Dieses Protokoll zeichnet ein Weg, um Etiketten und Spurenelemente das Schicksal der kleinen Gruppen von Zellen Zebrafischembryonen mit UV-Uncaging der Käfig Fluorescein, durch whole mount Immunomarkierung, um das Signal aus dem uncaged Fluoreszein verstärken gefolgt.
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Methodenartikel
Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran
In diesem Artikel
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein zentrales Problem in der Entwicklungsbiologie ist es, den Ursprung der unzähligen Zelltypen, die in Wirbeltieren wie sie sich aus undifferenzierten Vorstufen entstehen abzuleiten. Die Forscher haben verschiedene Methoden der Linie Kennzeichnung, wie DiI Markierung 1 und Druck Injektion nachvollziehbar Enzyme 2 bis festzustellen Zellschicksal in späteren Stadien der Entwicklung in Modellsystemen eingesetzt. Die ersten Schicksal Karten im Zebrafisch (Danio rerio) wurden von iontophoretischen Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, wie Rhodamin Dextran montiert, in einzelne Zellen in diskreten Regionen des Embryos und Tracing der markierten Zelle das Schicksal im Laufe der Zeit 3-5. Während wirksam sind diese Methoden technisch anspruchsvoll und erfordern eine spezielle Ausrüstung nicht allgemein in Zebrafisch-Forschungsgruppen gefunden. In jüngster Zeit sind photoconvertable fluoreszierende Proteine, wie Eos und Kaede, die irreversibel von grünen Schalter auf rote Fluoreszenz bei UV-Licht ausgesetzt, sehen verstärkten Einsatz im Zebrafisch 6-8. Die optische Klarheit der Zebrafisch-Embryos und die relative Leichtigkeit der Transgenese haben diese besonders attraktiv Werkzeuge für die Linie Etikettierung gemacht und die Migration von Zellen in vivo 7 zu beobachten. Trotz ihrer Nützlichkeit, haben diese Proteine auch einige Nachteile auf Farbstoff-vermittelte Linie Kennzeichnung Methoden verglichen. Der wichtigste ist die Schwierigkeit, die wir bei der Beschaffung von hoher 3-D-Auflösung während Photokonversion dieser Proteine gefunden haben. In diesem Licht, vielleicht die beste Kombination aus Auflösung und Benutzerfreundlichkeit für Linie Kennzeichnung im Zebrafisch nutzt Käfig Fluorescein Dextran, einem Fluoreszenzfarbstoff, die zu einer Löschung Gruppe gebunden ist, dass Masken seine Fluoreszenz 9. Der Farbstoff kann dann "uncaged" (veröffentlicht von der Löschung Gruppe) innerhalb einer bestimmten Zelle mit UV-Licht von einem Laser-oder Quecksilber-Lampe, so dass Visualisierung der Fluoreszenz-oder Immundetektion. Im Gegensatz zu iontophoretischen Methoden können caged Fluorescein mit Standard-Einspritzvorrichtungen injiziert werden und uncaged mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Lochkamera 10 ausgestattet. Darüber hinaus erkennen Antikörper gegen Fluorescein nur die uncaged Form, und das Epitop überlebt Fixierung gut 11. Schließlich kann im Käfig Fluorescein mit einer sehr hohen 3-D-Auflösung aktiviert werden, besonders dann, wenn der Zwei-Photonen-Mikroskopie 12,13 eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode der Linie Kennzeichnung von caged Fluorescein und Laser Uncaging. Subsequenctly ist uncaged Fluorescein gleichzeitig mit anderen Epitope wie GFP durch Markierung mit Antikörpern nachgewiesen.
Protokoll
1. Synthese von Fluorescein Dextran Caged
- Messen Sie 3,5 bis 4 mg Aminodextran und fügen in die Invitrogen bereitgestellte getönte Röhre mit 1 mg CMNB-Käfig Fluorescein SE. In unseren Händen dieses Verhältnis ergibt eine durchschnittliche Belastung von ~ 2,5 Farbstoffmoleküle pro Dextran.
- Add 500 ul von 0,1 M Na 2 B 4 O 7 (Natriumborat) Puffer, um das Rohr.
- Cap und Vortex für 30 Sekunden, um die Aminodextran und eingesperrt Fluorescein aufzulösen.
- Lassen Sie reagieren über Nacht auf einem Vortex-Mischer.
- Twist off unten Schließung auf einer Zeba Spin-Säule und lösen Sie die Kappe. Mar....
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Diskussion
Wie beschrieben, stellt dieses Protokoll eine relativ schnelle Linie Kennzeichnung Methode in Zebrafisch, dass bei den üblicherweise verwendeten Techniken der Mikroinjektion, Mikroskopie und Immunfluoreszenz gebaut wird. Wir haben festgestellt, dass Laser auf die effizienteste und kostengünstigste Weg, um Fluorescein in einer lokalisierten Mode Uncage werden Uncaging. Diese Methode könnte auf Linie Etikett mit experimentellen Endpunkte werden so spät wie 4 dpf verwendet. Doch wie sich Zellen teilen, die caged-Fluorescei.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir möchten Dan Carlin für Hilfe bei der Herstellung Käfig Fluorescein. Darüber hinaus möchten wir die folgenden Finanzierungsquellen danken: Vanderbilt University Medical School Program für Entwicklungsbiologie Training Grant zu JAC und NIH HD054534to JTG.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CMNB-gefangener Fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| Aminodextran, 10 kDa | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba-Desalz-Spin-Säulen | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Ziegen-Anti-Fluorescein-Antikörper | Invitrogen | A11095 | |
| Alexa Fluor 633 Esel-Anti-Ziege-Antikörper | Invitrogen | A21082 | |
| Petrischalen, 35 mm × 10 mm | BD Biosciences | 351008 | |
| Aufrechtes Compound-Mikroskop mit 40x-Wasserimmersionsobjektiv | Leica Microsystems | DM6000B | |
| Manuelles Laser-Belichtungssystem MicroPoint | Photonic Instruments | ||
| Phenylthioharnstoff (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Proteinase K | Roche Group | 03115836991 | |
| Kunststofffaden | Jeder Lieferant | ||
| Agarose | Research Products International Corp. | A20090 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Savant SPD131DDA | |
| Vortex-Mixer | VWR international | Vortex Genie 2 | |
| Druckinjektor | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Referenzen
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 5/25/2011. Citeable Link.
A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:
Ilya A. Shestopalov and James K. Chen
instead of:
Ilya Shestopalov and James Chen
