Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden Monozyten In vivo Über Stunden, Tage oder Wochen mit der transkraniellen Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie zu einem ausgedünnten-Schädel-Fenster, dass eine intermittierende Beobachtung der ruhenden Mikrogliazellen, die durch benachbarte stereotaktische Injektion der HIV-1 regulatorischen Proteins Tat aktiviert werden können, ermöglicht vorzubereiten.

Zusammenfassung

Traditionell in den Neurowissenschaften, in vivo Zwei-Photonen-Imaging des murinen zentrale Nervensystem hat entweder den Einsatz von Open-Schädel ^1,2 oder ausgedünnte Schädel ³ Vorbereitungen beteiligt. Während die Open-Schädel-Technik ist sehr vielseitig, es ist nicht für das Studium Mikroglia optimal, weil sie invasiv ist und Mikroglia-Aktivierung verursachen. Auch wenn die ausgedünnten Schädel Ansatz ist minimal-invasiv, das wiederholte erneut Ausdünnung des Schädels für chronische Bildgebung erforderlich erhöht das Risiko von Gewebeschäden und Mikroglia-Aktivierung und ermöglicht eine begrenzte Anzahl von Imaging-Sitzungen. Hier präsentieren wir eine chronische Dünn-Schädel-Fenster-Methode für die Überwachung murine Mikroglia in vivo über einen längeren Zeitraum hinweg mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Wir zeigen, wie man eine stabile, leicht zugängliche, ausgedünnte Schädel kortikale Fenster (TSCW) mit einem apposed Deckglas, dass transluzente im Laufe der drei Wochen intermittierende Beobachtung bleibt vorzubereiten. Diese TSCW Vorbereitung ist weit mehr immunologisch inert gegenüber Mikroglia-Aktivierung als offene Kraniotomie oder wiederholte Schädel Durchforstung und ermöglicht eine beliebige Anzahl von Imaging-Sitzungen während eines Zeitraums von Wochen. Wir bereiten TSCW in CX ₃ CR ₁ GFP / + Mäusen ⁴ bis Mikroglia mit Enhanced Green Fluorescent Protein auf ≤ 150 mu m unterhalb der Pia Oberfläche sichtbar zu machen. Wir zeigen auch, dass dieses Präparat in Verbindung mit stereotaktischen Hirn-Injektionen des HIV-1 neurotoxischen Protein Tat, neben dem TSCW, die zu induzieren vermag haltbare microgliosis ist, kann verwendet werden. Daher ist diese Methode sehr nützlich für die Prüfung Änderungen in Mikroglia-Morphologie und Motilität im Laufe der Zeit im lebenden Gehirn in Modelle der HIV-assoziierten neurokognitiven Disorder (HAND) und andere neurodegenerative Erkrankungen mit einem neuroinflammatorische Komponente.

