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Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

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DOI:

10.3791/2439

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15. Februar 2011

 ,  ,  , 
1Swedish Medical Nanoscience Center, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Verfahren zur Herstellung von Scheiben mit der adulten Maus Hypothalamus suprachiasmatischen Nukleus (SCN), und einen schnellen Weg zur Kultur der SCN Gewebe in organotypischen Kultur Zustand, gemeldet werden. Darüber hinaus ist die Messung der oszillatorischen Uhr-Gen-Protein-Expression mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie beschrieben.

Zusammenfassung

Eine zentrale circadiane (~ 24 Std.) Uhr koordinierende Tagesrhythmus in Physiologie und Verhalten liegt in der suprachiasmatischen Nukleus (SCN) im vorderen Hypothalamus. Die Uhr ist direkt durch Licht über die Netzhaut und Sehnerv synchronisiert. Circadian Schwingungen werden durch die Interaktion negativen Feedback-Schleifen einer Reihe von sogenannten "Clock-Gene" und ihrer Eiweiss-Produkte, einschließlich der für den Zeitraum (pro-) Gene generiert. Die Core-Taktfrequenz ist auch abhängig von Membrandepolarisation, Kalzium und cAMP 1. Der SCN zeigt täglichen Schwankungen in Takt Genexpression, Stoffwechsel und spontane elektrische Aktivität. Bemerkenswert ist, besteht diese endogene zyklische Aktivität in adulten Geweben Scheiben des SCN 2-4. Auf diese Weise kann die biologische Uhr einfach in vitro untersucht werden, so dass molekulare, elektrophysiologischen und metabolischen Untersuchungen der Schrittmacherfunktion.

Der SCN ist eine kleine, gut definierte bilaterale Struktur direkt über dem Chiasma 5 befindet. In der Ratte enthält ~ 8.000 Neuronen in jeder Kern und hat Abmessungen von ca. 947 mu m (Länge, rostrokaudalen Achse) x 424 um (Breite) x 390 um (Höhe) 6. Um sezieren die SCN ist es notwendig, einen Hirnschnitt auf der jeweiligen Ebene des Gehirns, wo die SCN identifiziert werden können geschnitten. Hier beschreiben wir die Zerlegung und Slicing Verfahren des SCN, die ähnlich für Maus und Ratte Gehirn ist. Darüber hinaus zeigen wir, wie die Kultur der sezierten Gewebes organotypically auf einer Membran 7, eine Technik für die SCN Gewebekultur von Yamazaki et al. 8. Schließlich zeigen wir, wie transgene Gewebe zur Messung Ausdruck der Uhren-Gene / Proteine ​​mittels dynamischer Luciferase-Reporter-Technologie, einer Methode, die ursprünglich für circadiane Messungen Geusz et al verwendet wurde. 9 verwendet werden kann. Wir verwenden hier SCN Gewebe aus den transgenen Knock-in Periode2: LUCIFERASE Mäusen durch Yoo et al 10.. Die Mäuse enthalten ein Fusionsprotein aus PERIOD (PER) 2 und die Glühwürmchen-Enzym Luciferase. Wenn PER2 in der Gegenwart des Substrats für die Luciferase, dh Luciferin übersetzt wird, kann die PER2 Ausdruck als Biolumineszenz überwacht werden, wenn Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin. Die Anzahl der emittierten Photonen positiv korreliert mit der Menge des produzierten PER2 Protein, und die Biolumineszenz-Rhythmen passen die PER2 Protein Rhythmus in vivo 10. Auf diese Weise den zyklischen Schwankungen in PER2 Ausdruck kann kontinuierlich überwacht werden Echtzeit während viele Tage. Das Protokoll folgen wir für Gewebekulturen und real-time Biolumineszenz Aufnahme wurde eingehend von Yamazaki und Takahashi 11 beschrieben.

Protokoll

1. Herstellung der Lösung

  1. Kulturmedium mit Luft-Pufferkapazität
    1. Füllen Sie eine 1 Liter Flasche mit ca. 800 ml sterilem H 2 O (autoklaviert milliQ H 2 O).
    2. Unter Rühren hinzufügen und mischen folgende Stoffe: 1 Behälter zu niedrigen Blutzuckerwerten, serumfreien DMEM 2902 Pulver ohne Natriumbicarbonat und Phenolrot (Phenolrot stört die Biolumineszenz-Signal), 20 mL B27 ergänzen 50x, 4,7 ml einer 7,5% NaHCO 3 Lösung (oder 0,35 g NaHCO 3), 10 ml HEPES 1M, 2,5 mL PenStrep 10.000 U / mL und 3,5 g D-Glucose. Lassen Sie das Medium rühren, bis die Zutaten vollständig gelöst sind.
      Das fertige Medium (1 Liter) wird enthalten:
      1x DMEM, 1x B27 ergänzen, 4,2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / ml Penicillin, 25 U / ml Streptomycin und 19 mM D-Glucose.
    3. Der pH-Wert auf 7,2 mit NaOH zu verringern oder HCl auf den pH-Wert zu erhöhen, und bringen Volumen bis zu 1 Liter mit sterilem H 2 O.
    4. Passen Osmolalität mit H 2 O (Abnahme Osmolalität) oder D-Glucose (Erhöhung der Osmolalität). Die Osmolalität ist zwischen 285-315 mOsm / kg, aber im optimalen Bereich ist 300-310 mOsm / kg. Nicht auf das Medium mehr als 5% zu verdünnen.
    5. Filter das Kulturmedium mit Corning sterile Vakuumfiltration setzt (zB 2 x 500 mL mit einer Porengröße von 0,22 um) in eine sterile Haube. Halten Sie das Medium, in 4 ° C und schützen sie vor Licht mit Aluminiumfolie. Wir empfehlen, dass das Medium innerhalb von 3 Monaten verwendet wird.
  2. Hanks balanced salt solution (HBSS) Puffer mit Ergänzungen (zum Schneiden von Scheiben)
    1. Füllen Sie eine 1-Liter-Glasflasche mit ~ 600 mL sterile (autoklaviert milliQ) H 2 O und fügen Sie die folgenden Substanzen: 100 mL HBSS 10fach, 10 mL Penicillin-Streptomycin 10.000 U / ml, 5 ml einer 7,5% igen NaHCO 3-Lösung und 10 mL HEPES 1M.
      Der letzte Schnitt-Lösung enthält:
      1x HBSS, 10 mM HEPES, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml Penicillin und 100 U / ml Streptomycin.
    2. Überprüfen Sie pH-Wert und, falls erforderlich, pH-Wert auf 7,2 und bringen das Volumen bis zu 1 Liter mit sterilem H 2 O.
    3. Überprüfen Sie Osmolalität, die muss zwischen 285-315 mOsm / kg.
    4. Kühlen Sie die HBSS auf 4 ° C. Die HBSS-Puffer muss sehr kalt sein (4 ° C) beim Schneiden / Schneiden Verfahren in Ordnung zu bringen den Stoffwechsel und die Erhaltung Gewebeviabilität.

