Drosophila Nöromüsküler Kavşak (NMJ) Nicelemesi: Sinaptik Morfoloji ve fonksiyonu değerlendirmek için bir yöntem

Overview

Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ), sinapsların morfolojisini ve işlevini incelemek için bir model olarak kullanılır. Bu video, araştırmacıların NMJ'yi karakterize etmek için ölçtüklerine dair önemli özellikleri açıklar. Örnek protokol, nicelemeyi otomatik olarak gerçekleştirebilen bir yazılımı gösterir.

Protocol

Bu protokol Castells-Nobau ve ark., Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp'inYüksek verimli ve Çok parametrik Nicelemesi için İki Algoritma'dan bir alıntıdır. (2017).

1. Görüntü İşlemeden Önceki Gereksinimler

1. Daha önce açıklandığı gibi, üçüncü instar gezgin larvalarının (L3) Drosophila açık kitap hazırlıklarını gerçekleştirin.
2. İki işaretleyicinin birleşimini kullanarak eş-immünolabel Drosophila NMJ terminalleri:"Drosophila NMJ Morphometrics" ile analiz için Brp ile birlikte Dlg-1 veya Hrp ve "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" ile analiz için Brp ile birlikte Syt veya Csp.
   NOT: Aynı türden antikorlar, zenon Alexa Etiketleme Kitleri gibi bir antikor-konjugasyon kiti ile önceden etiketlenerek birleştirilebilir.
3. Görüntü NMJ terminalleri, örneğin floresan (ApoTome olsun veya kullanmasın) veya konfokal mikroskopi gibi tercih eden bir mikroskop kullanarak.
   1. NMJ terminalinin 2 kanallı görüntü yığınını alın.
      1. Mikroskop ayarlarını, kanal 1'in Dlg-1 (veya Hrp, Syt, Csp) ve kanal 2 NMJ terminali brp ile bağışıklık etiketli NMJ terminalini immünoplabeled olarak elde edecek şekilde ayarlayın.
      2. İsteğe bağlı olarak, makrolarla tek kanallı görüntüleri (tek bir antikorla bağışıklık sistemine bağlı sinapsların) analiz edin. Görüntü NMJ'leri,"Drosophila NMJ Morphometrics" ile analiz için Dlg-1 veya Hrp veya "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" için Syt veya Csp ile benzersiz bir şekilde immün etiketlenmiştir.
         NOT: sadece anti-Brp ile bağışıklık sistemi baskılanmış sinapsları analiz etmek mümkün değildir.
   2. Elde edilen görüntüleri tek tek .tiff dosyaları olarak dışa aktarın. Belirtilen şekilde alınmamışsa, makroları çalıştırmadan önce kanal sırasını ters çevirin.

2. Yazılım Gereksinimleri ve Kurulumu

1. Makroları indirin: "Drosophila NMJ Morphometrics" ve "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" aşağıdaki web sitesinden: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. İmleci "Makrolar 1 güncellemesi" klasörüne taşıyın ve görünen "görünüm" seçeneğine tıklayın. Bu klasörün içeriğini içeren bir liste görüntülenir. Klasörde"Drosophila NMJ Morphometrics" ve"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makroları bulunmaktadır.
   NOT: Her iki makro da aynı klasörde sağlanan Fiji sürüm 1.4 ile uyumludur. Makrolar son sürümlerde çalışmayabilir. Lütfen sağlanan 1.4 sürümünü kullanın. Daha yeni bir Fiji sürümüne sahip bilgisayarlarda bile bu sürümü başlatmak sorunsuzdur.
3. "Tümlerini indir" e tıklayın. Klasör içeriği bilgisayara .zip dosyası olarak indirilecek. İndirilen dosyanın fermini açın.
4. Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm ve Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm dosyalarını Fiji.app/plugins/ dizinine kopyalayın. Programı yeniden başlatırken, makrolar Eklentiler açılır menüsünün altında görünecektir.