Protokoll

1. Vorbereitung der Tiere für Imaging

1. In unseren Experimenten verwenden wir Erwachsenen CX ₃ CR ₁ GFP / + Mäusen, die ausdrückliche GFP in mononukleären Zelllinien, darunter Mikroglia. ⁴ verschiedene Stämme von Mäusen verwendet, um die Bedürfnisse eines spezifischen Projekts zugeschnitten werden können.
2. Anesthetize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von drei Medikamenten-Cocktail, bestehend aus 0,05 mg / kg Fentanyl, 5,0 mg / kg Midazolam und 0,5 mg / kg Medetomidin. ⁵ Chirurgische Vorbereitung TSCW beginnt, nachdem das Tier reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie wie ein Schwanz kneifen. Während der Operation und Bildgebung, halten wir das Tier auf einem Heizkissen auf post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. Falls notwendig, eine Auffrischimpfung mit einem Drittel der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums Cocktail gegeben, um die ursprüngliche Betäubung Flugzeug wiederherzustellen.
3. Deckel die Augen des Tieres mit einem schützenden Augensalbe zu halten die Augen feucht während der Narkose unterdrückt, die das Tier Blinkreflex. Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut des Tieres mit einer Rasierklinge, Schere, Schere, oder chemische Methoden. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10% PVP-Jod-Lösung und 70% Ethanol. Alle chirurgischen Instrumente müssen autoklaviert, sterilisiert werden mit einem Glas-Bead-Sterilisator oder desinfiziert mit 70% Ethanol.
4. Machen Sie eine Mittellinienschnitt der Kopfhaut mit einer kleinen Schere, beginnend 4-5 mm kaudal der Schädelbasis und Weiterentwicklung uns auf die vor den Augen. Es ist wichtig, dass dieser Einschnitt lange genug, dass die Haut nicht mit dem Kleben der Kopfplatte, die verwendet werden, um die Maus den Kopf zu stabilisieren, ist bei der Zwei-Photonen-Imaging (Abbildung 1) stören. Identifizieren Sie die Fläche unter einem Binokular verdünnt werden. Vermeiden Sie Bereiche von Interesse direkt über Schädelnähte befinden, wie der Schädel ist weniger stabil in diesen Bereichen und die zugrunde liegenden großen Gefäße und Meningen wird mit bildgebenden stören.
5. Wenden Sie 100% Ethanol um 10% Eisenchloridlösung mit einem sterilen Wattestäbchen, um die Membranen auf der Oberseite des Schädels trocken und kratzen sie weg mit feinen Pinzette oder einer Rasierklinge an. Die Nichtbeachtung der Membranen führt zu instabilen Kopfplatte Anlage zu entfernen.
6. Legen Sie eine dünne Schicht des Permabond 910 Leim an den Kanten des Sichtfensters unterhalb der Kopfplatte. Legen Sie die Kopfplatte mit Kleber über den Bereich der Zinsen auf das Tier den Schädel mit leichtem Druck (Abbildung 1) beschichtet. Es ist wichtig, dass die Kopfplatte ist nur bis auf die Knochen des Schädels aufgeklebt. Jede Haut oder Membranen, die zwischen der Kopfplatte und der Schädel gefangen verringert die Stabilität der Bindung. Eine kleine Menge von Acrylat um das Sichtfenster mit einer Spritze sofort Bindung der Kleber. Schließlich eine kleine Menge von Loctite 454 auf die Ränder des Sichtfensters, um Leckagen zu verhindern.
7. Schrauben Sie die Kopfplatte der Tierhalter (Abbildung 1) und überprüfen Sie die Stabilität der Kopfplatte unter einer Dissektion Umfang durch leichtes Sondieren mit einer Pinzette. Es sollte keine Bewegung des Schädels in Bezug auf die Kopfplatte werden. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf das Sichtfenster, um sicherzustellen, dass keine Leckagen.

