Drosophila Cuantificación de unión neuromuscular (NMJ): un método para evaluar la morfología sináptica y la función

Overview

La unión neuromuscular Drosophila (NMJ) se utiliza como modelo para estudiar la morfología y la función de las sinapsis. Este video describe características importantes que los investigadores cuantifican para caracterizar el NMJ. El protocolo de ejemplo muestra un software capaz de realizar la cuantificación automáticamente.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput y Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).

1. Requisitos antes del procesamiento de imágenes

1. Realiza Drosophila preparaciones de libros abiertos de terceras larvas errantes instar (L3), como se describió anteriormente.
2. Co-inmunoetiqueta Drosophila NMJ terminales utilizando una combinación de dos marcadores: Dlg-1 o Hrp junto con Brp para su análisis con"Drosophila NMJ Morphometrics", y Syt o Csp junto con Brp para su análisis con"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   NOTA: Los anticuerpos de la misma especie se pueden combinar preetiquetando uno con un kit de conjugación de anticuerpos como los kits de etiquetado Zenon Alexa.
3. Imagen de terminales NMJ utilizando un microscopio de elección, por ejemplo, fluorescencia (con o sin ApoTome) o microscopía confocal.
   1. Adquiera una pila de imágenes de 2 canales del terminal NMJ.
      1. Ajuste los ajustes del microscopio de una manera que el canal 1 adquiera el terminal NMJ inmunoetiquetado con Dlg-1 (o Hrp, Syt, Csp) y el canal 2 el terminal NMJ inmunoetiquetado con Brp.
      2. Opcionalmente, analice imágenes de un canal (de sinapsis inmunoetiquetadas con un solo anticuerpo) con las macros. Imagen NMJs inmunoetiquetado únicamente con Dlg-1 o Hrp para su análisis con"Drosophila NMJ Morphometrics", o Syt o Csp para"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         NOTA: No es posible analizar sinapsis inmunodeprimdas con sólo anti-Brp.
   2. Exporte las imágenes obtenidas como archivos de .tiff individuales. Invierta la orden de canal antes de ejecutar las macros si no se adquiere como se indica.

2. Requisitos de software e instalación

1. Descargue las macros:"Drosophila NMJ Morphometrics" y"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" desde el siguiente sitio web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Mueva el cursor a la carpeta "Macros update 1" y haga clic en la opción que aparece "ver". Aparecerá una lista con el contenido de esta carpeta. La carpeta contiene las macros"Drosophila NMJ Morphometrics" y"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   NOTA: Ambas macros son compatibles con las versiones 1.4 de Fiji, que también se proporcionan en la misma carpeta. Es posible que las macros no se ejecuten en versiones recientes. Utilice la versión proporcionada 1.4. No es problemático iniciar esta versión, incluso en ordenadores con una versión más reciente de Fiji disponible.
3. Haga clic en "Descargar todo". El contenido de la carpeta se descargará en el equipo como un archivo de .zip. Descomprima el archivo descargado.
4. Copie los archivos Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm y Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm en Fiji.app/plugins/ directorio. Al reiniciar el programa, las macros aparecerán en la parte inferior del menú desplegable Plugins.

3. Ejecute la sub-macro "Convertir a pila" para crear proyecciones Z e hiperstacks de las imágenes NMJ

1. Inicie la interfaz gráfica seleccionando Plugins en la barra de herramientas y elija"Drosophila NMJ Morphometrics" en el menú desplegable.
2. Defina la configuración "Cadena de archivo única" en la interfaz gráfica de la macro.
   NOTA: El software de microscopio utiliza una firma de identificación para organizar planos y canales al almacenar pilas como archivos de .tiff individuales. La configuración de cadena de archivo única introducida debe especificar la firma asignada por el software al primer plano del primer canal (importante: es necesario indicar el plano más bajo y el número de canal).
3. Seleccione solo la sub-macro "Convertir a pila" y haga clic en "Aceptar" y seleccione la carpeta donde se encuentran las imágenes. Si se selecciona un directorio principal con varias subcarpetas, se procesarán todos los archivos '.tiff individuales dentro del directorio principal y la subcarpeta que coincida con los criterios de cadena de archivo únicos.
   1. Si la pila z solo contiene un canal, seleccione el cuadro "Solo canal 1".
4. Observe que aparecerán dos archivos nuevos por imagen NMJ, de forma predeterminada denominados stack_image_name y flatstack_image_name. Almacene solo estas pilas y flatstack para su posterior análisis. La serie de archivos .tiff se puede eliminar en este momento, minimizando las capacidades de almacenamiento necesarias y evitando posibles orígenes de errores.