2. Vorbereitungen vor dem Schneiden und Kultivieren Slices

  1. Die Gewebe werden in einem warmen, trockenen Raum ohne CO 2 kultiviert. Zur Vermeidung von Austrocknung der Kulturen müssen mit Deckgläsern an die Gerichte durch Fett abgedichtet werden. Zu diesem Zweck füllen 5 ml Spritzen mit Silikon-Vakuum-Fett. Decken Sie die Kanülen mit kleinen Stücken aus Aluminiumfolie und autoklavieren sie. Auch Autoklaven Filterpapiere (verwendet beim Schneiden Verfahren).
  2. Rechts vor dem Schneiden Verfahren gelten autoklaviert Vakuumfett auf dem oberen Ring Fläche von 35 mm Petrischalen. Bereiten Sie einen separaten Petrischale für jede Scheibe Kultur.
  3. Vor Beginn der Slicing Verfahren alle nicht-sterile Instrumente, Rasierklingen, Vibratom Klingen, Deckgläser und anderes Material für die Scheibe und Kultur Verfahren verwendet wurden, um sterilisiert werden. Spray alle nicht-steriler Ausrüstung mit 70% Ethanol. Expose die Instrumente und die gefettete Petrischalen mit UV in einem sterilen Haube für mindestens 30 Minuten UV-Exposition vor Kultivierung.
  4. Zur gleichen Zeit, füllen Sie eine Falcon-Röhrchen mit Luft-Buffering Kulturmedium (count 1,2 ml für jede Kultur, für 8 Kulturen vorzubereiten etwa 10 mL Medium) und fügen Sie frisch aufgetaute Luciferin (0,1 M Stammlösung; Promega, Madison, WI) (10 l Luciferin zu 10 ml Medium; Endkonzentration 0,1 mM).
  5. Das Luciferin ist lichtempfindlich und sowohl Stammlösungen und das Luciferin-haltigem Medium muss vor Licht geschützt werden. Legen Sie die Falcon-Röhrchen mit Luciferin-Medium in einem dunklen 36-37 ° C Heizkammer. Gegebenenfalls kann das Luciferin auch direkt in die Kulturschalen zum Zeitpunkt des Schneidens hinzugefügt werden. Wenn Luciferin nicht hinzugefügt wird, wird es keine leichte Reaktion zwischen Luciferase und Luciferin und deshalb kein Signal aus dem Gewebe.
  6. Nach der UV-Exposition, fügen Sie eine sterile Klinge zum Vibratom.

3. SCN Slicing Verfahren

Das folgende Verfahren beschreibt Aufschneiden der Erwachsenenbildung, in der Regel 2-4 Monate alt, C57/BL6-Mäusen. Bitte beachten: Der Schneidvorgang sowie Belichtung des Tieres während der Nacht, können unterschiedlich Reset der Phase des SCN. Um dies zu vermeiden, sollte die Schneid-und Kultivierung während der hellen Stunden durchgeführt werden, vorzugsweise zwischen ZT 6-12, wenn keine erhebliche Phasenverschiebungen aufgrund des Verfahrens 12 auftreten. Wenn SCN hat in der Dunkelheit abgetastet werden, haben 3,1 und 3,2 auf der roten Ampel oder mit Schutzbrille Nacht durchgeführt werden, um Licht-induzierte Phasenverschiebungen zu vermeiden.