2. Vorbereiten des Verdünnt Schädel Kortikalisfenster

1. In Vorbereitung auf die Ausdünnung des Schädels, trockenen Schädel mit einer Kombination aus sterile Wattestäbchen und Druckluft. Wir haben uns zunächst dünn den Schädel mit einer sterilen IRF 007 Bohrer in einem MicroTorque II Bohrmaschine bei 4000 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Sehr sanft, beginnen Ausdünnen einer 2-2,5 mm Durchmesser Kreisfläche des Schädels. Verwenden Sie nur leichten geschwungenen Bewegungen nahezu parallel zu den Schädel, die Nutzung keinen direkten Druck. Stoppen Bohren alle 20-30 Sekunden, um Knochen Staub mit der Druckluft. Diese Brüche in Bohrungen ermöglichen den Schädel zu kühlen, so gibt es keine Hitze-induzierte Schäden an den darunter liegenden Hirngewebes.
   1. Da die Bohrungen fortschreitet, bemerken den Übergang zu den feuchteren Spongiosa Schicht (dh die "Diploe"). Sobald diese Schicht erreicht ist, die Ausübung besonderer Vorsicht mit dem Bohrer.
2. Überprüfen Sie gelegentlich die Schlankheit des Schädels, indem über die ausgedünnt Bereich Kochsalzlösung und Betrachten unter dem Binokular. Saline wird weiter ermöglichen Wärmeableitung. Da der Schädel ist ausgedünnt, wird kleiner Gefäße sichtbar.
3. Verwenden Sie eine sterile zahnärztliche MicroBlade zur endgültigen Verdünnung unter Kochsalzlösung zu erreichen, wie die MicroBlade bietet viel mehr taktile Rückmeldung über die Stabilität des Schädels. Dies ermöglicht eine sehr viel dünner als die Vorbereitungen mit dem Bohrer allein. Aus unserer Erfahrung ist die optimale Schädel Dicke 10-30 um.
   1. Es ist wichtig, um die Schlankheit des Schädels unter Epifluoreszenz mehrfach überprüfen während der ersten Versuche, einen dünnen Schädel-Fenster. Die Schärfe und Tiefe sichtbar Mikroglia und Gefäßsystem geben einen guten Hinweis darauf, wenn das Fenster bereit für die Bildgebung ist.
4. Sobald das Fenster fertig ist, kleben Sie ein maßgeschneidertes rechteckiges Stück # 0 Deckglas wi th eine Dimension von weniger als 2 mm auf jeder Seite über dem Fenster. Mit einem Durchmesser von 1,0 mm Glaspipette, platzieren Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf dem Schädel gelichtet Bereich und vorsichtig weiter unten das kleine Stück Deckglas, dann drücken Sie vorsichtig gegen den Schädel zu verdrängen überschüssige Menge der Leim. Es ist wichtig, um eine Blasenbildung zwischen dem Glas und den Kleber zu vermeiden, da eingeschlossene Luft den Bereich führen wird unter an sich optisch undurchsichtig. Der Sekundenkleber wird verwendet, weil es transparent bleibt, wenn sie trocken und verhindert auch, dass Knochen und Membran Nachwachsen halten den Schädel unter dem Fenster dünn und durchscheinend. Wenn es einen Kleber auf der Oberseite des Deckglases, verwenden Sie die MicroBlade sorgfältig entfernen, sobald das Deckglas in Kraft ist und der Leim trocken ist.
5. Ein Schmerzmittel (z. B. Buprenorphin 2 mg / kg subkutan) wird unmittelbar nach der Operation verabreicht und bei Anzeichen von Schmerzen erneut verabreicht, einschließlich Zurückhaltung zu bewegen, essen oder trinken, Gewichtsverlust, Speichelfluss, Piloerektion, Atemgeräusche, usw.

3. Zwei-Photonen-Imaging

1. In Vorbereitung auf die Zwei-Photonen-Imaging, decken die TSCW mit Kochsalzlösung und suchen Sie den Bereich von Interesse unter Epifluoreszenz (Abbildung 2). Für eine nachfolgende Bildgebung der Region, nehmen Sie ein Bild mit einer Fotokamera.
2. Für Zwei-Photonen-Imaging, verwenden wir ein maßgeschneidertes Zwei-Photonen-Mikroskop ⁶ mit einem Ti: Saphir-Lasers abgestimmt, um 920 nm. Die Fluoreszenz wird mit Hilfe eines Photomultipliers in Ganzfeld-Erkennung-Modus und eine 580/180 Emissionsfilter erkannt. A 20X Wasser-Immersions-Objektiv (0,95 NA) ist im gesamten Imaging-Sitzung verwendet werden. Die maximale Leistung der Laserleistung auf das Ziel liegt zwischen 50 und 65 mW eingestellt.
3. Wählen Sie einen Bereich von Interesse in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 pm unterhalb der Pia-Oberfläche). Zur Erleichterung der Re-Imaging, machen Sie Fotos von der gleichen Sichtfeld bei 1X, 2X und 3X Digitalzoom. Blutgefäße können als Landmarken dienen, leicht zu finden die gleichen Sichtfeld während der nachfolgenden Abbildung Sitzungen. Unter einem Zoom von 3X, mehrere z-Stapeln mit 80-90 Z-Schritte in jedem Stapel und eine 0,69 &mgr; Schritt können alle 5 Minuten für bis zu 30 Minuten, was eine gute Probenahme von Mikroglia-Morphologie und Verhalten im Laufe der Zeit können erworben werden ( Abbildung 3). Zwischen den Erwerb von Z-Stapel, sollte man überprüfen, das Niveau der Kochsalzlösung über die TSCW sowie des Tieres Narkosetiefe.