4. Ejecute la sub-macro "Definir ROI" para delinear el Terminal de Interés nmj

1. Inicie la interfaz gráfica de"Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Seleccione sólo la casilla de verificación "Definir ROI" y pulse "OK" y seleccione el directorio principal donde se almacenan las imágenes tituladas flatstack_name y pulse "Seleccionar". La sub-macro "Definir ROI" busca automáticamente a través de todas las subcarpetas dentro del directorio principal seleccionado.
3. A medida que se abre la primera proyección, seleccione la herramienta "Selecciones a mano alzada" en la barra de herramientas.
4. Con el ratón dibuje una selección que contenga exclusivamente el terminal nmj completo de interés y haga clic en "Aceptar" en la ventana "Definir terminal". La macro continuará con la próxima proyección.
5. Delinee el siguiente ROI y repita hasta que se definan todos los ROIs. El archivo de imagen ROI, denominado "roi_image_name", se almacenará en el mismo directorio que las imágenes de pila y proyección generadas anteriormente para cada una de las imágenes procesadas. La salida de esta sub-macro es una imagen binaria del ROI en blanco sobre un fondo negro.

5. Ejecute la sub-macro "Analyze" para cuantificar las características del terminal NMJ

1. Vaya a la barra de herramientas, seleccione "Plugins" y utilice:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" al analizar sinapsis inmunoetiquetadas con anti-Dlg-1 o anti-Hrp (canal 1) junto con anti-Brp (canal 2), o"Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" al analizar sinapsis inmunoetiquetadas con anti-Syt o anti-Csp (canal 1) junto con Brp (canal 2).
   1. Cuando se van a analizar pilas de imágenes de un canal (el canal estructural Dlg-1 o HRP para "Drosophila_NMJ_Morphometrics", o Syt o Csp para"Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), seleccione la casilla "Solo canal 1".
2. Ajuste la escala correspondiente a las imágenes que se analizarán.
   1. Si un píxel de la imagen corresponde a 2,5 μm, indique Scale-Pixels = 1, Scale-Distance en μm = 2,5. En caso de que ambas configuraciones se dejen en 0, el área NMJ, el perímetro, la longitud y la longitud de la rama más larga se expresarán en número de píxeles.
3. Si es necesario, ajuste la configuración de análisis predeterminada de la macro. Realice ajustes solo si la sub macro "Analizar" se ha ejecutado previamente con resultados insatisfactorios (consulte el final de esta sección y la sección 6 para obtener instrucciones sobre cómo optimizar la configuración).
4. Seleccione las casillas de verificación "Analizar" y "Esperar" y pulse "OK".
   1. Active la casilla de verificación "Esperar" al ejecutar la sub macro "Analizar" en imágenes de 2 canales. De lo contrario, pueden producirse errores en el recuento de zonas activas debido a capacidades limitadas del equipo.
5. Cuando se abra una nueva ventana "Elegir un directorio", seleccione el directorio donde se encuentran las imágenes y pulse "seleccionar". La macro analizará todas las imágenes almacenadas en el directorio principal y, si procede, las carpetas posteriores (utilizando los tres archivos de ejecución de las sub macros anteriores: stack_image_name, flatstack_image_name y roi_image_name). La macro procesa cada imagen de forma individual y consecutiva. Esto puede tardar varios minutos por pila de imágenes (dependiendo de la capacidad del equipo).
6. Después de ejecutar la macro, tenga en cuenta que se creará un nuevo archivo de imagen denominado res_image_name para cada sinapsis analizada almacenada en la carpeta parental. Las mediciones cuantitativas se almacenarán como archivo "results.txt".
7. Inspeccione todas las imágenes de resultados para detectar y excluir imágenes con errores de segmentación. Los posibles errores de segmentación se describen en la Tabla 1,junto con consejos sobre cómo ajustar la configuración para eludir estos errores. Las imágenes de resultados con estos errores de segmentación se proporcionan como ejemplos en la Figura 1.
   NOTA: Al ejecutar la macro con la configuración predeterminada observada en la interfaz de usuario, hubo una precisión de aproximadamente el 95 % cuando la evaluación de macros se comparó con la evaluación manual.