  1. Anesthetize der Maus vorzugsweise durch Isofluoran (Baxter) in einem glass Kammer. Wenn das Tier hat seinen Schmerz Reflexe (Prüfung durch Kneifen mit den Nägeln in der Pfote) verloren, aber noch nicht aufgehört zu atmen (um Sauerstoffversorgung zu halten so lange wie möglich), schnell enthaupten den Kopf mit einer Schere oder ähnliches.
    Bitte beachten Sie: In einigen Ländern CO 2-Exposition (Hyperkapnie) ist immer noch als Betäubungsmittel-Methode erlaubt, auch wenn es berichtet wurde, um tierische Angst zu fördern. Darüber hinaus können Genickbruch vor Enthauptung erforderlich sein. Bitte folgen Sie lokale Gesetzgebungen, wenn euthanizing Tiere.
  2. Entfernen Sie die Augen aus dem Kopf mit einer Schere, um Belastungen und weitere Anregung des Sehnerven, die die SCN Schäden verhindern kann.
  3. Wenn noch angebracht ist, entfernen Sie die letzten Halswirbelsäule mit einer Schere, die Haut abziehen (Abb. 1a) und stellen zwei Schnitte mit einer feinen Schere (zum Beispiel Iris Schere), ein Schnitt an jeder Seite des Schädels an den Seiten, wodurch einen abnehmbaren "Deckel".
  4. Öffnen Sie den Schädel mit einem Mikro Rongeur Tool (fein Präparierscheren kann auch auf eine Maus verwendet werden) und entfernen Sie alle Knochen, bis die Riechkolben gesehen werden kann. Arbeiten nach oben, nie nach unten drücken das Gehirn mit dem Werkzeug, um eine Beschädigung des ventralen SCN (Abb. 1b) zu verhindern.
  5. Schneiden Sie vorsichtig den Sehnerv zwischen den Riechkolben und den Hemisphären mit feinen Mikro Sezieren Frühjahr Schere. Stellen Sie sicher, dass der Nerv vollständig geschnitten wird seit Dehnung des Sehnervs führen kann, um in der SCN und geplatzten Scheiben beschädigt.
  6. Drehen Sie den Kopf auf den Kopf und lassen Sie das intakte Gehirn herausfallen (falls noch an das Gehirn gebunden, andere Hirnnerven Möglicherweise müssen kaudalen Schnitt des Sehnervs werden) in einen Behälter (zum Beispiel einer Glas-Petrischale ≈ 10 cm) gefüllt mit 50-100 ml kaltem HBSS eine schnelle Kühlung des Gehirns. Im Idealfall sollten die beiden Sehnerven intakt bleiben (Abb. 1c). Halten Sie den Kopf in den HBSS 30-60 Sekunden, um sicherzustellen, das Gehirn gekühlt wird.
  7. Mit einem Löffel oder ähnliches und Ort der gekühlten Gehirn, dorsalen Oberfläche bis auf eine sterile Schnittfläche (zum Beispiel einer Glas-Petrischale Deckel auf den Kopf gestellt). Um einen koronalen Schnitt vorzubereiten, machen Sie einen senkrechten Schnitt mit steriler Rasierklingen oder Skalpelle zwischen den Hemisphären und das Kleinhirn, also das Entfernen des Kleinhirns.
  8. Bewerben Sekundenkleber auf den trockenen Plattform aus der vibroslicer / Vibratom.
  9. Pick-up des Gehirns (Hemisphären ohne Kleinhirn und ohne Riechkolben), indem Sie einen scharfen, gebogenen Pinzette in den rostralen Teil und sorgfältig abtrocknen der HBSS auf einem sterilen Filterpapier, hielt immer noch das Gehirn mit der Zange. (Statt Einsetzen einer Pinzette, ein kleines Stück von sterilem Filterpapier kann zur Befestigung und den Transfer des Gehirns werden).
  10. Fix die Hemisphären auf die geklebte Plattform mit der rostralen Spitze nach oben und ventralen Oberfläche am nächsten an der Schneide. Bringen Sie die Plattform in die Halterung aus der Vibratom (zum Beispiel von Campden Instruments, UK) und sofort füllen Sie ihn mit kaltem HBSS. Wenn die senkrechte Schnitt richtig gemacht wird, sollte die Hemisphären gerade aufstehen somit eine gute Winkel notwendig, einen koronalen Schnitt mit den bilateralen SCN.
  11. Um das Ziel SCN Gebiet zu erreichen, starten Sie das Abschneiden dickeren Abschnitte (500-800 um) der Hemisphären bei hohen oder maximale Geschwindigkeit des Vibratom. Das Verschieben der Klinge kann man ziemlich schnell am Anfang vor dem Erreichen des Hypothalamus, sollte aber verlangsamt werden, wenn das Chiasma sichtbar (hohe Frequenz der schwingenden Klinge und langsame Bewegung horizontal verringert Zellschäden beim Schneiden, wodurch Scheibe Lebensfähigkeit). Reduzieren Sie die Abschnitte bis 100 um, wenn das Chiasma größer wird (breiter) und die vordere Kommissur wird kleiner. Um eine Mitte-SCN Abschnitt erwerben, arbeiten Sie sich "down" (kaudal), bis die beiden SCN Kerne beginnen zu erscheinen. Eine Lupe kann notwendig sein, zur Visualisierung der Kerne. Bitte beachten: Der SCN im Gehirn der Maus ist mehr caudal des Chiasma gelegen als zum Gehirn der Ratte verglichen.
  12. Wenn der gewünschte Grad der SCN erreicht wurde (SCN wird an dieser Stelle erscheinen als mehr definiert, rund oder mandelförmig Strukturen; Abb. 1d; rund Bregma-0.46--0,70 mm für den mittleren Bereich des SCN in der Maus 13, Bregma - 0.92--1,40 mm für Ratten 14), schneiden Sie die SCN Abschnitt (Abb. 1e). Geeignete Dicke der Schicht ist für die Maus 250 ± 50 &mgr; m; für Ratten 350 ± 50 pm.
  13. Mit einer weichen Bürste, Lift und übertragen Sie die SCN Scheibe mit einem Deckel aus einer mittleren Petrischale mit kaltem HBSS gefüllt, unter einem Dissektionsmikroskop oder Stereoskop gelegt. Überprüfen Sie unter Vergrößerung, wenn die bilateralen SCN ist deutlich sichtbar. Wenn die Mitte-Region des SCN gewählt (die nicht notwendigerweise der einzige "optimale" Slice-Ebene, sondern, dass wir prüfen, ist der einfachste Weg, um das Schneiden Verfahren zu standardisieren und zu reduzieren Variation), sollte es klar zumindest gesehen werden eine Seite derScheibe Abschnitt. Wenn der Schnitt war zu rostral, einen weiteren Abschnitt und überprüfen Sie die SCN unter Vergrößerung.