3. NMJ Görüntülerinin Z projeksiyonlarını ve Hiperstack'lerini Oluşturmak için "Yığına Dönüştür" alt makrosunu çalıştırın

1. Araç çubuğunda Eklentiler'i seçerek grafik arayüzünü başlatın ve açılır menüden"Drosophila NMJ Morphometrics"i seçin.
2. Makronun grafik arabiriminde "Benzersiz Dosya Dizesi" ayarını tanımlayın.
   NOT: Mikroskop yazılımı, yığınları tek tek '.tiff dosyaları olarak depolarken düzlemleri ve kanalları düzenlemek için bir tanımlama imzası kullanır. Girilen benzersiz dosya dizesi ayarının, yazılım tarafından ilk kanalın ilk düzlemine atanan imzayı belirtmesi gerekir (önemli: en düşük düzlem ve kanal numarasının belirtilmesi gerekir).
3. Yalnızca "Yığına dönüştür" alt makrosunu seçin ve "Tamam" ı tıklatın ve görüntülerin bulunduğu klasörü seçin. Birkaç alt klasörü olan bir ana dizin seçilirse, ana dizin ve alt klasör içindeki benzersiz dosya dizesi ölçütleriyle eşleşen tüm tek tek '.tiff dosyaları işlenir.
   1. z yığını yalnızca bir kanal içeriyorsa, "Yalnızca Kanal 1" kutusunu seçin.
4. NMJ görüntüsü başına varsayılan olarak stack_image_name ve flatstack_image_name olarak adlandırılan iki yeni dosyanın görüneceğine dikkat edin. Daha fazla analiz için yalnızca bu yığını ve flatstack'i saklayın. .tiff dosya serisi bu noktada silinebilir, gerekli depolama kapasiteleri en aza indirilebilir ve olası hata kaynaklarından kaçınılabilir.

4. NMJ İlgi Terminali'ni tanımlamak için "Yatırım Getirisi Tanımla" alt makrosunu çalıştırın

1. "Drosophila NMJ Morphometrics" grafik arayüzünü başlatın.
2. Yalnızca "Yatırım Getirisini Tanımla" onay kutusunu seçin ve "Tamam" tuşuna basın ve flatstack_name başlıklı görüntülerin depolandığı ana dizini seçin ve "Seç" tuşuna basın. "Yatırım Getirisini Tanımla" alt makrosu, seçili ana dizin içindeki tüm alt klasörlerde otomatik olarak arama yapar.
3. İlk projeksiyon açılırken, araç çubuğundaki "Serbest seçimler" aracını seçin.
4. Fareyi kullanarak, yalnızca ilgi çekici tam NMJ terminalini içeren bir seçim çizin ve "Terminali tanımla" penceresinde "Tamam" ı tıklayın. Makro bir sonraki projeksiyonla devam eder.
5. Sonraki yatırım getirisini tanımlayın ve tüm yatırım getirileri tanımlanana kadar yineleyin. "roi_image_name" adlı yatırım getirisi görüntü dosyası, işlenen görüntülerin her biri için daha önce oluşturulan yığın ve projeksiyon görüntüleriyle aynı dizinde depolanacaktır. Bu alt makronun çıktısı, siyah bir arka plan üzerinde beyaz renkte yatırım getirisinin ikili bir görüntüsüdür.