6. Ajuste la configuración de macro a las imágenes

1. Cuando más del 5% de las imágenes muestren errores de segmentación, explore los diferentes algoritmos para definir o elegir la configuración de macro más adecuada para las imágenes.
2. Ajuste el valor del radio de la bola rodante
   NOTA: La función de radio de bola enrollable resta el fondo de la imagen. Esta función es de vital importancia cuando se trabaja con imágenes adquiridas en microscopios de fluorescencia y/o cuando las imágenes tienen un alto ruido de fondo. La resta del fondo ayudará a los pasos de umbral automático de la macro para producir una segmentación adecuada de los terminales NMJ.
   1. Seleccione tres imágenes stack_image_name NMJ generadas por la sub-macro "Convertir en pila". Elija las imágenes que sean representativas para el dataset de imagen.
   2. En la barra de herramientas, seleccione Imagen | Color | Canales divididos. Se crearán dos pilas de imágenes, una representando el canal 1 y la otra canal 2, respectivamente y guárdelas.
   3. Abra la pila de imágenes que pertenece al canal 1 abierto, correspondiente al inmunoetiquetado Dlg-1, Hrp, Syt o Csp.
   4. Ejecute el filtro "Restar fondo" seleccionando "Procesar" en la barra de herramientas seguido de "Restar fondo..." en el menú desplegable.
   5. Haga clic en la casilla de verificación de vista previa en la ventana emergente y ajuste el radio de la bola de rodadura al valor más adecuado para las imágenes. El ajuste "Radio de bola rodante" debe ajustarse a valores que aumenten el contraste entre sinapsis y fondo (consulte la Figura 2A').
      1. Consulte la Figura 2 para obtener un ejemplo. En el panel A, partes de la sinapsis muestran los mismos niveles grises que el fondo, mientras que en la Figura 2 panel A' un "Radio de bola rodante" de 500 resulta en un fuerte contraste entre la sinapsis y el fondo.
   6. Cree una proyección z seleccionando en la barra de herramientas Imagen | Pila| Proyección Z, elija Tipo de proyección = Intensidad máxima y guarde la imagen resultante. Cuando se defina el valor adecuado para el radio de la bola rodante, ejecute el algoritmo "Restar fondo" en las imágenes representativas restantes con el mismo valor de radio de bola de rodadura. Cree las proyecciones Z y guárdelas (en cualquier directorio).
      NOTA: El valor de radio de bola de rodadura para imágenes de 8 bits o RGB debe ser al menos tan grande como el radio del objeto más grande de la imagen que no forma parte del fondo. Para las imágenes de 16 y 32 bits, el radio debe ser inversamente proporcional al rango de valores de píxeles.
3. Determinar los diferentes umbrales automáticos que se utilizarán
   1. Abra las proyecciones Z guardadas en el paso anterior (6.2.6) y seleccione Imagen | Ajustar | AutoThreshold | Pruébalo todo.
   2. Como una imagen de resultado umbral binario aparecerá con todos los diferentes algoritmos de umbral automático, determine el algoritmo más adecuado para las imágenes.
      1. Al ejecutar la macro más adelante, cambie el umbral en la configuración de macro en consecuencia.
      2. Utilice umbrales más restrictivos como "RenyiEntrophy" o "Momentos" como umbral de esquema NMJ y umbrales más permisivos como "Li" para determinar el esqueleto nmj, y "Huang" para determinar las zonas activas. Cuando las imágenes son muy nítidas con poco o ningún fondo, utilice "Huang" como" umbral de contorno NMJ. De lo contrario, es posible que falten partes de la sinapsis después de la segmentación de imágenes.