4. Organotypische SCN Kultur

  1. In der Petrischale Deckel mit HBSS gefüllt, sezieren die bilateralen SCN als Quadrat Gewebe (~ 1,5 mm je Seite) mit einem Paar sterile Skalpelle unter einem Binokular. Ein kleines Stück des Chiasma wird das Explantat verbunden bleiben, aber keine anderen Kerne sollten einbezogen werden. Cut so nah wie möglich ohne Ausbau SCN Gewebe.
  2. Gegebenenfalls für das geplante Experiment können die bilateralen SCN dann in zwei Hälften geschnitten werden, um zwei einseitige SCN zu erhalten. Eine einseitige SCN kann dann als Kontrolle (Abb. 2a) verwendet werden.
  3. Fill 1200 ul der Luciferin-Medium in ein ≈ 35 mm Petrischale und legen Sie eine Kultur-Membran (Milli-CM 0,4 pm, Millipore, Bedford, MA) auf der Oberfläche der Flüssigkeit (2b). Das Kulturmedium Volumen ist entscheidend, da die Kultur Membran sicher sitzen sollte auf der Basis der Kulturschale, nicht schwimmen oder Felsen in das Medium 11. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen unter der Membran. Vermeiden Sie unnötige Lichtexposition bei der Arbeit mit Luciferin.
  4. Die Explantate sind klein und schwer zu holen. Verwenden Sie daher ein 1000 ul Pipette + Spitze der SCN Explantat in die Spitze zu saugen und drücken Sie auf der Membran. Bei der Explantation ist zu groß, um einfach in einem 1000 ul Pipettenspitze (zB Ratte SCN und Maus bilateralen SCN) passen die Spitze kann mit einem sterilen Werkzeug, um eine breitere Öffnung zu schaffen geschnitten werden. Discard übermäßige HBSS auf der Membran mit der Pipette. Für Luciferase Aufnahme statt nur einer SCN / Schale (Abb. 2b) als Aufnahme-Röhren alle Photonen aus der Schale emittiert erkennen und nicht zwischen den Signalen aus verschiedenen Geweben zu unterscheiden.
  5. Seal die Schale mit einem Deckglas (≈ 40 mm, Menzel-Gläser, Deutschland) und Vakuum-Fett (Dow Corning Corp, USA) 11. Achten Sie darauf, die Dichtung ist dicht (Abb. 2c). Wenn nicht, mit mehr Fett zu versiegeln.
  6. Übertragen Sie die Gerichte zu einer 36-37 ° C lichtdichten Kammer und starten PMT-Aufnahmen sofort.

5. Die Messung der Luciferaseaktivität durch Aufnahme Biolumineszenz

Luciferase-induzierte Biolumineszenz-Signale aus dem kleinen SCN Gewebe erkannt und verstärkt mit photonmultiplier-tube (PMT)-Detektor Baugruppen innerhalb eines lichtdichten Kammer montiert. Die PMTs sind in der Regel ~ 1-2 cm oberhalb der Kulturschalen 8 positioniert. PMT Aufnahme-Setups können nach Maß oder sind im Handel erhältlich 11.

