Wir beschreiben eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Protein Trennung durch SDS-PAGE, Antigen-Retrieval und Immunoblot mit einem Antikörper gegen das Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen monomeren und multimeren Aß in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.
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Methodenartikel
SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die anomale Falten und Polymerisation des β-Amyloid (Aß)-Peptid wird angenommen, dass die neurodegenerative Kaskade in der Alzheimer-Pathogenese der Erkrankung einleiten
Protokoll
Teil 1: Herstellung von geklärt Gewebehomogenaten
- Dounce homogenisieren fixierten kortikalen Gewebe in 4-fache Volumen von eiskaltem Puffer (0,1 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung [Ca + + - und Mg + +-freien] plus 2x Protease-Inhibitor-Cocktail [Santa Cruz]) mit ca. 30 sogar Pistill Schlägen (zB das Hinzufügen von 400μl Puffer bis 100 mg Gewebe).
- Spin-Homogenate für 5 Minuten bei 3.000 g (4 ° C). Entfernen Sie vorsichtig geklärt Überstände und speichern Aliquots dieser Extrakte bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Bestimmen Gesamt-Protein-Konzentration (ug / ul) für geklärt Homogenaten mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay, nach den Anwe....
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Diskussion
Trotz der Bedeutung der Aß Aggregation in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit 1,4,5, haben nur wenige Studien beschrieben oder quantifiziert die Verteilung der verschiedenen Aß-Multimere in menschlichen kortikalen Gewebeproben 2. Häufig verwendete immunhistochemische Techniken nicht für die Diskriminierung von unterschiedlichen multimeren Aß Spezies in festen kortikalen Gewebes ermöglichen. In fixierten kortikalen Gewebehomogenaten kann Aß Multimere getrennt und biochemisch untersucht mittels G.......
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Danksagungen
Vielen Dank an Elaine Pranski und Carolyn Suwyn für hervorragende technische Unterstützung und Harry LeVine III, M. Paul Murphy, und Marla Gearing für wichtige Gespräche. Die Finanzierung wurde von RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, die Woodruff-Stiftung und der Emory University Research Committee zur Verfügung gestellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Vollständige Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1 Tablette in 25 ml Puffer |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell und XCell II Blot-Modul-Kit CE-Kennzeichnung | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS-Probe-Puffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE Reduzierendes Reagenz (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 Präfärbter Standard | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex 10-20 % Tricine-Gel 1,0 mm, 10 Vertiefungen | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Nitrocellulose-Membranen, 0,2 μm Porengröße | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS Laufpuffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-Glycin-Transferpuffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Stört die Immunfärbung nicht |
| ATX Ponceau S Rötungslösung | Sigma-Aldrich | 09276 | Stört die Immunfärbung nicht |
| Kapak wiederversiegelbare Kunststoffprobenbeutel | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| 6E10 Maus-monoklonaler Antikörper gegen Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | 1:1.000 bis 1:5.000 für WB verdünnen |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Maus-IgG, HRP-gekoppeltes Ganzantikörper Aβ (aus Schaf) | GE Healthcare | NA931-1ML | 1:10.000 verdünnen |
| SuperSignal West Pico chemilumineszenter Substrat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
Referenzen
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in n....
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Nachdrucke und Genehmigungen