      3. Consulte la Figura 2B para obtener un ejemplo. La segmentación adecuada de la sinapsis se obtiene con umbrales automáticos resaltados por cuadros verdes. Algunos ejemplos de umbrales no adecuados se resaltan por cuadros rojos (marque sinapsis en alta ampliación). En este último, faltan partes de la sinapsis o se incluyen partes del fondo.
4. Determinar el tamaño máximo de las partículas pequeñas
   NOTA: Esta función excluirá del análisis todas las partículas detectadas por el umbral de contorno NMJ y el umbral esqueleto que sean menores que el valor definido en el "ajuste de partículas pequeñas". Este valor se define en píxeles. Esta función sirve como filtro de ruido y es muy útil cuando hay altas tasas de fondo no uniforme (como cristales/polvo) en las imágenes obtenidas.
   1. Abra las proyecciones Z guardadas en el paso 6.2.6. y establezca la escala para detectar el número de píxeles a través de Analizar | Establezca Escala. Aplique los siguientes ajustes: distancia en píxeles = 1, distancia conocida = 1, relación de aspecto de píxeles = 1, Unidad de longitud = píxel y pulse "Ok". Haga clic en la herramienta "Selección ovalada" en la barra de herramientas.
   2. El uso del ratón dibuja una selección que rodea de cerca las partículas individuales que están presentes en el inmunodetención pero no pertenecen al NMJ. Presione Ctrl+m para un usuario de Windows o cmd+m para usuarios de Mac. Se abrirá una ventana de resultados que indicará el área de las partículas seleccionadas en número de píxeles.
   3. Repita el paso anterior varias veces con varios artefactos presentes en las imágenes para determinar el área de partículas/artefactos contaminante más grande. Este será el valor que se establecerá en la configuración al ejecutar la macro más adelante. Al ejecutar la macro, establezca el "Tamaño de partículas pequeñas" como el tamaño de partícula más pequeño observado pus un margen del 25%.
   4. Consulte la Figura 2D para obtener un ejemplo. El cristal más grande detectado tiene un área de 112 píxeles. El ajuste "Tamaño de partículas pequeñas", al procesar esta imagen con la macro, debe establecerse en 125 - 150.
5. Determinar el tamaño mínimo del bouton
   NOTA: Esta función excluirá todos los boutons detectados por el umbral de esquema NMJ que son más pequeños que el valor definido del análisis. Este valor se define en píxeles.
   1. Siga los mismos pasos descritos en la sección 6.4, pero en este caso dibuje una selección que rodee los boutons más pequeños presentes en el terminal NMJ. Elija el área más pequeña correspondiente al bouton más pequeño de los medidos. Este es el valor que se debe establecer en la configuración de tamaño de bouton mínimo al ejecutar la macro más adelante.
6. Definir el valor "Maxima noise tolerance"
   1. Para definir el valor "Buscar tolerancia máxima al ruido" para la macro, abra la pila Z del canal 2 guardada en la sección 6.2.2.
   2. Ve a la pestaña plugins en el menú emergente, selecciona Procesar | Maximum(3D) y cuando aparezca el maximum_image_name (que puede tardar unos minutos), cierre la pila de imágenes original.