  1. Die Schale unter einer PMT (die Wärme aus der PMT produziert wird Kondensation auf das Deckglas zu entfernen) und in der Nähe der Kammer. Sicherstellen, dass die Kammer (weniger als 20 Photonen / min) 100% lichtdicht als der dunkle Graf von PMTs für SCN Gewebe verwendet, ist sehr gering. Die PMTs erkennen sogar das schwächste Licht Leckage.
  2. Starten Sie die Datenerfassung, die mit Software (z. B. LumiCycle; Actimetrics Inc., Wilmette, IL, USA) durchgeführt wird. Photon zählt, sind über 1-10 min Intervallen integriert, um hohe Auflösung des Gen / Protein-Expression zu bekommen.
  3. ClockLab, Actimetrics;; LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, Till Roenneberg an der Universität München, nach der Aufnahme fertig ist, können die erhaltenen zirkadianen Expression des Gens / Proteins mit entsprechender Software (Origin, OriginLab, Northampton, MA, USA analysiert werden München, Deutschland), um festzustellen Phase (Zeit für einen Zyklus) und die Amplitude des Rhythmus. Der Gipfel Ausdruck der Gen-oder Protein wird meistens als Bezugspunkt verwendet und gilt als die höchste Photonenzahl während eines Zyklus definiert. Die Daten können vor-Analysen der Phase, Periode und Amplitude geglättet werden, insbesondere, wenn das Signal / Rausch-Verhältnis gering ist. Die Grundlinie ändert sich manchmal und müssen abgezogen, bevor die Analysen durchgeführt werden.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Wir stellen hier den oszillierenden PER2:: LUC Ausdruck als auslesen für die Lebensfähigkeit und den Zustand des gezüchteten Gewebes. Unter optimalen Bedingungen, und wenn das Gewebe am Leben ist, das PER2:: LUC Ausdruck oszilliert mit einem zirkadianen Rhythmus, wie in Abbildung 3 dargestellt. PER2 in der SCN ist maximal in der Regel rund Zeitgeber Zeit 12-13 (: Dunkel-Zyklus, wo ZT 12 stellt Lichter aus in einem 12:12 h Licht) zum Ausdruck gebracht. Die in der Größe größer die lebendes Gewebe ist, desto höher ist die Photonenzahl wird. Allerdings sollte die Größe und Dicke der organotypically gezüchtetes Gewebe gering gehalten werden, um zu halten das Gewebe lebensfähig, vorzugsweise nicht größer als 15 mm 2 11 und nicht dicker als 500 um 7. Der SCN, wenn seziert wie hier beschrieben, zeigt typischerweise Photonen zwischen 10.000-40.000/min, wenn das Gewebe von einer homozygoten PER2 abgetastet wird:: LUC Tier. Die Amplitude der Schwingung in organotypischen SCN Kulturen ist in der Regel sehr hoch während des ersten Zyklus wie bei den folgenden Zyklen verglichen. Es ist nicht ganz klar, warum der erste Zyklus sehr hohe amplit hatude. Eine mögliche Erklärung ist, dass ein wesentlicher Teil der Zellen in das Gewebe kann in Kürze sterben nach dem ersten Schnitt und Kultivierung, also nicht nutzen Luciferin nach dem ersten Zyklus. Der Schneidvorgang kann auch dazu führen, übermäßige Erregung, die das Luciferase-Signal während des ersten Zyklus verstärken könnte.

Abbildung 3 zeigt Lumineszenz Spuren von SCN Scheiben und enthält eine trace (rot) aus einer Scheibe, die nicht ursprünglich gesunden erhalten. Dead or ungesunde Gewebe geringe Photonenzahl Baselines. (Darüber hinaus tote Gewebe häufig in der Schale trennen und können nicht von der Membran in einem Stück entfernt werden.)

Die Technik in diesem Bericht beschrieben werden vorteilhaft in pharmakologischen Experimente genutzt werden. Abbildung 4 zeigt eine Spur von einer Kultur, die wir zwischen Tag 1 und 2 behandelt mit einer HCN-Kanal-Blocker (ZD7288, 10 uM). Wie in der Abbildung zu sehen ist und veröffentlicht als vorher 15, der Blocker deutlich reduziert die Amplitude der circadianen Schwingung PER2, aber nach dem Waschen mit normalem Kulturmedium die Schwingung kam zurück, die belegen, dass der Blocker der molekularen Uhr betroffen, aber die Gewebe wurde lebensfähig und gesund.

Abbildung 1
Abbildung 1. Slicing Verfahren
A) Der Kopf eines enthaupteten eingeschläfert Maus mit den Augen und der Haut entfernt werden. B) Der Schädel mit einem Mikro Rongeur Werkzeug entfernt wird. Bei Verwendung des Tools muss man nach oben arbeiten und nie nach unten drücken das Gehirn mit dem Werkzeug. C) Das Gehirn auf den Kopf (Bauchseite nach oben), ohne Riechkolben gezeigt. Der weiße Chiasma mit den beiden intakten Sehnerven gesehen werden kann. Die suprachiasmatischen Nukleus (SCN, die Grenzen mit rot markiert) befindet sich nahe dem Chiasma gelegen. D) A koronal geschnitten Gehirn an der Plattform in der vibroslicer, auf der Ebene der SCN. E) Koronar Gehirn Abschnitt (250 &mgr; m dick) mit dem Chiasma (OC), dritten Ventrikel (3V) und die bilateralen suprachiasmatischen Kerne (SCN).

Abbildung 2
Abbildung 2. Organotypischen Gewebekulturen.
A) Die beiden einseitigen SCN Kerne (insert) von der Scheibe zerlegt dargestellt. B) Kulturschale (35 mm Petrischale) mit Kultur-Membran-, mittel-und Explantation, aber ohne Vakuum Fett und Deckglas. Das Medium (1,2 ml) kann als Flüssigkeit zwischen die Antenne und die Membran zu sehen. Eine einseitige SCN Kern basiert auf der Kultur-Membran platziert. Der weißeste Teil der kleinen Gewebe ist ein Stück des Chiasma (insert). C) Die Kulturschale mit seiner Membran und seiner SCN Gewebe, mit Vakuum-Fett und eine runde Deckglas versiegelt.

Abbildung 3
Abbildung 3. Biolumineszenz-Aufnahmen von gesunden und nicht gesunden SCN Gewebekulturen.
Beispiele für Biolumineszenz Aufnahmen Periode2: LUCIFERASE (PER2:: LUC) Ausdruck in suprachiasmatischen Nukleus (SCN) Scheiben von Mäusen in einem 12h statt erhalten: 12h Licht: Dunkel-Zyklus. Die PER2:: LUC Protein schwingt mit einem zirkadianen (~ 24 Std.) Variante, bei der die maximale Expression des Proteins erfolgt bei Zeitgeber Zeit 12-13. So wird die Phase des Gens Rhythmus abhängig von der Licht-Dunkel-Zeitplan, in denen das Tier gehalten, bevor geopfert wurde. Typischerweise zeigt Biolumineszenz von einseitigen SCN Gewebe präpariert wie in der Anleitung beschriebenen Photonen zwischen ~ 10.000-40.000/minute. Die Abbildung zeigt Spuren von einer gesunden (schwarzen) SCN Kultur, einer Non-gesunde SCN Kultur (rot) und eine SCN Kultur, die aus getrockneten (blau) nach dem Öffnen der versiegelten Kulturschale am Tag 4 und nicht wieder Verschließen der Schüssel richtig ( durch Pfeil gekennzeichnet).

