Eine neue Methode zur Ovarialfollikel Kapselung in einer 3D-Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk beschrieben. Dieses System kombiniert strukturelle Unterstützung mit proteolytischen Abbau der Entwicklung von unreifen Follikeln Unterstützung, um zu reifen Eizellen zu produzieren. Diese Methode kann zur Kultur Zellaggregate angewendet werden, um Zell-Zell-Kontakte ohne Beschränkungen für die Ausweitung aufrecht zu erhalten.
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Methodenartikel
Eine Methode zur Ovarialfollikel Encapsulation und Kultur in einem Proteolytisch Degradable 3 Dimensional-System
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Ovarialfollikel ist die funktionelle Einheit des Eierstocks, dass Sexualhormone absondert und unterstützt Eizellreifung. In-vitro-Follikel-Techniken bieten ein Werkzeug zur Modellierung Follikelentwicklung, um Grundlagen der Biologie zu untersuchen, und werden weiter als eine Technik, um die Fruchtbarkeit in der Erhaltung entwickelt Klinik 1-4. Unsere in vitro-Kultur-System nutzt Hydrogele, um die einheimischen Eierstock-Umgebung durch die Beibehaltung des 3D-follikuläre Architektur, Zell-Zell-Interaktionen und parakrine signalisiert, dass direkte Follikel Entwicklung 5 zu imitieren. Bisher wurden Follikel erfolgreich in Alginat, einem inerten Algen gewonnene Polysaccharid, dass die Gelbildung unterzogen mit Calciumionen 6-8 kultiviert. Alginat-Hydrogele in einer Konzentration von 0,25% w / v gebildet waren die permissive für Follikel Kultur, und behielt die höchste Entwicklungskompetenz 9. Alginat-Hydrogele sind nicht abbaubar und somit eine Erhöhung der Follikel Durchmesser ergibt sich eine Druckkraft auf die Follikel, Follikel Wachstum 10 auswirken können. Wir Folge entwickelte eine Kultur, das auf einem Fibrin-Alginat durchdringendes Netzwerk (FA-IPN), in dem eine Mischung aus Fibrin und Alginat gleichzeitig gelierte basiert. Diese Kombination bietet eine dynamische mechanische Umwelt, weil beide Komponenten Matrix Steifigkeit beitragen zunächst, allerdings verschlechtern Proteasen, die durch den wachsenden Follikel sezerniert Fibrin in der Matrix so dass nur Alginat zu unterstützen. Mit dem IPN, kann das Alginat-Gehalt unter 0,25%, was nicht mit Alginat allein 5 möglich reduziert werden. So, wie die Follikel erweitert, wird sie erleben eine reduzierte Druckkraft aufgrund der geringeren Feststoffgehalt. Hier beschreiben wir eine Kapselung Verfahren und eine in-vitro-Kultur-System für Eibläschen in einem FA-IPN. Die dynamisch-mechanischen Umfeld ahmt die natürliche Eierstock-Umfeld, in dem kleine Follikel in eine starre Kortex befinden und bewegen, um eine permissive Medulla als sie erhöhen in Größe 11. Die abbaubaren Komponente kann als besonders kritisch für die klinische Übersetzung, um die größer als 10 6-fachen Anstieg des Volumens, dass die menschliche Follikel in der Regel durchlaufen in vivo zu unterstützen.
Protokoll
1. Follikel Isolation
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die National Institutes of Health Guide Set für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die etablierten institutionellen Tiere Benutzung und Pflege-Protokoll an der Northwestern University durchgeführt.
Für optimale Ergebnisse sind alle Sektionen in L15 Medien zur pH-Kontrolle bei Umgebungstemperaturen von CO 2 durchgeführt, auf 37 ° C erhitzt, Stadien für die Temperaturregelung und auf einer sauberen Werkbank, um bakterielle Verunreinigungen zu minimieren. Die Dissektion Medien (DM) ist m....
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Diskussion
Die vorgestellten Ovarialfollikel Verkapselungsmethode in einem FA-IPN ermöglicht Follikel Kultur in einer 3D-Umgebung in vitro. Ein FA-IPN ist ein dynamisches, Zell-responsive Matrix, in der die ersten mechanischen Eigenschaften durch die Kombination der beiden Fibrin und Alginat bestimmt werden. Während der Kultur, aktiviert die gekapselte Follikel Proteasen, die nur eine Komponente des IPN, das Fibrin, das in einer allmählich abnehmenden Gel Steifigkeit, die ausschließlich durch die restlichen Alginat am End.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom NIH (U54HD41857 und PL1EB008542, ein P30 Biomaterialien Kern innerhalb der Oncofertility Consortium Roadmap Zuschuss) gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fetuin | Sigma-Aldrich | F3385 | |
| FBS | Invitrogen | 10082-139 | |
| Aprotinin | Roche Group | 10236624001 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00475 | 40 mM |
| EGF | Sigma-Aldrich | A412 | |
| rFSH | National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases | ||
| hCG | Sigma-Aldrich | CG-5 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I1884-1VL | |
| L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM+Gluta MAX | GIBCO, by Life Technologies | 32561 | |
| Pen-Strep | Cellgro | 30-002-CI | |
| TBS | Pierce, Thermo Scientific | 28379 | |
| Tisseel-Fibrin-Kit | Baxter Internationl Inc. | 921030 | |
| Natrium-Alginat | FMC BioPolymers | LF200DL | Mw 418kDa |
Referenzen
- Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).
- Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X.
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Nachdrucke und Genehmigungen