   3. Seleccione la Maximum..._image_name (la pila de imágenes recién obtenida) y seleccione Plugins | Proceso | Mínimo (3D), cuando la nueva imagen Mínimo de Maximum..._image_name apears cierra la pila Máximo... _image_name.
   4. En la barra de herramientas, seleccione Procesar | Encuentra maxima.... Una nueva ventana "Find maxima..." se abrirá. Haga clic en la casilla de verificación "Vista previa de la selección de puntos..." y rellene el cuadro "Tolerancia al ruido" con la configuración de macro predeterminada 50. Los puntos máximos se indicarán en la imagen como pequeñas cruces.
      1. Aumente el valor de "Tolerancia al ruido" si observa un exceso de zonas activas anotadas, es decir, cruces que no están en la parte superior de las zonas activas que no están enfocadas en el plano de pila seleccionado, o zonas activas falsas que se detectan en segundo plano.
         1. Por otro lado, si observa zonas activas anotadas incompletamente, es decir, las zonas activas enfocadas que no se reconocen, disminuya el valor de "Tolerancia al ruido máxima". Siga intentando diferentes valores después de este procedimiento hasta que las cruces etiqueten adecuadamente las zonas activas en foco. Rellene la "Buscar tolerancia máxima al ruido" con este valor.
         2. Consulte la figura 2C para obtener un ejemplo. Se detectan demasiadas zonas activas. En la Figura 2C' sólo se detectan las zonas activas en el foco al aumentar el valor de "Tolerancia al ruido máxima".
   5. Ejecute la sub-macro "Analizar" para las imágenes representativas seleccionadas en el paso 5.1, con la configuración definida en todos los pasos anteriores.
7. Ajuste el umbral inferior y superior de Brp-puncta
   1. Observe que aparecerá un nuevo archivo después de ejecutar la macro según el paso 6.6, llamado 2_active_zone_stack_image_name. En esta pila de imágenes, las zonas activas detectadas por la función "Buscar maxima" se indican mediante puntos blancos en cada plano.
   2. Abra este archivo arrastrándolo y soltándolo en la barra de herramientas y seleccione Imagen | Pila | | del proyecto Z Tipo de proyección = Sectores de suma. Se obtendrá una proyección del 2_active_zone_stack_image_name.
   3. Seleccione | de imagen Ajustar | umbral. Se abrirá una nueva ventana "Umbral". Deslice la barra superior para elegir un valor de umbral donde, todos los puntos foci/Brp positivos deseados se visualizan en rojo.
      NOTA: Si el umbral se establece demasiado bajo, se contará un exceso de zonas activas. Si se establece demasiado alto, se perderá una fracción de las zonas activas.
      1. Consulte la Figura 2E para obtener un ejemplo. Cuando el umbral se establece en 400, la mayoría de las zonas activas (simbolizadas como foci de 1 píxel) no se incluyen en la segmentación, ya que no se resaltan en rojo (Figura 2E). Cuando el umbral se establece en un valor de 50 todas las zonas activas se resaltan en rojo (Figura 2E').
   4. Defina este valor como umbral mínimo. Deje "Umbral de puncta superior" en el valor máximo.
   5. Vuelva a ejecutar la sub-macro "Analizar" para las imágenes representativas con la configuración definida en todos los pasos anteriores de esta sección. Evalúe críticamente los archivos de imagen resultantes y asegúrese de que la segmentación se realiza correctamente. Si este no es el caso, reajuste la configuración de acuerdo con la naturaleza de los errores de segmentación (Figura 1, Tabla 1).

