Ein effizientes Verfahren zur Oligomerisierung Neigung der Single-Pass-Transmembrandomänen (TMD) zu beurteilen ist beschrieben. Chimäre Proteine, bestehend aus dem TMD fusioniert ToxR sind in einer E. coli-Stamm-Reporter zum Ausdruck gebracht. TMD-induzierte Oligomerisierung Ursachen Dimerisierung von ToxR, Aktivierung der Transkription und Produktion von der Reporter-Proteins,-Galactosidase.
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Methodenartikel
Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die vereinfachte Sicht von Protein Transmembrandomänen lediglich als Anker in Phospholipid-Doppelschichten ist längst widerlegt. In vielen Fällen membrandurchspannende Proteine hochentwickelten Wirkmechanismen entwickelt. 1-3 Ein Weg in die Membranproteine modulieren ihre Strukturen und Funktionen können durch direkten und konkreten Kontakt der hydrophoben Helices bilden strukturierte transmembrane Oligomere. 4,5 Großteil der jüngsten Arbeit über die Verteilung der Aminosäuren bevorzugt in der Membran-Umgebung im Vergleich zu wässrigen Lösung und die verschiedenen intermolekularen Kräfte, die Fahrt Protein-Assoziation. 6,7 Trotzdem Studien der molekularen Erkennung an der Transmembrandomäne von Proteinen immer noch hinter denen der Schwerpunkt gefunden wasserlöslichen Regionen. Eine große Hürde bleibt: Trotz der bemerkenswerten Spezifität und Affinität, die transmembrane Oligomerisierung erreichen können, 8 direkte Messung ihrer Vereinigung ist eine Herausforderung. Traditionelle Methoden angewendet, um das Studium integrale Membranprotein-Funktion kann durch die inhärenten Unlöslichkeit der Sequenzen unter Prüfung behindert werden. Biophysikalische Erkenntnisse aus dem Studium synthetischer Peptide, die Transmembrandomänen gewonnen werden können nützliche strukturelle Einsicht. Allerdings ist die biologische Relevanz des Waschmittels mizellaren oder Liposomen-Systeme in diesen Studien verwendet werden, um Zellmembranen imitieren oft in Frage gestellt; tun Peptide Annahme eines nativen Struktur unter diesen Bedingungen und hat ihre funktionale Verhalten wirklich die Wirkungsweise in einer nativen Membran ? Um die Wechselwirkungen von Transmembran-Sequenzen in natürlichen Phospholipid-Doppelschichten Studie entwickelten die Langosch Labor ToxR transkriptionelle Reporter-Assays. 9 Die Transmembrandomäne von Interesse, wie eines chimären Proteins mit Maltose-Bindungsprotein für die Lage auf dem Periplasma und ToxR ausgedrückt wird, um einen Bericht zu der Grad der Oligomerisierung (Abbildung 1).
In den letzten zehn Jahren mehrere andere Gruppen (zB Engelman, DeGrado, Shai) weiter optimiert und wandte diese ToxR Reporter-Assay. 10-13 Die verschiedenen ToxR Assays haben sich zu einem Goldstandard, um Protein-Protein-Interaktionen in Zellmembranen zu testen. Wir hier zeigen einen typischen experimentellen Betrieb in unserem Labor, die vor allem folgende Protokolle, die von Langosch entwickelt durchgeführt. Diese allgemein anwendbare Methode für die Analyse der Transmembrandomäne Selbstassoziation in E. sinnvoll coli, wo β-Galaktosidase Produktion verwendet werden, um die TMD Oligomerisierung Neigung zu beurteilen ist. Bei TMD-induzierte Dimerisierung bindet ToxR die ctx-Promotor verursacht up-Regulierung des LacZ Gen für β-Galactosidase. Eine kolorimetrische Ablesung wird durch Zugabe von ONPG zu lysierten Zellen erhalten. Hydrolytische Spaltung von ONPG von β-Galactosidase Ergebnisse in die Produktion von dem Licht absorbierenden Spezies o-nitrophenolat (ONP) (Abbildung 2).
Protokoll
1. Cloning Überlegungen
- Kommerziell hergestellte Oligonukleotide, die die TMD von Interesse durch NheI und BamHI Restriktionsstellen und 5'-phosphorylierten flankiert können in pTox7 (modified in unserem Labor durch Insertion von einem Basenpaar direkt nach dem BamHI 14) (Abbildung 3) verdaut nacheinander ligiert werden mit BamHI und NheI. Ein Beispiel Oligonukleotid ist unten dargestellt:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 "
3 'gTMDSEQUENCEcctag5 "
Die TMD-Sequenz sollte 12-24 Rückstände (kürzere Sequenzen wird vermutlich durch den Vektor kodierten hydrophobe Reste verlängert werden). Um die Schnittstelle zu unter....
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Diskussion
Die ToxR transkriptionelle Reporter-Assay ist eine einfache Möglichkeit, transmembrane Sequenzen mit dem Potenzial, oligomerisieren identifizieren. Da die Wechselwirkungen innerhalb der bakteriellen inneren Membran stattfindet, umgeht diesen Test die Probleme mit der Gültigkeit der Untersuchung von Systemen in Membran-Mimetikum-Umgebungen. Da das Klonen von mehreren TMDs in einem einzigen Plasmid leicht können parallel ausgeführt werden und der gesamte Test kann in 96-Well-Platte-Format durchgeführt werden, kann dieser .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken den National Institutes of Health (1R21CA138373 und Stand Up to Cancer (SU2C) für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit. HY ist dankbar für das Geschäftsjahr 2009 Elion Award von der American Association of Cancer Research, ein Kimmel Scholar Award der Sidney Kimmel Stiftung für Cancer Research (SKF-08 bis 101) und der National Science Foundation Fakultät Early Career Award (NSF0954819).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| BamHI Restriktionsenzym | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen Enzyme erwiesen sich als effizienter als alternative Lieferanten |
| NheI Restriktionsenzym | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen Enzyme erwiesen sich als effizienter als alternative Lieferanten |
| 15 mL Kulturröhrchen | Fisher Scientific | 14 bis 956-1J | |
| SOC-Medium | Teknova | S0225 | Bis das entsprechende Volumen auf und sterilisiert durch Autoklavieren. |
| LB-Medium | Sigma-Aldrich | L7275 | Bis das entsprechende Volumen auf und sterilisiert durch Autoklavieren. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO 3 78 | Stammlösung von 30 mg / mL in Ethanol in Gefrierschrank gelagert |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stammlösung von 2,5% (w / v) in Wasser im Gefrierschrank gelagert |
| Na 2 HPO 4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH 2 PO 4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Chemicals | 6858-06 | |
| MgSO 4 .7 H 2 O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranosid (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-Puffer | 16,1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g KCl 0.246g MgSO 4 Machen Sie bis zu 1 l, pH 7,0 | ||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-Mercaptoethanol, 2 mL Chloroform, machen bis zu 20 ml mit Z-Buffer. Vortex für 1 min, Zentrifuge für 1 min bei 800 Umdrehungen pro Minute. Machen Sie für jede Platte frisch. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS in 10 mL Z-Puffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-Buffer. Machen Sie für jede Platte frischer | ||
| β-Mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoklonalen Antikörper (HRP-konjugiert) | NEB | E8038S | |
| Minimal-Medien mit Maltose | 1 x M9-Salze, 0,4% Maltose, 1 mg / mL Thiamin, 2 mM MgSO 4 | ||
| 96-well Flachboden Platte | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Plate-Reader | Beckman Coulter | DTX880 Multimode-Detektor | |
| Wasserbad | VWRI | 89032-204 | |
| Schüttelinkubator | FormaScientific |
Referenzen
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T.
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Nachdrucke und Genehmigungen