Abbildung 4
Abbildung 4. Biolumineszenz Aufnahme während und nach der Einnahme der Arzneimittel.
PER2:: LUC Ausdruck in einer Kultur vor, während und nach der Wirkung eines HCN-Kanal-Blocker (ZD7288, 10 uM). Der erste Pfeil zeigt die Zeit, in der Blocker hinzugefügt wurde. Der zweite Pfeil zeigt Auswaschung, die durch den Austausch des Medikaments Medium mit klimatisierter Kontrolle Medium gemacht wurde. Beachten Sie die reduzierte Amplitude nach 2 Tagen von Substanz-Exposition, fehlende Schwingung am Tag 4 und die schnelle Wiederherstellung des Proteins Rhythmus nach Auswaschen.

Diskussion

Vorteile und Nachteile, die mit Luciferase-Reporter-Technologie

Im Gegensatz zur Ex-vivo-Methoden, wie z. B. RT-PCR, in situ Hybridisierung und Western-Blot, dass Gewebeentnahme erfordert an vielen verschiedenen Zeitpunkten (was zu einem geringen zeitlichen Auflösung von in der Regel 2-4 Stunden je nach Sampling-Frequenz), um tägliche Studie Variationen in der Gen-und Protein-Ausdrücke erlaubt die Luciferase-Reporter-Technologie mit hoher Auflösung (1-10 min) Studien der circadianen Oszillationen für viele Tage in der gleichen Weise vor. So ist die Zahl der verwendeten Tiere auf ein Minimum reduziert und detaillierte Untersuchungen der Auswirkungen auf Phase und Zeit der Rhythmus sind möglich, was normalerweise nicht möglich ist mit konventionellen Sampling-Techniken mit geringer zeitlicher Auflösung. Doch obwohl relative Amplitude Messungen der Rhythmus möglich sind, sollte betont werden, dass Reporter Technologie nicht quantitative und kann daher nicht verwendet werden, um Mengen von transkribierten Gene oder Proteine ​​übersetzt messen werden.

Das Gewebe Aufnahmen gestartet und ausgewertet werden sofort nach der Kultivierung, ein großer Vorteil für das direkte Studium der molekularen Effekte in vivo Stress in vivo lichtinduzierten Phasenverschiebungen etc. Die organotypischen SCN Kultur ermöglicht langfristig (Wochen) pharmakologische Manipulation von erwachsenen Gehirn Gewebe mit einer intakten reifen synaptischen Netzwerk und die Luciferase-Reporter-Technologie ermöglicht eine stabile Aufnahmen für viele Wochen. So macht das Gewebe nicht zu Neugeborenen oder frühen postnatalen werden, um gesunde Kulturen zu erhalten, und im Gegensatz zu den akuten Scheibe chronischen pharmakologischen Behandlungen durchgeführt werden können. Im Gegensatz zu Plasmid-reporter Transfektionen in Zellkulturen, die keine auf den Einbau von DNA in das Genom führen, werden die transgenen Luciferase-Tiermodellen (sowie Lenti-Virus Transfektionen) günstig, wenn epigenetische Veränderungen untersucht werden sollen. Es sollte in diesem Zusammenhang auch erwähnt werden, dass Lumineszenzbildgebung heute ist mit hochempfindlicher CCD-Kameras 11 möglich, so dass Aufnahmen auch in einzelnen SCN Neuronen (~ 6-10 um) und anderen Zelltypen, von den großen Labors Studium zirkadianen Rhythmen genutzt werden. Schließlich mehreren circadianen Ermittler verwenden häufig die Überwachung der molekularen Expression mit anderen Reportern, wie das Green Fluorescent Protein, um Clock-Gen / Protein-Oszillationen 16-19 studieren.

Aspekte der Schichtdicke

Die hier empfohlenen Dicken der SCN Scheibe (200-300 um) könnte reduziert oder erhöht werden, falls gewünscht. Doch obwohl das Gewebe verflacht auf der Membran nach ein paar Tagen in Kultur, ist es nicht empfehlenswert, 500 pm Dicke der zunächst Anschnitt überschreiten, um die Lebensfähigkeit der Gewebe 7 zu erhalten. Ein Stück dünner als 100 pm ist der Maschinen-und praktischen Gründen schwierig zu handhaben. Da der SCN Gewebe ist heterogen die Dicke der Scheibe kann die Phase der Luciferase Ausgangssignal auswirken, da die verschiedenen Regionen innerhalb des SCN (zum Beispiel den "Kern" gegenüber der "Schale" und dorsal gegenüber ventralen Regionen) mit unterschiedlichen Phasen oszillieren 20 und differentiell nach Phase re-synchronisieren verschiebt 21. Die Dicke der Scheibe wirkt sich auch auf die Grundlinie der Photonenzahl seit mehr Gewebe gibt eine größere Anzahl von Photonen. Die Amplitude des molekularen Schwingungen können auf diese Weise indirekt von der Größe der Explantation betroffen sein. Aus diesen Gründen sollte die Kontrolle und behandelten Kulturen immer die gleiche Größe, Dicke und mit der gleichen Region des SCN, um in der gleichen Phase und mit gleicher Amplitude schwingen. Die beiden einseitigen Kerne, auf der anderen Seite, in Phase schwingen miteinander und mit ähnlichen Amplituden, solange die Vibratom Schnitt ist horizontal und nicht abgewinkelt (die wiederum abhängig ist, dass die Trennung zwischen Kleinhirn und den beiden Hemisphären Schnitt senkrecht auf die Tischoberfläche). Ein Ermittler, der SCN Kultivierung führt möglicherweise zu, dass SCN Kulturen nicht in Phase schwingen miteinander. Üben und Standardisierung der Slicing-Technik, dh die Scheiben sind immer an der gleichen rostro-kaudal des SCN schneiden, wird das Ergebnis verbessern.