4. Die Injektion des HIV-1 Neurotoxin, Tat

1. Zunächst silanisieren die innere Auskleidung einer 35-Gauge-Nadel und 10 ul Mikrovolumen Spritze Tat Ablagerung zu verhindern. Ziehen Sie die Silanisierung Lösung (Sigmacote), bis er sowohl die Nadel und Spritze füllt. Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Leeren Sie die Lösung aus der Spritze, entfernen Sie den Kolben, und lassen Sie die Spritze und Nadel vollständig trocknen. Schließlich, waschen Sie die Spritze und Nadel gründlich mit entionisiertem Wasser.
2. Führen Sie eine kleine Kraniotomie 0,5 mm im Durchmesser entweder 3 mm rostral oder lateral des TSCW, wo Zwei-Photonen-Bilder erhalten worden sind, mit einem kleineren Bohrer und sorgfältig Ausdünnung des Schädels, bis eine Pinzette mit scharfen Spitzen kann die verdünnte Schicht entfernen Knochen einfach weg. Wir verwenden eine 10 l Mikrovolumen Spritze mit 35-Gauge-Nadel durch eine Ultramicropump III Spritzenpumpe auf einem 3-Achs-Mikromanipulator und nach Futter bis die Nadelspitze auf die Kraniotomie montiert gesteuert ausgestattet, ist es sorgfältig fortgeschrittenen zu einer Tiefe von 700 bis 900 mu m unterhalb die Pia-Oberfläche, wo 3 ul Tat _1-72 (oder andere pro-inflammatorische Wirkstoffe) oder Kochsalzlösung (oder Kontrolle Fahrzeug) bei 80 nL / min geliefert wird.

5. Tierhaltung

1. Wenn das Tier abzubildenden mehrfach an einem einzigen Tag werden, decken die offene Fläche des Schädels mit einer Mischung aus Augensalbe und Vaseline, um Beschwerden oder Schäden an der Schädelbasis zwischen Imaging-Sitzungen zu verhindern. Trennen Sie die Unterstützung Brücke aus dem kleinen Kopf-Platte (siehe Abbildung 1B) und platzieren Sie das Tier in einem Käfig erwärmt mit leicht zugänglichen Nahrung und Wasser. Alle Tiere werden einzeln nach der Operation jederzeit untergebracht werden. Sobald die Bildgebung Sitzungen für ein Tier für einen bestimmten Tag fertig sind, entfernen Sie vorsichtig den gesamten Kopf-Platte und Naht der Haut wieder über den Schädel mit Nr. 6 oder kleiner Naht. Wieder Haus die Tiere einzeln mit leicht zugänglichen Nahrung und Wasser zwischen experimentellen Tagen. Überprüfen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Stress, Schmerzen oder Infektion.

6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Stabilisierung des Tieres für Chirurgie und Zwei-Photonen-Imaging (A) und Kopf-Bauweise (B).

Abbildung 2. GFP-markierten Mikroglia visualisiert mit Epifluoreszenz.

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Abbildung 3. GFP-markierten Mikroglia visualisiert mit Zwei-Photonen-Imaging nach der Implantation der TSCW, ca. 50 um unterhalb der Pia-Oberfläche. Die einzelnen Zwei-Photonen-Abschnitten entnommen 15-30 Minuten nach der Implantation der TSCW (Tag 0), sowie 7 und 17 Tage später, zeigen, dass die Fenster klar bleibt, während Mikrogliazellen in Abwesenheit von entzündlichen Beleidigungen bleiben inaktiviert. Die z-Projektionen genommen 6 und 24 Stunden nach der Injektion der HIV Neurotoxin tat weisen beeindruckende morphologische Veränderungen der aktivierten Mikroglia. Maßstab: 10 pm.