5. NMJ Terminal Özelliklerini Ölçmek için Alt Makro "Analiz" çalıştırın

1. Araç çubuğuna gidin, "Eklentiler"i seçin ve şunları kullanın:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics", anti-Dlg-1 veya anti-Hrp (kanal 1) ile birlikte anti-Brp (kanal 2) veya"Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" ile immün etiketlenmiş sinapsları analiz ederken anti-Syt veya anti-Csp (kanal 1) ile birlikte Brp (kanal 2).
   1. Bir kanal görüntü yığınları analiz edilecekse ("Drosophila_ NMJ_Morphometrics"için yapısal kanal Dlg-1 veya HRP veya "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics" için Syt veya Csp), "Yalnızca Kanal 1" kutusunu seçin.
2. Analiz edilecek görüntülere karşılık gelen ölçeği ayarlayın.
   1. Görüntüdeki bir piksel 2,5 μm'ye karşılık geliyorsa, Ölçek Pikselleri = 1, Ölçek Mesafesi'ni μm = 2,5 olarak belirtin. Her iki ayarın da 0'da kalması durumunda, NMJ alanı, çevresi, uzunluğu ve en uzun dal uzunluğu piksel sayısıyla ifade edilir.
3. Gerekirse, makronun varsayılan çözümleme ayarlarını yapın. Ayarlamaları yalnızca alt makro "Çözümle" daha önce tatmin edici olmayan sonuçlarla çalıştırıldıysa gerçekleştirin (ayarların nasıl en iyi duruma getirileceğini öğrenmek için bu bölümün sonuna ve bölüm 6'ya bakın).
4. "Çözümle" ve "Bekle" onay kutularını seçin ve "Tamam" tuşuna basın.
   1. 2 kanallı görüntülerde "Çözümle" alt makrosunu çalıştırırken "Bekle" onay kutusunu seçin. Aksi takdirde, sınırlı bilgisayar kapasiteleri nedeniyle etkin bölge sayımında hatalar oluşabilir.
5. "Dizin Seç" yeni bir pencere açılırken, görüntülerin bulunduğu dizini seçin ve "seç" tuşuna basın. Makro, ana dizinde depolanan tüm görüntüleri ve varsa sonraki klasörleri analiz eder (önceki alt makroları yürütmekten üç dosyayı kullanarak: stack_image_name, flatstack_image_name ve roi_image_name). Makro her görüntüyü ayrı ayrı ve ardışık olarak işler. Bu, görüntü yığını başına birkaç dakika sürebilir (bilgisayar kapasitesine bağlı olarak).
6. Makroyu çalıştırdıktan sonra, depolanan her çözümlenmiş sinaps için res_image_name adlı yeni bir görüntü dosyasının ebeveyn klasöründe oluşturulacağını unutmayın. Nicel ölçümler "sonuç.txt" dosyası olarak saklanacaktır.
7. Segmentasyon hataları olan resimleri algılamak ve hariç tutmak için tüm sonuç görüntülerini inceleyin. Olası segmentasyon hataları Tablo 1'de açıklanmıştır , bu hataları atlatmak için ayarların nasıl ayarlanılacağına dair tavsiyelerle birlikte. Bu tür segmentasyon hatalarına sahip sonuç görüntüleri Şekil 1 'de örnek olarak verilmiştir.
   NOT: Makroyu kullanıcı arabiriminde gözlenen varsayılan ayarlarla çalıştırırken, makro değerlendirmesi el ile değerlendirmeyle karşılaştırıldığında yaklaşık%95 doğruluk vardı.

