die prozentuale spezifische Lyse zu erhalten. Diese wird dann für jede Bedingung berechnet. Diese Daten können dann grafisch dargestellt werden, um einen Vergleich des E-zu-T-Verhältnisses mit der prozentualen spezifischen Lyse sowohl für die unstimulierten PBMCs als auch für die CPG-stimulierten PBMCs zu zeigen. In diesem Beispiel töteten Effektorzellen, die mit CPG stimuliert wurden, Zielzellen effektiver ab, da das Verhältnis von Effektorzellen zu Zielzellen zunahm. Dieser Anstieg wurde bei den nicht stimulierten PBMCs nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine CPG-Stimulation für die beobachtete Zunahme der Zielzelllyse notwendig ist.

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chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

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Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

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Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

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ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

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ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

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Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

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Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

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Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

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Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

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Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

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Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

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Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Diese Sammlung umfasst viele Grundtechniken von Immunologielaboren, einschließlich der Kennzeichnung und Sortierung von Immunzellen. Es werden auch Vermehrungsmethoden für Immunzellen und Antikörper, sowie allgemeine Tests für Immunaktivität einschließlich ELISA gezeigt. Zudem werden Färbungen und Bildgebung für Immungewebe und Zellproben vorgestellt.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

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