Diskussion

Es besteht wachsender Konsens, dass das eigentliche Substrat für die HIV-1 assoziiert neurokognitiven Defizite (HAND) die Vernichtung der synaptischen Architektur, vermutlich von pro-inflammatorischen Mediatoren aus HIV-1 infizierten mononukleären Phagozyten freigesetzt verursacht wird. Mikroglia-Aktivierung, mehrkernige Riesenzellen und Gliose aufgrund astrozytären Hypertrophie gelten als unspezifische Markenzeichen des HIV-1 Infektion und Entzündung im ZNS ^7. Im Gegensatz dazu hat die Schwere der premortem neurologische Erkrankung mit Verlust der synaptischen Komplexität sowie Makrophagen Belastung im ZNS ^8,9,10,11 korreliert. Allerdings dynamischen Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, periphere infiltrierenden Makrophagen und Neuronen bei Patienten mit HAND kann einfach nicht modelliert mit herkömmlichen statischen Verarbeitung von konventionellen immunzytochemische Studien gewonnen werden. Jüngste Studien aus unseren Labors haben ergeben, dass zumindest einige dieser Wechselwirkungen zwischen peripheren und zentralen mononukleären Zellen und Neuronen in Teil kann durch stereotaktische Injektion des HIV-1-Protein Tat _1-72 werden in Hirnparenchym (Lu, Marker, Tremblay modelliert, Qi und Gelbard, unveröffentlichte Daten). Wir beschlossen daher, in vivo Zwei-Photonen-Imaging gelten für das Zusammenspiel von Monozyten abgeleiteten Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen zu untersuchen, in einem kleinen gefügig Tiermodell für NeuroAIDS. Während offenen Schädel oder ausgedünnte Schädel Vorbereitungen leisten einer einzigen Untersuchung der kortikalen Architektur für eine kurze Zeit (Stunden), Ermittler in den zeitlichen Verlauf der subakuten Ereignisse können nicht diese Präparate ohne artifactually Aktivierung Mikroglia / Makrophagen durch chirurgische Manipulation der interessierten die Schädeldecken Fenster. Hier zeigen wir eine einfache Möglichkeit zur Umgehung dieser Beschränkung durch Verkleben ein winziges Stück Deckglas über dem Schädel gelichtet Bereich verhindert das Schädeldach aus nachwachsenden in der TSCW sowie die Aufrechterhaltung Transluzenz für ≥ 3 Wochen. Wir zeigen ferner, dass uns diese Technik, um das Verhalten der peripheren Monozyten Eingabe zerebralen Mikrovaskulatur sowie Gehirn-Wohnsitz Mikroglia in Reaktion auf die stereotaktische Injektion von HIV-Tat _1-72 im Kortex von Mäusen, die heterozygot für CX ₃ CR ₁ / GFP überwachen kann ( zu identifizieren Zellen der mononukleären Linie). Diese Technik kann leicht angepasst, um auf Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen verwenden, zum Beispiel verwenden wir routinemäßig heterozygot CX ₃ CR ₁ / GFP X Thy-1 YFP ¹² Mäusen zu Wechselwirkungen zwischen Monozyten-Makrophagen, im Gehirn ansässigen Mikroglia und Neuronen in Untersuchung in vivo Modelle Neuroinflammation relevanten HAND. Unsere TSCW Vorbereitung ermöglicht Ermittler Zell-Zell-Interaktionen zwischen Peripherie und ZNS, die über Zeiträume von Wochen, in denen das Tier immer wieder vor und nach der experimentellen Behandlung abgebildet werden können auftreten zu studieren. So kann jedes Tier als seine eigene Kontrolle dienen. Eine Einschränkung für diese TSCW Modells ist, dass die Zielzellen untersucht werden entweder gentechnisch verändert, um verbesserte fluoreszierende Proteine ​​(eXFP) ausdrückliche oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff ohne mechanische Verletzung der Schädelkalotte gekennzeichnet werden müssen, und dass eXFP Ausdruck muss robust genug sein, um ermöglichen zellulären Architektur zu werden, nachdem wiederholt Imaging-Sitzungen über einen Zeitraum von Wochen visualisiert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fentanylzitrat	Hospira Inc.
Midazolamhydrochlorid	Baxter Internationl Inc.
Medetomidinhydrochlorid (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Heizkissen	Beyond Bodi Heat
Tobramycin- und Dexamethason-Augensalbe (TobraDex)	Alcon
Povidon-Iodin 10% Lösung	Betadine Puredue Pharma
Eisenchlorid 10% Lösung	Ricca Chemical Company	3120-32
Methylcyanoacrylat 910	Permabond
Cyanoacrylat 454	Loctite
TEETS-Zahnprothesenmaterial vernetzendes Methylmethacrylat	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Microtorque II Handstück-Kit	Pearson Assessments	R14-0002
IRF 007 Bohrer	Feinwerktechnik Werkzeuge	19008-07
Norland biegsames Mikromesser, voller Radius	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cyanoacrylat	The Original Superglue
#0 Glasdeckgläschen	Electron Microscopy Sciences	63750-01
10 μl Mikrovolumenspritze	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
35-Gauge-NanoFil-Nadel	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Kugelmühle, Karbidfräser #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Photomultiplierröhre	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Ti:Saphir-Laser Mai-Tai	Newport Corp.