6. Makro Ayarlarını Görüntülere Göre Ayarlama

1. Görüntülerin %5'inden fazlası segmentasyon hataları gösterdiğinde, görüntüler için en uygun makro ayarlarını tanımlamak/seçmek için farklı algoritmaları keşfedin.
2. Yuvarlanan top yarıçap değerini ayarlama
   NOT: Yuvarlanan top yarıçapı işlevi görüntünün arka planını çıkarır. Floresan mikroskoplarda elde edilen görüntülerle çalışırken ve/veya görüntüler yüksek arka plan gürültüsüne sahip olduğunda bu işlev çok önemlidir. Arka planın çıkarılması, makronun NMJ terminallerinin yeterli segmentasyonunu üretmek için otomatik eşik oluşturma adımlarına yardımcı olacaktır.
   1. "Yığına dönüştür" alt makrosu tarafından oluşturulan üç NMJ stack_image_name görüntüsü seçin. Görüntü veri kümesi için temsili görüntüleri seçin.
   2. Araç çubuğunda Resim | Renk | Kanalları bölün. Biri kanal 1'i, diğeri kanal 2'yi temsil eden iki görüntü yığını oluşturulur ve bunları kaydeder.
   3. Kanal 1'e ait görüntü yığınını Dlg-1, Hrp, Syt veya Csp immünolabeling'e karşılık gelen açık olarak açın.
   4. Araç çubuğunda "İşlem" ve ardından "Arka Planı Çıkar..." seçeneğini belirleyerek "Arka planı çıkar" filtresini çalıştırın. açılır menüde buyur.
   5. Açılır penceredeki önizleme onay kutusunu tıklatın ve yuvarlanan top yarıçapını görüntüler için en uygun değere ayarlayın. "Yuvarlanan top yarıçapı" ayarı, sinaps ve arka plan arasındaki kontrastı artıran değerlere ayarlanmalıdır (bkz. Şekil 2A').
      1. Örnek olarak Şekil 2'ye bakın. Panel A'da, sinapsın parçaları arka planla aynı gri düzeyleri gösterirken, Şekil 2 panel A'da 500'lük bir "Yuvarlanan top yarıçapı" sinaps ile arka plan arasında güçlü bir kontrastla sonuçlanır.
   6. Resim | araç çubuğunu seçerek z-projeksiyonu oluşturma Yığın mı| Z-projeksiyon, Projeksiyon türü = Maksimum Yoğunluk'u seçin ve elde eden görüntüyü kaydedin. Yuvarlanan top yarıçapı için uygun değer tanımlandığında, aynı yuvarlanan top yarıçapı değerine sahip kalan temsili görüntülerde "Arka planı çıkar" algoritmasını çalıştırın. Z projeksiyonlarını oluşturun ve kaydedin (herhangi bir dizine).
      NOT: 8 bit veya RGB görüntüler için yuvarlanan top yarıçapı değeri, en azından arka planın parçası olmayan görüntüdeki en büyük nesnenin yarıçapı kadar büyük olmalıdır. 16 bit ve 32 bit görüntüler için yarıçap piksel değer aralığıyla ters orantılı olmalıdır.
3. Kullanılacak farklı otomatik eşikleri belirleme
   1. Önceki adımda kaydedilen Z projeksiyonlarını açın (6.2.6) ve Görüntü Seç | | ayarlama Otomatik Koruma | Hepsini dene.
   2. İkili eşikli sonuç görüntüsü tüm farklı otomatik eşik algoritmalarıyla görüneceği için, görüntüler için en uygun algoritmayı belirleyin.
      1. Makroyu daha sonra çalıştırırken, makro ayarlarında eşiği buna göre değiştirin.
      2. NMJ anahat eşiği olarak "RenyiEntrophy" veya "Anlar" gibi daha kısıtlayıcı eşikleri ve NMJ iskeletini belirlemek için "Li" ve aktif bölgeleri belirlemek için "Huang" gibi daha izin verilen eşikleri kullanın. Görüntüler çok az veya hiç arka plan olmadan çok keskin olduğunda, "Huang" ı NMJ anahat eşiği olarak kullanın. Aksi takdirde, görüntü segmentasyonundan sonra sinaps parçaları eksik olabilir.