Kritische Schritte

  1. Sauerstoffversorgung ist kritisch.
    Weil das Gehirn braucht viel Sauerstoff 22, muss das Aufschneiden Verfahren schnell zu sein (Je näher 3,1-3,10 ist auf ~ 5-6 Minuten desto besser ist es in Ordnung zu halten das Gewebe gesund ist).
  2. Der SCN ist empfindlich gegen Temperaturschwankungen und mittlere auszutauschen.
    Der SCN ist temperaturempfindlich und großen Temperaturschwankungen können Phasenverschiebung der Herzschrittmacher und verursachen experimentelle Artefakte 23. Wenn mittel-oder Lösungen ausgetauscht werden oder während eines laufenden Experiments, zum Beispiel bei der Anwendung eines Arzneimittels nach ein paar Tagen in Kultur, mittel-oder solutio hinzugefügtn muss vorgewärmt auf 36-37 ° C (die gleiche Temperatur wie in der Kammer) vor der Zugabe werden. In pharmakologischen Experimenten, die mittel-Austausch beteiligen, ist es wichtig, immer mit konditionierten Zellkulturmedium Arbeit. Addition / Wash-out mit frischen, können unbedingte Medium potentiell Phasenverschiebung der molekularen SCN Rhythmus 24 sowie anderen Zelltyp Kulturen 25.
  3. Medium Zusammensetzung.
    Es ist wichtig, die Kultur des Gewebes in der richtigen pH-Wert und Osmolalität. Die Luft-Buffering Medium enthält eine große Menge von HEPES, die eine optimale Pufferkapazität im Bereich von pH 6,8 bis 8,2 hat und eignet sich auch für die Pufferung der pH-Änderungen, die als Folge der Zellatmung entstehen können. HEPES, auf der anderen Seite, ist empfindlicher auf Temperaturänderungen als mit Natriumbicarbonat, die in kleinen Mengen in das Kulturmedium enthalten ist verglichen. Natriumbicarbonat hat eine größere Pufferkapazität in den unteren pH-Wert (5,1-7,1)-Bereich 26, also gegebenenfalls in einem CO 2-Atmosphäre. Allerdings erhöhte Mengen von Natriumbicarbonat in der Luft-Buffering Medium (DMEM 2902) erhöht sich die Osmolalität erheblich und kann nicht ohne gleichzeitig Verdünnung des Mediums, was wiederum in die falsche Zusammensetzung der Aminosäuren, Vitaminen und Ionen. Hinzugefügt werden
    Beratung für die Vorbereitung des Mediums:
    1. Seien Sie präzise und vorsichtig beim Mischen des Mediums.
    2. Verwenden Sie nur frisches oder frisch aufgetaut Stammlösungen.
    3. Bei sehr hohen Osmolalität ist es nicht wert, Verdünnung. Mehr als 5-6% verdünnten Medium wird wahrscheinlich nicht funktionieren. Verwenden Sie D-Glucose zu Osmolalität erhöhen, wenn sie zu niedrig ist.
  4. Phasenverschiebungen aufgrund Vorbereitungszeit
    Die Zeit der Scheibe ist von kritischer Bedeutung. Null oder nur minimale Auswirkungen auf Phase ist erreicht, wenn die Scheibe Verfahren zwischen ZT 06-12 Dezember durchgeführt wird. Alle Scheiben Dissektionen sollte bei der gleichen Phase des tageszeitlichen oder circadianen Zyklus durchgeführt werden, um Fehler aufgrund von Abweichungen zwischen der Vorbereitungsphase zu minimieren.

