Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrangbrüche auf der Grundlage γH2AX Brennpunkten hat sich zu einem wertvollen Werkzeug, vor allem in der Strahlenbiologie, für die Auswertung von Gewebe Strahlenempfindlichkeit und die Auswirkungen der Strahlung modifizierende Verbindungen. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in Gewebeproben.
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Methodenartikel
Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind besonders tödlich und gentoxische Läsionen, die entweder entstehen können durch endogene (physiologischen oder pathologischen) Prozesse oder durch exogene Faktoren, insbesondere ionisierender Strahlung und Radiomimetikums Verbindungen. Die Phosphorylierung der H2A Histon-Variante H2AX, bei der Serin-139-Rest, in der hoch konservierten C-terminalen SQEY Motiv bilden γH2AX, ist eine frühe Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche
Protokoll
Gewebe
- Lungengewebe, in Formen im optimalen Schneid-Temperatur (OCT)-Verbindung 4583 eingebettet ist, wurde geschnitten (5 um) mit einem CM Leica 1950 Kryostat montiert und auf Poly-L-Lysin-Slides.
Die eingefrorenen Proben wurden von Dr. Simon Royce an der Murdoch Children Research Institute erhalten. Lungengewebe wurde aus unbehandelten Balb / c Mäusen und von einem Mausmodell für chronische allergische Atemwegserkrankungen, die viele der pathologischen Merkmale der menschlichen Asthma 6 zeigt gewonnen. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Animal Ethics Comm....
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Diskussion
Für den Zweck dieser Demonstration haben wir genutzt Maus Lungengewebe aus unbehandelten Balb / c Mäusen und von einem Mausmodell einer chronischen, allergischen Atemwegserkrankungen. Wir quantifiziert Unterschiede in der Zahl der Herde pro Zelle mit leicht höheren Durchschnitt in der geschädigten Lunge im Vergleich zu unbehandelten Abschnitten beobachtet. Insbesondere angegeben Quantifizierung 6,5 Foci pro / Zelle und 9,4 Foci pro / Zelle (manuelle Zählung von 20 Zellen pro Abschnitt), in der unbehandelten Gewebe und c.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit. MMT ist dankbar für die Unterstützung von Experten und Beratung von Dr. Olga Sedelnikova von den National Institutes of Health.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1 %) dient zur Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen. Primäre und sekundäre Antikörper werden in BSA verdünnt. | |
| PBS (ohne Ca)2+ und Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysin-Slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Elektrostatisch anziehend für gefrorene Gewebeschnitte und verringert die Notwendigkeit zusätzlicher Beschichtungen und Klebstoffe. |
| Tween 20 | Reagenz | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0,5 %) ist ein Detergens zur Permeabilisierung von Zellen |
| Triton X-100 | Reagenz | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0,1 %) zur Permeabilisierung von Zellen verwendet. |
| Paraformaldehyd | Reagenz | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-Phospho-γH2AX (Kaninchen polyklonaler Antikörper) | Primärantikörper | Upstate, Millipore | 07-164 | Verdünnung des Primärantikörpers (1:500) in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) | Sekundärantikörper | Invitrogen | A-11008 | Verdünnung des sekundären Antikörpers (1:500) in 1 % BSA. |
| Ethanol (70 %) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagenz | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagenz | Vector Laboratories | H-1300 | Ein auf Glycerin basierendes Eindeckmedium, das Propidiumiodid (eine rote Kernfärbung) enthält. Dieses Medium muss mit einer ölgetauchten Linse verwendet werden, deren Brechungsindex mit dem des Mediums übereinstimmt. Hinweis: Häufig verwendeter DNA-Farbstoff: 4,6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI). Kann nur mit Mikroskopen mit geeignetem Anregungslaser verwendet werden. |
| Mini PAP-Stift | Invitrogen | 008877 | ||
| Deckgläser (22x50 mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin-Becher, Glas | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Färbebad | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Konfokalmikroskop | Konfokales Mikroskop | |||
| CM Leica 1950 Kryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software zur Bildanalyse | Molecular Devices |
Referenzen
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
