Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Verbindung (NMJ): Eine Methode zur Beurteilung der synaptischen Morphologie und Funktion

- Zuerst Immunfärbung von Drosophila-Larven mit Markern, die verschiedene Aspekte von NMJs oder neuromuskulären Verbindungen hervorheben. Dies ist die Region, in der das Ende eines Motoneuron-Axons mit einem Muskel in Kontakt kommt, und seine Morphologie wird als Messwert für die synaptische Funktion verwendet.

Das Axon endet in mehreren Ästen, die Ausbuchtungen bilden, die als Boutons bezeichnet werden. Neurotransmitter werden aus den Boutons freigesetzt und bewirken eine Muskelkontraktion. Bereiche, in denen Neurotransmitter freigesetzt werden, werden als aktive Zonen bezeichnet. Hier ist ein Marker spezifisch für ein synaptisches Protein, das das NMJ umreißt, und der andere Marker ist für ein Protein, das in aktiven Zonen vorhanden ist.

Nehmen Sie als Nächstes NMJ-Bilder mit Hilfe der Mikroskopie auf und beurteilen Sie deren Morphologie quantitativ mit einer halbautomatischen Bildanalysesoftware. Wenden Sie eine voreingestellte Reihe von Softwarebefehlen auf die Bilder an. Die Ausgabedateien enthalten analysierte NMJ-Bilder und Morphologieergebnisse. Zu den Features, die gemessen werden können, gehören die Anzahl und Oberfläche der Boutons, die NMJ-Länge und die Anzahl der Verzweigungen, die Anzahl der nicht verbundenen NMJ-Kompartimente und die Anzahl der aktiven Zonen.

Im folgenden Beispiel analysieren wir die Morphologie von Drosophila-NMJs, die mit DLG1, einem postsynaptischen Marker, und BRP, einem aktiven Zonenmarker, gefärbt wurden.

- Generieren Sie für dieses Protokoll Bildstapel von NMJs und speichern Sie sie als einzelne TIFF-Dateien, wobei Kanal 1 die DLG1-Färbung oder einen ähnlichen Marker und Kanal 2 die BRP-Färbung zeigt. Erstellen Sie zunächst Z-Projektionen und Hyperstacks der NMJ-Bilddateien. Öffnen Sie die Plugin-Optionen und wählen Sie Drosophila NMJ morphometrics.

Identifizieren Sie nun die eindeutige Dateizeichenfolge, die das Mikroskop den Bildserien zugewiesen hat, wenn sie als TIFF gespeichert werden. Dies befindet sich am Ende des Bildnamens. Kopieren Sie die Zeichenfolge, die der untersten Ebene und der Kanalnummer zugewiesen wurde, und fügen Sie sie in das eindeutige Fenster zur Einstellung der Dateizeichenfolge ein. Wählen Sie dann das Untermakro "In Stapel konvertieren" und wählen Sie das Verzeichnis oder den Ordner aus, in dem sich die Bilder befinden.

Für jede Image-Datei werden zwei neue Dateien mit den Standardnamen Stack und Flat Stack erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Image-Namen. Die Originaldateien können dann gelöscht werden, um Speicherplatz zu sparen. Wählen Sie als Nächstes in der Morphometrie-Schnittstelle von Drosophila NMJ das definierte ROI-Untermakro aus und wählen Sie das Bilddateiverzeichnis aus.

Wenn die erste Projektion geöffnet wird, wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug aus und definieren Sie dann mit der Maus einen Bereich, der ein vollständiges NMJ-Terminal von Interesse enthält. Klicken Sie nach der Auswahl im definierten Terminalfenster auf OK. Fahren Sie damit fort, bis die NMJ-Anschlusspunkte in allen Projektionen definiert sind. Das Makro führt den Prozess automatisch fort. Für jede Bilddatei wird eine neue Datei mit den Standardnamen ROI erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Bildnamen.

Um die NMJ-Merkmale zu quantifizieren, gehen Sie zunächst zur morphometrischen Schnittstelle Drosophila NMJ und stellen Sie die Skala ein. Wenn ein Pixel des Bildes z. B. 0,72 Mikrometer entspricht, legen Sie die Skalierungspixel auf 1 und den Skalierungsabstand auf 0,072 fest. Wählen Sie dann das Untermakro Analysieren aus, und wenn zwei Kanalbilder vorhanden sind, schalten Sie auch Warten um. Drücken Sie OK und wählen Sie bei Aufforderung das Bilddateiverzeichnis aus. Die Verarbeitungszeit kann mehrere Minuten pro Synapse betragen.

Nach der Analyse werden neue Bilddateien für jede analysierte Synapse im übergeordneten Ordner gespeichert, und die quantitativen Messungen befinden sich in der results.txt Datei. Überprüfen Sie alle Bilder und schließen Sie Bilder mit Segmentierungsfehlern aus.

Zum Beispiel könnten Teile des synaptischen Terminals nicht in der gelben Umrandung enthalten sein. Teile des Hintergrunds können im synaptischen Terminal enthalten sein. Eine blaue Skelettlinie kann sich über das synaptische Terminal hinaus erstrecken. Möglicherweise gibt es zu viele aktive Zonen, oder einige aktive Zonen bleiben unerkannt.