Mögliche Änderungen

  1. Bei akuten SCN Elektrophysiologie, hat das Schneiden mit einem Ringer (Artificial Cerebro Rückenmarksflüssigkeit; ACSF) durchgeführt werden Puffer, mit Sauerstoff (95% O 2, 5% CO 2) vor dem Schneiden beginnt gesättigt. Darüber hinaus braucht Sauerstoff, kontinuierlich in den Puffer hinzugefügt werden während der gesamten Slicing Verfahren, wie die Elektro-und synaptische Aktivität ist direkt abhängig von Sauerstoff-Versorgung 22.
  2. Horizontal und sagittalen Schnitten können auch erfolgreich vorbereitet und kultivierten des SCN. Die Autoren haben Erfahrung mit Luciferase-Aufnahmen in horizontale Schnitte, die nach unseren Erfahrungen geben circadianen Oszillationen mit niedriger Amplitude, wie mit dem koronalen Schnitt verglichen.
  3. Der SCN ist etwa 1 mm langen rostro-kaudal und das Schneiden hier beschriebene Technik ist auf den Erwerb eines SCN Abschnitt in der zentralen Region ausgerichtet. Allerdings kann mehr als eine SCN Abschnitt von Maus und Ratte Gehirn gewonnen werden, so dass die Untersuchung der circadianen Gen / Protein-Expression in mehr rostral gegen kaudalen Ebenen des SCN Kern.
  4. Slice-Kulturen von jüngeren Tieren, postnatale Welpen oder auch Embryonen, können ebenfalls hergestellt werden. Bitte beachten Sie, dass das Gehirn und dem Schädel in sehr jungen Welpen sehr weich und empfindlich sind. Darüber hinaus ist der Sehnerv dünn und nicht voll entwickelt. Seien Sie vorsichtig beim Sezieren des Gehirns der Jungtiere, so dass die SCN Region nicht beschädigt wird. Zum Beispiel kann micro Rongeur Werkzeuge nicht verwendet werden, um den Schädel des Jungen Maus geöffnet werden, weil sie zu groß sind. Feine Schere genug sind, um die Weichteile in jungen Welpen geschnitten.
  5. Das Deckglas auf Kultur hier beschriebene Technik kann auch zum Bild Lumineszenz mit einer CCD-/ EM-CCD-Kamera, auch in einzelnen SCN Neuronen verwendet werden.
  6. Andere zentrale Nervensystem Regionen und periphere Organgewebe aus transgenen PER2:: LUC Tiere können leicht zu erhalten, kultiviert und im Hinblick auf die molekularen Schwingungen analysiert, wie die PER2:: LUC Ausdruck weiterhin für viele Tage auch oszillieren in einer Reihe anderer Gewebe und Zell-Typen 10. Die meisten dieser peripheren Geweben, zum Beispiel Leber, benötigen keine Membran für das Überleben, sondern werden gezüchtet direkt in das Medium 11 getaucht. Bitte beachten Sie, dass Phasenverschiebung durch Schneiden, Kultivierung und mittlere Austausch kann nicht nach den gleichen Grundsätzen wie bei SCN.

Bedeutung

In transgenen Mäusen und Ratten-Stämme (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) Luciferase-Enzymaktivität spiegelt Protein oder Genexpression Rhythmen und kann durch Biolumineszenz Aufnahme beurteilt werden. Die Luciferase-generated Biolumineszenz gibt ein schwaches Signal, aber der Hintergrund Lumineszenz ist nahe Null, so dass diese Methode von Vorteil. Darüber hinaus, da die Luciferase-Molekül instabil und schnell abgebaut wird es keinen phOtotoxizität, die während einer langfristigen erregenden Beleuchtung 28 angezeigt werden können. Zusammengenommen ermöglichen diese Eigenschaften dauerhaft Experimente machen die Luciferase-Reporter-Technologie sehr vorteilhaft in circadianen Forschung.

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

FONCICyT 000000000091984;; die Grundlagen der Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist und Sigurd och Elsa Diese Arbeit wurde von der schwedischen Medical Research Council (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3) finanziert Goljes Minne und schwedischen Society of Medicine SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, ist dankbar für die wertvollen Hinweise zum Manuskript anerkannt. Wir danken Dr. Michael Andäng und Dr. Helena Johard für die HCN-Kanal-Blocker, und Prof. Abdel El-Manira für die Bereitstellung von Video-Mikroskop.

Ethische Überlegungen:

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Karolinska Institutet und "Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd" set durchgeführt. Alle Tierversuche werden mit der Absicht durchgeführt, um mögliche Belastungen oder Unbehagen, das Tier zu minimieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B27-Zusatz 50xInvitrogen17504-044
DeckgläserMenzel-Glaser40#1≈ 40 mm
KulturschalenEMD MilliporePICMORG500,4 μm
DMEM mit niedrigem Glukosegehalt ohne PhenolrotSigma-AldrichD2902Pulver für 1 L
FilterpapierWhatman, GE Healthcare1003 055≈ 55 mm
FiltrationssetCorning431097Porengröße 0,22 μm Polyethersulfon
PinzetteAllgaier Instrumente0203-7-PSDumont #7
HEPESInvitrogen15630-056100 ml
HBSS 10xInvitrogen14065-049500 ml
NaOCH3 7,5 %Invitrogen25080-06050 ml
LuciferinPromega Corp.E1602Beetle-Luciferin, Kaliumsalz
Kleiner RongeurAllgaier Instrumente332-097-140
PenStrep 10.000 U/mlInvitrogen15140-122100 ml
Petri-SchalenCorning430165≈ 35 mm
PMTHamamatsu Corp.H9319-11MOD
Einweg-SkalpelleParagonP503Größe 11
VakuumfilterFisher Scientific09-761-5
VakuumfettDow Corning50 g
VibratomCampden Instruments

Referenzen

  1. Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
  2. Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
  3. Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
  4. Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
  5. Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
  6. Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
  7. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  8. Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  9. Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
  10. Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
  11. Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
  12. Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
  13. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
  15. O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
  16. Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
  17. Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
  18. Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
  19. LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
  20. Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
  21. Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
  22. Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
  23. Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
  24. Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
  25. Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
  26. Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
  27. Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
  28. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).

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Schlagwörter

Organotypische GewebekulturVorbereitung von HirnschnittenPER2 LUCIFERASE M useBiolumineszenzmessungAnalyse des circadianen RhythmusDetektion mittels Photomultiplier R hreGewebekultivierung auf Membranen
Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus
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