      3. Örnek olarak Şekil 2B'ye bakın. Sinapsların uygun segmentasyonu, yeşil kutularla vurgulanan otomatik eşiklerle elde edilir. Uygun olmayan eşiklerin bazı örnekleri kırmızı kutularla vurgulanır (yüksek büyütmedeki sinapsları kontrol edin). İkincisinde, sinapsın parçaları eksik veya arka planın bazı bölümleri dahil edilir.
4. Küçük parçacıkların maksimum boyutunu belirleme
   NOT: Bu işlev, NMJ anahat eşiği ve İskelet eşiği tarafından algılanan ve "küçük parçacıklar ayarında" tanımlanan değerden daha küçük olan tüm parçacıkları analizden hariç tutar. Bu değer piksel cinsinden tanımlanır. Bu işlev bir gürültü filtresi görevi görür ve elde edilen görüntülerde yüksek düzgün olmayan arka plan (kristaller / toz gibi) olduğunda çok yararlıdır.
   1. 6.2.6 adımında kaydedilen Z projeksiyonlarını açın. ve Analiz | aracılığıyla piksel sayısını algılamak için ölçeği ayarlayın Ölçek'i ayarlayın. Aşağıdaki ayarları uygulayın: piksel cinsinden mesafe = 1, bilinen mesafe = 1, piksel en boy oranı = 1, Uzunluk birimi = piksel ve "Tamam" tuşuna basın. Araç çubuğundaki "Oval seçim" aracına tıklayın.
   2. Fareyi kullanarak, immünostaining'de bulunan ancak NMJ'ye ait olmayan tek parçacıkları yakından çevreleyen bir seçim çizin. Windows kullanıcısı için Ctrl+m veya Mac kullanıcıları için cmd+m tuşlarına basın. Piksel sayısı olarak seçilen parçacıkların alanını gösteren bir sonuç penceresi açılır.
   3. En büyük kirletici parçacık / yapı alanını belirlemek için görüntülerde bulunan birkaç eserle önceki adımı birkaç kez tekrarlayın. Bu, makroyu daha sonra çalıştırırken ayarda ayarlanacak değer olacaktır. Makroyu çalıştırırken en küçük parçacık boyutu olarak "Küçük Parçacıklar Boyutu"nun irin%25'lik bir marjı gözlemlediğini ayarlayın.
   4. Örnek olarak Şekil 2D'ye bakın. Tespit edilen en büyük kristal 112 piksellik bir alana sahiptir. Bu görüntüyü makroyla işlerken "Küçük parçacık boyutu" ayarı 125 - 150 olarak ayarlanmalıdır.
5. Minimum bouton boyutunu belirle
   NOT: Bu işlev, NMJ anahat eşiği tarafından algılanan ve tanımlanan değerden daha küçük olan tüm boutonları analizden dışlar. Bu değer piksel cinsinden tanımlanır.
   1. Bölüm 6.4'te açıklanan adımları izleyin, ancak bu durumda NMJ terminalinde bulunan en küçük boutonları çevreleyen bir seçim çizin. Ölçülenlerin en küçük bouton'una karşılık gelen en küçük alanı seçin. Bu, makroyu daha sonra çalıştırırken en düşük bouton boyutu ayarında ayarlanan değerdir.
6. "Maxima gürültü toleransı" değerini tanımla
   1. Makronun "Maksimum gürültü toleransını bul" değerini tanımlamak için, bölüm 6.2.2'de kaydedilen kanal 2 Z yığınını açın.
   2. Açılır menüdeki eklentiler sekmesine gidin, İşlem | Maksimum(3D) ve maximum_image_name göründüğünde (birkaç dakika sürebilir), orijinal görüntü yığınını kapatın.
