15.14: PCR

Überblick

Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch polymerase chain reaction, PCR) ist eine weit verbreitete Methode für das Kopieren von DNA-Abschnitten. Aufgrund der exponentiellen Amplifikation kann die PCR innerhalb weniger Stunden Millionen oder Milliarden von DNA-Kopien herstellen. In einer PCR-Reaktion amplifiziert ein hitzebeständiges DNA-Polymerase-Enzym die ursprüngliche DNA mit Hilfe einer Reihe von Temperaturänderungen in dem Thermocycler.

Die PCR ist eine vielseitige Methode, die die Molekularbiologie revolutionierte

Kary Mullis entwickelte die PCR im Jahr 1983. Dafür erhielt er im Jahr 1993 den Nobelpreis für Chemie. Als relativ schnelle, kostengünstige und präzise Methode für das Kopieren einer DNA-Sequenz wurde PCR zu einem unschätzbaren Werkzeug für zahlreiche Anwendungen. Dazu gehören beispielsweise das molekulare Klonen, die Mutagenese, der Nachweis von Krankheitserregern, die Analyse der Genexpression, die Quantifizierung und Sequenzierung von DNA sowie die Diagnose genetischer Krankheiten.

Der PCR-Reaktionszyklus

PCR ahmt den natürlichen DNA-Replikationsprozess nach, der in Zellen abläuft. Das Reaktionsgemisch enthält eine zu kopierende Original-DNA-Sequenz (Template), ein Paar kurze DNA-Moleküle (die Primer genannt werden), freie DNA-Bausteine, die Desoxynukleotidtriphosphate (die dNTPs), und ein spezialisiertes DNA-Polymerase-Enzym.

PCR umfasst eine Reihe von Schritten bei hohen Temperaturen. Daher wird ein DNA-Polymerase-Enzym gebraucht, das bei solchen Temperaturen aktiv ist. Die am häufigsten verwendete DNA-Polymerase ist die Taq-Polymerase, benannt nach Thermus aquaticus, dem Bakterium, aus dem die Polymerase isoliert wurde. Die DNA-Polymerase ist nicht dazu in der Lage, ein DNA-Molekül von Grund auf oder neu zu synthetisieren (de novo). Stattdessen fügt die DNA-Polymerase an die kurzen DNA-Moleküle, die Primer, an. Diese binden sich durch komplementäre Basenpaarung an die Original-DNA. Die Primer haben eine freie 3’-Hydroxylgruppe, an welche die DNA-Polymerase neue dNTPs binden kann. Es gibt vier Arten von dNTPs in einer PCR-Reaktion, eines für jedes Nukleotid im DNA-Molekül: dATP, dCTP, dGTP und dTTP.

Der PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten: Denaturierung, Annealing und DNA-Synthese.

1. Denaturierung. Der PCR-Zyklus beginnt mit dem Erhitzen des Reaktionsgemisches auf eine hohe Temperatur. Dabei wird die DNA-Doppelhelix in zwei Stränge aufgetrennt. Dieser “Schmelz”-Prozess findet normalerweise bei Temperaturen zwischen 90°C–100°C statt.
2. Annealing. Das Reaktionsgemisch wird schnell abgekühlt (normalerweise auf 50°C–65°C, wodurch die beiden Primer an ihre komplementären Sequenzen auf den Template-DNA-Strängen binden können.
3. DNA-Synthese (Primer-Verlängerung). Das Reaktionsgemisch wird erneut erhitzt, diesmal auf eine Temperatur (normalerweise 60°C–75°C, die es der DNA-Polymerase erlaubt, die Primer durch das Hinzufügen von dNTPs, die sich mit den Basen der Template-DNA paaren, zu verlängern.

Eine typische PCR beinhaltet 20-40 wiederholte Zyklen dieser drei Schritte, die im Thermocycler stattfinden. Da sich die Anzahl der DNA-Moleküle in jedem Zyklus verdoppelt, wird die DNA exponentiell vervielfältigt.

Grenzen der PCR-Methode

Wenn ein Wissenschaftler einen bestimmten Abschnitt des Genoms amplifizieren will, muss er zumindest einen Teil der gewünschten DNA-Sequenz kennen, um einen geeigneten Primer zu entwerfen. Ein weiteres potenzielles Problem ist die unspezifische Annealierung von Primern an teilweise ähnliche DNA-Sequenzen, welches zur Amplifikation von nicht gewünschten DNA-Sequenzen führt. Dieses Problem lässt sich durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen kontrollieren. Da die PCR eine hochempfindliche Detektionsmethode ist, ist sie auch für Kontaminationen anfällig. Selbst Spuren kontaminierender DNA können zu irreführenden Ergebnissen führen. Zusätzlich, können die in der PCR verwendeten DNA-Polymerasen fehleranfällig sein. Kommt es innerhalb der ersten PCR-Zyklen zu einer Mutation, trägt der größte Teil der amplifizierten DNA diese Mutation.

Das Ziel der PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist die Amplifikation einer genetischen Sequenz. In diesem Beispiel wird ein interessierendes Gen aus gereinigter DNA amplifiziert. Um die Amplifikation durchzuführen, ist eine Polymerase erforderlich, um die neue DNA zu synthetisieren.

Ein Primer, ein kurzes Stück einzelsträngiger DNA, das Homologie zu dem interessierenden Gen aufweist, wird ebenfalls benötigt. Schließlich werden einzelne Nukleotide, sogenannte Desoxynukleotidtriphosphate oder dNTPs, verwendet, um den neuen Strang herzustellen. Der erste Schritt bei der PCR besteht darin, die Mischung zu erhitzen, wodurch die DNA denaturiert wird.

Als nächstes wird die Reaktion abgekühlt und die Primer werden an ihren homologen Bereich angelagert. Einmal gebunden, wird die Reaktion auf eine für die Polymerase optimale Temperatur erhitzt. Die Polymerase erkennt dann den Primer-DNA-Komplex und beginnt die Synthese des neuen Strangs unter Verwendung der dNTPs in der Lösung.

Die Reaktion wird dann erhitzt und verläuft über weitere Zyklen wie beschrieben. Nach dem dritten Zyklus gibt es insgesamt acht Kopien des Gens. Nach dem vierten Zyklus 16 Exemplare, und dem fünften Zyklus, 32 Exemplare. Die Anzahl der Kopien wird weiterhin exponentiell zunehmen. Nach 30 Zyklen gibt es etwas mehr als 1 Milliarde Exemplare.