Die Entzifferung Axonal Pathways von genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der Küken Neuralrohr Verwendung In ovo Elektroporation

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt, wie axonale Wege der genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der embryonalen chick Rückenmark Nutzung visualisieren In ovo Elektroporation von Reporter-Gene unter der Kontrolle von spezifischen Enhancer-Elemente.

Zusammenfassung

Beschäftigung von Enhancer-Elemente zur Expression von Reporter-Gene in Nervenzellen Laufwerk ist ein weit verbreitetes Paradigma für die Verfolgung von axonalen Projektion. Für Tracking axonale Projektion der spinalen Interneuronen bei Wirbeltieren, Ertrag Keimbahn gezielte Reportergene bilateral symmetrische Kennzeichnung. Daher ist es schwer, zwischen dem ipsi-und contra-seitlich abstehende Axonen zu unterscheiden. Einseitige Elektroporation in das Küken Neuralrohr stellt ein nützliches Mittel, um die Expression eines Reportergens zu einer Seite des zentralen Nervensystems zu beschränken und axonale Projektion auf beiden Seiten folgen

Protokoll

I. Die Elektroporation

Egg Handling

1. Legen Sie die Eier in einem befeuchteten Inkubator eingestellt auf 37-38 ° C, vorzugsweise einem Inkubator mit einem Schaukelstuhl Tabletts.
2. Embryo nach etwa 66 Stunden der Inkubation elektroporiert, wenn sie Hamburger und Hamilton (HH) Stufe 18-20 erreicht haben. In diesem Stadium der Kopf liegt im rechten Winkel zum Rumpf (Bedingung genannt zervikalen Biegung) und eine große Reihe von extra-embryonalen Blutgefäße, wie anterior, posterior, rechts und links Dottervenen gesehen werden sollte. Dies ist eine optimale Bühne für Enhancer-abhängigen Expression ^1,3,4. Es ist wichtig, Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Inkubators zu überwachen, um tragfähige und synchronisiert Embryonen zu erhalten.
3. Nach 66 Stunden Inkubation, entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator. Legen Sie die Eier horizontal. Warten Sie 5-10 Minuten. Der Embryo ist jetzt am oberen Pol des Eies befindet.

Die Vorbereitungen

1. Bereiten Hank-Lösung mit Penicillin / Streptomycin (P / S) (1:100 Verdünnung).
2. Pull Glaskapillaren (0,5 mm Durchmesser) zu Mikrokapillare.
3. Platzieren Sie die Elektroden (Wolfram) in Mikromanipulator und verbinden Elektroden an den Impulsgenerator (ECM 830).
4. Passen Sie den Impulsgeber mit folgenden Parametern: Spannung 30V, Anzahl der Impulse - 3, Länge des Impulses 50 ms.
5. Bereiten Sie einen Mund pipettieren, eine Kanüle und ein Band.
6. Bereiten Sie eine beliebige Mischung von DNA (2-5μg/μl) und fügen Sie ein Fast Green Farbstoff.

Windowing und Elektroporation

1. Mit einer Spritze entfernen 5-6 ml von Albumin aus jedem Ei.
2. Mit einer kleinen Schere öffnen Sie eine ovale Fenster an der Oberseite des Eies.
3. Moist der Embryo mit 0,5-1ml Hanks + P / S-Lösung.
4. Verwenden Sie einen Mund pipettieren, laden Sie das Glas mit DNA-Gemisch Mikrokapillare.
5. Setzen Sie den Embryo mit seinem Schwanz in Ihre Richtung. In diesem Stadium ist der Embryo das Rückenmark deutlich zu erkennen. Daher sind keine gegensätzlichen Techniken erforderlich. Das Rückenmark ist an beiden Enden, der Kopf und der Schwanz dicht, aber wenn Ihr Mikrokapillare ist dünn genug, werden Sie in der Lage, Punktion ein kleines Loch und durchdringen das Neuralrohr in einem flachen Winkel. Ein Mikrokapillare der richtige Durchmesser sollten leicht geladen werden mit DNA, dringen in die Röhre, ohne es zu beschädigen und lassen Sie die DNA mit einem regelmäßigen Ausatmen.
6. Spritzen Sie die DNA mit einem Mund pipettieren. Der grüne Farbstoff sollte von der Spitze des Schwanzes bis zu den Vesikeln des sich entwickelnden Gehirns verteilt.
7. Platzieren Sie die Elektroden parallel zu den Neuralrohrdefekten, so nah wie du kannst, ohne sie zu berühren das Rohr selbst und Puls. Zum Zeitpunkt des Pulses, müssen die Elektroden mit flüssigem dafür, dass die elektrische Leitfähigkeit abgedeckt werden. Normalerweise ist die Menge an Hank ist am Betteln hinzugefügt ausreichend. Wenn nicht einen Tropfen Hank ist nur vor dem Impuls.
8. Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und dichten die Fenster mit einem Klebeband. Es ist wichtig, um das Ei ganz Dichtung zu verhindern Trocknung des Embryos während der folgenden Inkubationszeit.
9. Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator.