   3. Maximum..._image_name (yeni elde edilen görüntü yığını) seçin ve Eklentiler | İşlem | Minimum (3D), yeni görüntü En az Maximum..._image_name apears Maksimum... _image_name yığınını kapattığında.
   4. Araç çubuğunda İşlem | Maxima'yı bulun.... Yeni bir pencere "Maxima'yı bul..." açılacaktır. "Önizleme noktası seçimi..." onay kutusunu tıklatın. ve "Gürültü toleransı" kutusunu varsayılan makro ayarı 50 ile doldurun. Maxima noktaları görüntüde küçük haçlar olarak gösterilir.
      1. Açıklamalı etkin bölgelerin fazlalığını, yani seçili yığın düzlemine odaklanmayan etkin bölgelerin üstünde olmayan haçları veya arka planda algılanan yanlış etkin bölgeleri gözlemliyorsanız "Gürültü toleransı" değerini artırın.
         1. Öte yandan, eksik açıklamalı aktif bölgelerin, yani odaktaki etkin bölgelerin tanınmaması gözlenirse, "Maxima gürültü toleransı" değerini azaltır. Çaprazlar odaktaki etkin bölgeleri uygun şekilde etiketleyene kadar bu yordamı izleyerek farklı değerler denemeye devam edin. "Maxima gürültü toleransını bul" değerini bu değerle doldurun.
         2. Örnek olarak Şekil 2C'ye bakın. Çok fazla etkin bölge algılandı. Şekil 2C'de "Maxima gürültü toleransı" değeri artırıldığında yalnızca odaktaki etkin bölgeler algılanır.
   5. 5.1 adımında seçilen temsili görüntüler için makronun alt makrosu "Çözümle"yi, önceki tüm adımlarda tanımlanan ayarlarla çalıştırın.
7. Brp-puncta alt ve üst eşiğini ayarlama
   1. Makroyu 2_active_zone_stack_image_name adı verilen 6.6 adımına göre çalıştırdıktan sonra yeni bir dosyanın görüneceğine dikkat edin. Bu görüntü yığınında "Maxima'yı Bul" işlevi tarafından algılanan etkin bölgeler her düzlemde beyaz noktalarla gösterilir.
   2. Bu dosyayı araç çubuğuna sürükleyip bırakarak açın ve Resim | Yığın | Z-proje | Projeksiyon türü = Toplam dilimleri. 2_active_zone_stack_image_name projeksiyonu elde edilecektir.
   3. Görüntü | Seç | ayarlama Eşik. Yeni bir pencere "Eşik" açılacaktır. İstenen tüm odak/Brp pozitif noktaların kırmızı ile görselleştirildiği bir eşik değeri seçmek için üst çubuğu kaydırın.
      NOT: Eşik çok düşük ayarlanırsa, fazla miktarda etkin bölge sayılır. Çok yüksek ayarlanırsa, etkin bölgelerin bir kısmı kaçırılacaktır.
      1. Bir örnek için Şekil 2E'ye bakın. Eşik 400 olarak ayarlandığında, etkin bölgelerin çoğu (1 piksel odak olarak sembolize edilir) segmentasyona dahil değildir, çünkü kırmızı ile vurgulanmazlar (Şekil 2E). Eşik 50 değerine ayarlandığında tüm etkin bölgeler kırmızıyla vurgulanır (Şekil 2E').
   4. Bu değeri minimum eşik olarak tanımlayın. Maksimum değerde "Üst nokta eşiği" bırakın.
   5. Bu bölümün önceki tüm adımlarında tanımlanan ayarlarla temsili görüntüler için "Çözümle" alt makrosunu yeniden çalıştırın. Elde eden görüntü dosyalarını eleştirel olarak değerlendirin ve segmentasyonun düzgün yapıldığından emin olun. Durum böyle değilse, segmentasyon hatalarının niteliğine göre ayarları yeniden ayarlayın (Şekil 1, Tablo 1).