Representative Results

Figura 1: Ejemplos de resultados de segmentación de macros inapropiados. Imágenes de resultados después de ejecutar"Drosophila NMJ Morphometrics" o"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Las partes del terminal sináptico no están incluidas en el contorno amarillo (A). Partes del fondo se incluyen en el terminal sináptico por el contorno amarillo (B). La línea de esqueleto azul se extiende más allá del terminal sináptico (C - D). Se detectan demasiadas zonas activas (E - E'). Algunas zonas activas siguen sin ser detectadas por el análisis (G - G'). Las zonas activas se detectan fuera de la sinapsis (F). Segmentación de bouton incorrecta (Sólo aplicable al ejecutar Drosophila NMJ Bouton Morphometrics), boutones se pierden (H) o demasiados boutons son detectados por la segmentación (I). Partículas tales cristales o polvo que forman parte del fondo se incluyen en la segmentación (J). La información sobre cómo cambiar la configuración para evitar estos errores se proporciona en la Tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplos de ajustes de macroa configuración y sus consecuencias para la segmentación de imágenes. (A) Reste la vista previa de fondo de una sinapsis inmunoetiquetada Dlg-1, en imágenes en un microscopio de fluorescencia con ApoTome, cuando el "radio de bola rodante" se establece en 20 (A) o 500 (A '). (B) Imágenes de salida obtenidas después de ejecutar Image | Ajustar | | de umbral automático Pruebe toda la imagen ilustra las segmentaciones de imagen obtenidas por los 16 algoritmos de umbral automático diferentes. (C) vista previa "Buscar Máxima" al configurar "Tolerancia al ruido" a 50 (C) y 500 (C'); Las zonas activas detectadas por la segmentación están etiquetadas por una pequeña cruz. (D) Medición de las "partículas pequeñas" que aparecen en el fondo de la imagen de una sinapsis inmunoetiquetada con anti-Hrp, en imágenes en un microscopio confocal. (E) Proyección de "Rodajas de suma" obtenida del 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Umbral se establece en 400 (E) y en 50 (E'). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

segmentación	Errores observados	ejemplo	Ajustes necesarios
Área y perímetro de NMJ (Representado por contorno amarillo en la imagen de resultado)	Partes del terminal sináptico no están incluidas en el contorno amarillo o partes del fondo se incluyen en el terminal sináptico descrito en amarillo.	Figura 2A-B	Ajuste el valor de 'Radio de bola rodante'. Ver sección 6.1.	Ajuste el "umbral de contorno NMJ". Ver sección 6.2.
Parámetros relacionados con la longitud nmj (Representado por la línea de esqueleto azul en la imagen de resultados)	La línea de esqueleto azul se extiende más allá o no está presente a lo largo de todo el terminal sináptico.	Figura 2C-D	Ajuste el valor de 'Radio de bola rodante'. Ver sección 6.1.	Ajuste el "umbral de contorno NMJ". Ver sección 6.2.
Puncta positivo de Brp (Representado por puntos en la imagen de resultados)	Se detectan demasiadas zonas activas.	Figura 2E-E'	Disminuya el valor "Buscar tolerancia máxima al ruido". Ver sección 6.5.
Puncta positivo de Brp (Representado por puntos en la imagen de resultados)	El análisis echa de menos las zonas activas.	Figura 2G-G'	Aumente el valor "Buscar tolerancia máxima al ruido". Ver sección 6.5.	Disminuya el "umbral inferior Brp-puncta". Ver sección 6.6.
Puncta positivo de Brp (Representado por puntos en la imagen de resultados)	Se detectan artefactos de zona activa fuera del terminal sináptico.	Figura 2F	Ajuste la sección 6.2 del "umbral de zona activa".	Aumentar el "umbral inferior Brp-puncta". Ver sección 6.6.
Partículas pequeñas	Partículas como cristales o polvo que son parte de los antecedentes parecen estar incluidos en la segmentación.	Figura 2J	Seleccione la casilla "Eliminar partículas pequeñas". Ver sección 6.3.	Determine el tamaño máximo de las partículas pequeñas. Ver sección 6.3.
Segmentación de Bouton	Segmentación incorrecta de bouton (Sólo aplicable a Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; no utilice Drosophila NMJ Morphometrics para la segmentación bouton).	Figura 2H-I	Ajuste el "umbral de contorno NMJ". Ver sección 6.1.	Determine el "tamaño mínimo del bouton". Ver sección 6.4.

Tabla 1: Guía de solución de problemas para los diferentes tipos de errores en la segmentación de imágenes que pueden producir las macros. En esta tabla se describen diferentes tipos de errores de segmentación de imágenes producidos por las macros. Estos se pueden detectar fácilmente en las imágenes de resultados. Ejemplos de cada tipo de error se muestran en la Figura 1. En la "sección de ajustes" de la tabla, se resaltan los ajustes que deben ajustarse y se hace referencia al usuario al subescalado crítico de la sección 6, que describen cómo ajustar estos ajustes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI