Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

Zusammenfassung

Das Genom der Influenza A-Virus besteht aus acht separaten Komplexen von RNA und Proteinen, genannt virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs). Dieses Papier beschreibt die Glycerin Gradientenreinigung und Transmissionselektronenmikroskopie Visualisierung von Influenza-A-vRNPs.

Zusammenfassung

Das Influenza-A-Virus-Genom besteht aus acht negativen Sinne, einsträngige RNA-Moleküle, die individuell mit mehreren Kopien des Influenza-A-Nukleoprotein (NP) in virale ribonulceoprotein Partikel (vRNPs) verpackt. Die Influenza vRNPs sind innerhalb der Virushülle umgeben. Während Eindringen in die Zelle, jedoch sind diese vRNP Komplexe in das Zytoplasma freigesetzt, wo sie Zugriff auf den Host Kerntransport Maschinen zu gewinnen. Um die nukleare Import von Influenza vRNPs und die Replikation des Influenza-Genom-Studie, ist es sinnvoll, mit isolierten vRNPs Arbeit, so dass andere Komponenten des Virus nicht mit diesen Prozessen stören. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um diese vRNPs von der Influenza A-Virus zu reinigen. Das Verfahren beginnt mit der Unterbrechung der Influenza-A-Virion mit Reinigungsmitteln, um die vRNP Komplexe aus den umhüllten Virion freizugeben. Die vRNPs werden dann von den anderen Komponenten des Influenza-A-Virion auf einem 33-70% diskontinuierliche Glycerin-Gradienten durch Geschwindigkeit Sedimentation abgeschieden. Die Fraktionen aus der Glycerin-Gradienten gewonnen werden dann über SDS-PAGE nach Färbung mit Coomassie-Blau analysiert. Die Peak-Fraktionen, die NP werden dann gepoolt und konzentriert durch Zentrifugation. Nach Einengen wird die Integrität der vRNPs durch Visualisierung der vRNPs durch Transmissionselektronenmikroskopie nach negativen Färbung überprüft. Das Glycerin Gradientenreinigung ist eine Abwandlung davon aus Kemler

Protokoll

Teil 1: Störung des Influenza-A-Virion

1. Add 750 ul der MNT-Puffer (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in einem Beckman Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen (11 mm x 34 mm) entwickelt, um in eine TLA-120,2 Rotor für den Einsatz in einem Beckman Optima fit Max-E Ultrazentrifuge.
2. Add 500 ul des Influenza A Virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 Stamm; 2 mg / ml) in die Röhre. Mix das Virus mit der MNT-Puffer durch Auf-und Abpipettieren mehrmals.
3. Zentrifuge für 10 Minuten bei 109.000 xg, 4 ° C in einem Beckman Optima Max-E-Zentrifuge mit einem Rotor TLA-120,2.
4. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 500 ul Störung Puffer (100 mM KC....

Diskussion

Die Reinigung von vRNPs wird über das Verfahren durch Kemler et al. (1994) beschrieben wird. ¹ Wir und andere haben auch dieses Protokoll verwendet, um vRNPs zu isolieren, um ihre nuklearen Import-Studie. ^2,4,5

Wir empfehlen die Verwendung von RNase-freien Spitzen und Rohre beim Manipulieren vRNPs weil das virale Genom von RNA besteht, und damit verschlechtert sich leicht in die Gegenwart von RNA. Darüber hinaus sollten alle Puffer in Wasser, RNase frei gemacht.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
H3N2 X-31 A/AICHI/68 Influenza A	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glycerin	Fisher Scientific	G33-1
Octylglucosid	Sigma-Aldrich	O-8001
Lysolecithin	Sigma-Aldrich	L-4129
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D-9779
Coomassie brillantblau G-250	Kodak	1367796
mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltes Wasser	Invitrogen	750024
Uranylacetat	Ted Pella, Inc.	19481
Ammonium-Molybdat	Fisher Scientific	A-674
Optima MAX-E Ultrazentrifuge	Beckman Coulter Inc.
MLS-50 Rotorpaket, Schwingschaufel	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 Bremsscheibe, fester Winkel, Titan	Beckman Coulter Inc.
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000