II. Rückenmark open-book Vorbereitung

Detachment des Rückenmarks aus dem Embryo

1. Entfernen Sie die eletroporated Embryo, bei E6, aus dem Ei und legen Sie sie in einer Petrischale mit Silikon mit PBS beschichtet.
2. Schneiden Sie die Membranen und strecken den Embryo auf seine Bauchseite mit Stiften, es zu halten.
3. Mit einem scharfen Wolfram Mikrokapillare einen Längsschnitt entlang der Dachplatte aus dem Hinterhirn bis zum Schwanz.
4. Machen Sie zwei zusätzliche Längs-Schnitte an beiden Seiten des Rückenmarks, Ablösen der Spinalganglien (DRG) vom Rückenmark.
5. Lösen Sie die Bodenplatte aus dem Gewebe ab dem Schwanz auf die Hinterhirn, so dass das Rückenmark intakt.
6. Cut das Rückenmark in einem Querschnitt an der Hinterhirn mit einer feinen Schere und trennte es aus dem Körper.

Fixierung

1. Verbreiten Sie die isolierten Rückenmark in eine neue Petrischale mit Silikon enthält PBS, mit Stiften, es zu halten, aus dem Hinterhirn bis zum Schwanz Herstellung einer flachen-mount Präparat beschichtet.
2. Gießen Sie die PBS von der Schale und ersetzen Sie es mit 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.
3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.

Immunhistochemie

1. Übertragen Sie die feste Rückenmark in eine Flasche mit primärem Antikörper in PBS.
2. Inkubieren mit sanften Aufregungen über Nacht bei 4 ° C.
3. Waschen Sie die Antikörper X5 mal mit PBS, jeder Wäsche für 1 Stunde mit leichten Erschütterungen.
4. Add sekundären Antikörper und Inkubation mit sanften Aufregungen über Nacht bei 4 ° C.
5. Waschen Sie die Antikörper X5 mal mit PBS, die jeweilsWaschen für 1 Stunde mit leichten Erschütterungen.

Montage offenes Buch für die Bildgebung

1. Smear Fett oder Silikon in eine rechteckige Form auf einer Folie und tropft PBS innen.
2. Legen Sie das Rückenmark in der Mitte des Rechtecks ​​mit einer Pinzette und ziehen Sie die Flüssigkeit um es mit einer Pasteurpipette gestreckt.
3. Legen Sie 1-2 Tropfen Eindeckmittel auf das Rückenmark und Deckel mit Deckglas. Squash es zu vermeiden, Luftblasen.
4. Halten Sie die Folien in dunklen in 4 ° C.
5. Überprüfen Sie das Rückenmark mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie.

Diskussion

Elektroporation von Plasmid-DNA in das Hühnerembryo entwickelt sich als eine leistungsstarke Technik für in vivo ektopische Expression. Die Kombination von spezifischen Enhancer und chick Elektroporation bietet eine schnelle und effiziente Werkzeug für die Entschlüsselung axonalen Wege eines genetisch definierten Gruppe von Neuronen ^1,3,5. Mit Hilfe des Cre / loxP und die Gal4/UAS Verstärkung Systeme ergänzen die Höhe und Dauer der Ausdruck. Das entstehende Bild ist von einem komplexen Divergenz der axonalen ...