Representative Results

Şekil 1: Uygunsuz Makro Segmentasyon Sonuçları Örnekleri. "Drosophila NMJ Morphometrics" veya"Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" çalıştırarak sonuç görüntüleri. Sinaptik terminalin parçaları sarı anahatta (A) yer almaz. Arka planın bazı bölümleri sinaptik terminale sarı anahat (B) ile dahil edilir. Mavi iskelet çizgisi sinaptik terminalin(C - D)ötesine uzanır. Çok fazla aktif bölge algılanır (E - E'). Bazı Aktif bölgeler analiz ( G- G') tarafından tespit edilmeden kalır. Etkin bölgeler sinaps (F)dışında algılanır. Yanlış bouton segmentasyonu (Yalnızca Drosophila NMJ Bouton Morphometrics çalıştırıldığında uygulanabilir), boutonlar kaçırılıyor (H) veya segmentasyon tarafından çok fazla bouton tespit ediliyor (I). Arka planın bir parçası olan kristaller veya toz gibi parçacıklar segmentasyona (J) dahil edilir. Bu hataları önlemek için ayarların nasıl değiştirılacağı hakkında bilgi Tablo 1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Makro Ayar Ayarlamaları ve Görüntü Segmentasyonu için Sonuçları örnekleri. (A) "Yuvarlanan top yarıçapı" 20(A ) veya 500 (A'olarak ayarlandığında, ApoTome ile floresan mikroskopta görüntülenen Dlg-1 immün etiketli sinapsın arka plan önizlemesini çıkarın. (B) Görüntü | çalıştırıldıktan sonra elde edilen çıktı görüntüleri | ayarlama Otomatik Eşik | Tüm görüntüyü deneyin, 16 farklı otomatik eşik algoritması tarafından elde edilen görüntü segmentasyonlarını gösterir. (C) 50 ( C ) ve 500 (C'de "Gürültü toleransı" ayarlarken "Maxima'yı Bul"önizlemesi); Segmentasyon tarafından algılanan etkin bölgeler küçük bir haçla etiketlenir. (D) Konfokal mikroskopta görüntülenen anti-Hrp ile bağışıklık etiketlenmiş bir sinaps görüntüsünün görüntü arka planında görünen "küçük parçacıkların" ölçümü. (E) 2_active_zone_stack_ima-ge_name elde edilen "Toplam dilimler" projeksiyonu. Eşik 400 (E) ve 50 (E ') olarak ayarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Segmentasyon	Gözlemlenen hatalar	Örnek	Gerekli ayarlamalar
NMJ Alanı ve çevresi (Sonuç görüntüsünde sarı anahatla temsil edilir)	Sinaptik terminalin parçaları dahil değildir sarı anahatta veya arka planın bazı bölümlerinde sarı ile özetlenen sinaptik terminale dahil edilir.	Şekil 2A-B	'Yuvarlanan Top Yarıçapı' değerini ayarlayın. Bkz. bölüm 6.1.	'NMJ anahat eşiğini' ayarlayın. Bkz. bölüm 6.2.
NMJ uzunluğu ile ilgili parametreler (Sonuç görüntüsünde mavi iskelet çizgisiyle temsil edilir)	Mavi iskelet çizgisi ya ötesine uzanır ya da tüm sinaptik terminal boyunca mevcut değildir.	Şekil 2C-D	'Yuvarlanan Top Yarıçapı' değerini ayarlayın. Bkz. bölüm 6.1.	'NMJ anahat eşiğini' ayarlayın. Bkz. bölüm 6.2.
Brp pozitif nokta (Sonuç görüntüsündeki noktalarla temsil edilir)	Çok fazla etkin bölge algılandı.	Şekil 2E-E'	"Maksimum gürültü toleransını bul" değerini azaltın. Bkz. bölüm 6.5.
Brp pozitif nokta (Sonuç görüntüsündeki noktalarla temsil edilir)	Etkin bölgeler analiz tarafından kaçırılıyor.	Şekil 2G-G'	'Maksimum gürültü toleransını bul' değerini artırın. Bkz. bölüm 6.5.	'Brp-puncta alt eşiğini' azaltın. Bkz. bölüm 6.6.
Brp pozitif nokta (Sonuç görüntüsündeki noktalarla temsil edilir)	Etkin bölge yapıtları algılandı sinaptik terminalin dışında.	Şekil 2F	'Etkin Bölge eşiği' bölüm 6.2'ye ayarlayın.	'Brp-puncta alt eşiğini' artırın. Bkz. bölüm 6.6.
Küçük parçacıklar	Parça olan kristaller veya toz gibi parçacıklar arka planın segmentasyon.	Şekil 2J	'Küçük parçacıkları kaldır' kutusunu seçin. Bkz. bölüm 6.3.	Küçük parçacıkların maksimum boyutunu belirleyin. Bkz. bölüm 6.3.
Bouton segmentasyonu	Yanlış bouton segmentasyonu (Sadece Drosophila NMJ Bouton Morphometrics için geçerlidir; Bouton segmentasyonu için Drosophila NMJ Morphometrics kullanmayın).	Şekil 2H-I	'NMJ anahat eşiğini' ayarlayın. Bkz. bölüm 6.1.	'Minimum bouton boyutunu' belirleyin. Bkz. bölüm 6.4.

Tablo 1: Makrolar Tarafından Üretilebilen Görüntü Segmentasyonundaki Farklı Hata Türleri için Sorun Giderme Kılavuzu. Bu tabloda, makrolar tarafından üretilen farklı türde görüntü segmentasyon hataları açıklanmaktadır. Bunlar sonuç görüntülerinde kolayca tespit edilebilir. Her hata türünün örnekleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Tablonun "ayarlamalar bölümünde" ayarlanması gereken ayarlar vurgulanır ve kullanıcı, bu ayarların nasıl ayarlanacağını açıklayan bölüm 6'nın kritik alt adımına başvurulur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI