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1. Cloning Überlegungen
- Kommerziell hergestellte Oligonukleotide, die die TMD von Interesse durch NheI und BamHI Restriktionsstellen und 5'-phosphorylierten flankiert können in pTox7 (modified in unserem Labor durch Insertion von einem Basenpaar direkt nach dem BamHI 14) (Abbildung 3) verdaut nacheinander ligiert werden mit BamHI und NheI. Ein Beispiel Oligonukleotid ist unten dargestellt:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 "
3 'gTMDSEQUENCEcctag5 "
Die TMD-Sequenz sollte 12-24 Rückstände (kürzere Sequenzen wird vermutlich durch den Vektor kodierten hydrophobe Reste verlängert werden). Um die Schnittstelle zu untersuchen, sollten vier Varianten des TMD-Design erstellt, wo sequenzielles Rest Insertionen und Deletionen gleichzeitige Rückstände Ergebnis in Rotation der TMD bezogen auf ToxR. 15,16 Schließlich wird die Arabinose-Konzentration zwischen 0,001 und 0,01% variiert werden sollten (w / v) zu Ermittlung der Konzentration, wo maximale Unterschiede in β-Galactosidase-Signale zwischen verschiedenen TMD Sequenzen beobachtet werden; Testen verschiedener Expression wird empfohlen, unter welchen Bedingungen unterschiedliche Affinitäten am besten unterschieden werden identifizieren können. Neben Arabinose und Antibiotika, können 0,4 mM IPTG verwendet werden, um Unterschiede in der Affinität zwischen verschiedenen TMDs zu verbessern. Die ToxR Messung sollten mindestens in vierfacher Ausfertigung durchgeführt werden. Der ganze Vorgang sollte mindestens dreimal mit verschiedenen Plasmid-Transformationen wiederholt werden.
2. Das Wachstum von Bakterienkulturen
- Vorsichtig auftauen FHK12 kompetente Zellen (200 ul) auf Eis und Überführung in eine 15 ml Kultur Röhre. Add Plasmid-DNA (200 ng) und inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 30 min.
- Hitze-Schock-Zellen durch Inkubation für 90 s bei 42 ° C, durch Inkubation auf Eis für 2 min folgte.
- Add SOC Media (800 ul) und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) für eine h.
- Impfen 5 ml LB-Medium mit Chloramphenicol (30 ug / ml) und Arabinose (0,0025% w / v) mit 50 ul der Transformation Mischung in 15 ml Kulturröhrchen in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren Proben bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) für 20 h. (Alternativ 5 ul der Kultur kann zu 100 ul Medium in einer 96-Well-Platte zu impfen. Diese Methode ist nützlich, wenn es mit einer großen Anzahl von Proben, obwohl Fehler wird etwas höher sein. Um die Verdunstung, die führen würde vermeiden um Fehler, füllen Sie die äußersten Brunnen mit Medien, sondern verwenden sie nicht für die Proben. Schließlich, Doppel-wrap die Verbindung zwischen dem Deckel und die Platte mit Parafilm).
3. Die Messung der β-Galactosidase-Aktivität
- Heizen Sie den Platten-Leser bis 28 ° C.
- Übertragen Sie die Z-Buffer in ein Reservoir mit einem großen Pipettenspitze, achten Sie darauf, nehmen nur die obere (wässrige Schicht). Transfer 100 ul frisch zubereitet Z-buffer/chloroform in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Transfer-5 ul jeder Kultur in die Vertiefungen der Platte in vierfacher Ausfertigung. Lassen Sie die Kultur von vier Brunnen, die als leere dienen wird.
- Messen Sie die OD 595 von der Platte auf die Zelldichte zu bestimmen.
- Add 50 ul Z-buffer/SDS in alle Vertiefungen der Platte. Schütteln Sie die Platte in der Platte-Reader für 10 min auf die Zellen zu lysieren. Sicherstellen, dass die Zell-Suspensionen sind nach der Lyse klar und wiederholen das Schütteln Schritt, wenn erforderlich. Unvollständige Lyse schlägt die Z-buffer/chloroform nicht frisch zubereitet.
- Dann werden 50 ul frisch zubereiteten Z-buffer/ONPG in alle Vertiefungen und kehren die Platte auf die Platte Leser und messen OD 405 alle 30 s für 20 min.
- Berechnen Sie β-Galactosidase-Aktivität mit der folgenden Gleichung (wir erinnern uns, um die leeren subtrahieren). Das Verhältnis von OD 405 / min sollte anhand aller Datenpunkte in der OD 405 Bereich von 0,0 bis 1,0 unter Verwendung eines linearen Modells angepasst werden.
Miller Einheiten unterscheiden sich manchmal, wenn an verschiedenen Tagen aufgenommen. Deshalb sollte eine Referenz zu konstruieren, wie GpA in jeder Prüfung zu messen. Die Werte können für die Normalisierung der ToxR Werte verwendet werden.
4. Steuerung für die Proteinexpression
- Führen Western-Blot, auch Protein-Expression von Konstrukten zu überprüfen. Kombinieren Sie 50 ul des dreifachen Kulturen und Zentrifuge (2000 rpm, 4 min) in einer Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette resuspendieren und die verbleibende Pellet in 2 x Probe Ladepuffer.
- Last 7,5 ul auf einem Standard 8% Gel und Durchführung Elektrophorese bei 125 V für 1 Stunde 5 min. Nach der Übertragung mit anti-MBP HRP-konjugierten Antikörper inkubiert und zu visualisieren, die chimäre Protein ist bei ca. 70 kDa mit einigen Abbauprodukte manchmal um 48 kDa zu sehen beobachtet. Endogene MBP ist auch bei 45 kDa beobachtet (siehe Abbildung 5).
5. Control für Proper Membraninsertion
Eine Zelllinie Mangel an Maltose bindendes Protein verwendet wird, um eine ordnungsgemäße Membraninsertion des chimären TMD konstruieren zu beurteilen. Wenn auf Minimalmedium mit Maltose gewachsen als alleinige Kohlenstoff-Quelle, Ausdruck nur Zellen eine Membran-Integral-Ausdruck Produkt mit Maltose-Bindungsprotein richtig in das Periplasma befindet sind in der Lage zu wachsen.
- Transform PD28-Zellen (wie bei FHK12 Zellen beschrieben) und impfen 2 ml LB-Medium. Wachsen die Zellen bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) über Nacht.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 3500 rpm, 10 min, 4 ° C und Waschen durch Resuspendieren in PBS (2 ml) durch vorsichtiges Pipettieren mit einer großen Spitze oder sanfte Vortexen. Pellet den Zellen (wie oben), mit PBS waschen ein zweites Mal, Pellet-und schließlich in PBS (1 ml) resuspendieren.
- Verwenden Sie 25 ul der resuspendierten Zellen in 5 ml Minimalmedium in dreifacher Ausfertigung und bei 37 zu impfen ° C unter Schütteln (300 rpm). Nehmen OD 595 Lesungen zwischen 15-25 h, ca. alle 2 Stunden durch die Übertragung von 200 ul von jeder Probe in eine 96-Well-Platte und das Lesen mit dem Platten-Leser.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für die Verwendung des ToxR transkriptionelle Reporter-Assay auf die Oligomerisierung Neigung von Transmembrandomänen in Abbildung 4 zu analysieren. Bisher haben wir die Oligomerisierung von Transmembrandomänen von untersuchten die multispanning Membran-Integral-Protein latent membrane protein-1 (LMP-1) durch verschiedene Techniken, darunter ToxR 14 Transmembrandomäne fünf (TM5) wurde gezeigt, dass eine starke Neigung zur Oligomerisierung aufweisen.; Diese zeichnet sich durch hohe Miller Units, vergleichbar mit der positiven Kontrolle, GPA, eine gut etablierte Dimerisierung Sequenz gezeigt. Eine Mutation in TM5, D150A, reduziert die Fähigkeit der Sequenz oligomerisieren. LMP-1 TM1 nicht wesentlich oligomerisieren und weist einen sehr niedrigen Miller Einheit Signal, gerade über das Signal für leere, nicht-transformierten Zellen FHK12.
Abbildung 1. Cartoon Darstellung der ToxR Reporter-Assay. Transmembrandomäne (TMD) angetrieben Oligomerisierung Ergebnisse in Dimerisierung von ToxR und Aktivierung von LacZ Transkription. Das Genprodukt von LacZ, können β-Galactosidase als Maß für die Neigung einer TMD zu oligomerisieren quantifiziert werden.
Abbildung 2. Die hydrolytische Spaltung von ONPG von β-Galactosidase Ergebnisse in die Produktion von dem Licht absorbierenden Spezies o-nitrophenolat (ONP).
Abbildung 3. Plasmidkarte von pToxR7.
Abbildung 4. Representative ToxR transkriptionelle Reporter-Assay Analyse der Oligomerisierung Neigung der latent membrane protein-1 Transmembrandomänen. Transmembrandomäne 5 (TM5) oligomerisiert stark, während Transmembrandomäne 1 (TM1) zeigt nur eine schwache Wechselwirkung. Mutation D150A in TM5 reduziert seine Fähigkeit zur Oligomerisierung. GPA ist als eine positive Kontrolle Sequenz für starke Dimerisierung enthalten. Blank stellt transformierten FHK12 Zellen.
Abbildung 5. Western Blot für die Proteinexpression.
Abbildung 6. PD28 Komplementation Test auf korrekte Membraninsertion in das Periplasma zu kontrollieren. Negative Kontrolle stellt ein Konstrukt Mangel an Maltose bindendes Protein.