Die Messung der Aggregate Zusammenhalt durch Gewebeoberfläche Tensiometrie

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Bindungsenergie, ausdrückbar als Gewebe Oberflächenspannung zwischen den Zellen in 3D-Gewebe-like-Aggregate. Unterschiede im Gewebe Oberflächenspannung wurde gezeigt, dass mit Invasivität der Lunge, Muskel-und Hirntumoren zu korrelieren, und sind von grundlegender Bedeutung Determinanten der Gründung räumlichen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zelltypen.

Zusammenfassung

Der objektiven Messung von interzellulären Bindungsenergie kann nur mit Methoden in thermodynamischen Prinzipien in Systemen geerdet im Gleichgewicht sein. Wir haben Gewebeoberfläche Tensiometrie (TST) entwickelt speziell auf die freie Oberflächenenergie der Interaktion zwischen Zellen zu messen. Die biophysikalischen zugrunde liegenden Konzepte TST wurden bereits im Detail ^1,2 beschrieben. Die Methode beruht auf der Beobachtung, dass beide Seiten geschlossene Zellen, wenn in Schüttelkultur gepflegt wird spontan in Cluster zusammenbauen basiert. Mit der Zeit werden diese Cluster Runde bis zu Kugeln zu bilden. Diese Aufrundung Verhalten imitiert das Verhalten charakteristisch für flüssigen Systemen. Interzelluläre Bindungsenergie wird durch Zusammendrücken sphärische Aggregate zwischen parallelen Platten in einem speziell entwickelten Gewebe Oberfläche Tensiometer gemessen. Das gleiche mathematische Gleichung benutzt, um die Oberflächenspannung einer flüssigen Tropfen messen wird verwendet, um die Oberflächenspannung von 3D-Gewebe-like kugelförmigen Aggregaten zu messen. Die zelluläre Äquivalent von Flüssigkeit Oberflächenspannung interzellulären Bindungsenergie, oder allgemeiner, Gewebe Kohäsivität. Frühere Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass Gewebe Oberflächenspannung (1), wie zwei Gruppen von embryonalen Zellen miteinander interagieren ^1-5, (2) können einen starken Einfluss auf die Fähigkeit von Geweben mit Biomaterialien ⁶ zusammenwirken, (3) kann prognostiziert nicht nur durch direkte Manipulation von Cadherin-basierten interzellulären Zusammenhalt ^7, sondern auch durch Manipulation der wichtigsten ECM-Moleküle wie FN ^8-11 und 4) verändert werden korreliert mit invasive Potential von Lungenkrebs ^12, Fibrosarkom ^13, Gehirntumor ¹⁴ und Prostata-Tumor Zell-Linien ^15. In diesem Artikel werden wir das Gerät beschrieben und detailliert die Schritte erforderlich, um Sphäroide zu generieren, um die Sphäroide in das Tensiometer Kammer laden, zu aggregieren Kompression zu initiieren und zu analysieren und zu validieren das Gewebe Messung der Oberflächenspannung erzeugt.

Protokoll

1. Aggregate Vorbereitung für die Messung von Gewebe Oberflächenspannung.

Für adhärente Zellen können Sphäroide entweder mit dem hängenden Tropfen-Methode oder durch die Erzeugung eines kohärenten Blatt von Zellen, die dann in 1 mm-Fragmente geschnitten werden können gebildet werden.

Aggregatbildung durch die hängenden Tropfen-Methode:

1. Near-konfluenten adhärenten Zellkulturen zu 90% Konfluenz sollten angebaut werden sollten, worauf Monoschichten zweimal mit PBS gespült werden. Nach dem Ablassen gut, fügen Sie 2 ml (für 100 mm-Platten) von 0,05% Trypsin-1 mM EDTA, und bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen. Stoppen Trypsinierung durch Zugabe von 2 ml Vollmedium und sanft mit einem 5 ml-Pipette auf die Mischung verreiben, bis die Zellen in Suspension. Transfer-Zellen auf eine 15 ml konischen Rohr.
2. Add 40 ul einer 10 mg / ml DNAse Stammlösung und Inkubation für 5 Minuten bei RT. Vortex kurz und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten.
3. Überstand verwerfen und Pellet waschen mit 1 ml komplettem Zellkulturmedium. Wiederholen Sie dann die Zellen in 2 ml komplette Zellkulturmedium.
4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer oder automatisierte Zellzahl und passen Konzentration auf 2,5 x 10 ⁶ Zellen / ml.
5. Entfernen Sie den Deckel von einem 60 mm Gewebe-Kulturschale und Platz 5 ml PBS in den Boden der Schale. Dies wird als Hydratation Kammer handeln.
6. Drehen Sie die Deckel und die Verwendung eines 20 ul Pipette zu 10 ul Tropfen auf der Unterseite des Deckels zu hinterlegen. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander entfernt sind so platziert, wie nicht zu berühren. Es ist möglich, mindestens 20 Tropfen pro Teller platzieren.
7. Drehen Sie die Deckel wieder auf das PBS-gefüllten unteren Kammer und bei 37 ° C / 5% CO ₂ / 95% Luftfeuchtigkeit, überwachen die Tropfen täglich und inkubieren, bis entweder Zellschichten oder Aggregate gebildet haben.
8. Sobald Blätter zu bilden, sie können, um mit rundem Boden Glas Schüttler übertragen werden Kolben mit 3 ml Vollmedium und inkubiert in einem Schüttel-Wasserbad bei 37 ° C und 5% CO ₂ bis Sphäroide zu bilden.

Aggregatbildung durch die Zellschicht Methode:

9. Einzel-Zellsuspensionen werden wie oben beschrieben, aber Konzentration auf 1x10 ⁶ Zellen / ml eingestellt.
10. Transfer 3 ml der Zellsuspension auf 10 ml Rundkolben (Belco, Vineland, NJ).
11. Inkubieren Flaschen in einem Kreisel Wasserbad / Schüttler (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 4h bei 120 Umdrehungen pro Minute, bis die Zellen aus Trypsinierung erholen.
12. Transfer-Zellen, um ein Glas mit rundem Boden Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 200 X g in einen dünnen Pellets. Inkubieren für weitere 24 h, bis eine zusammenhängende Platte bildet.
13. Vorsichtig schwenken die Kultur Rohr zu verdrängen das Blatt und gießen Sie den Inhalt der Kultur Röhre in eine kleine, sterile Glas Gewebe Kulturschale.
14. Verwenden Sie Mikro-Skalpell, um die Blätter in Fragmente verschiedener Größen geschnitten.
15. Inkubieren Fragmente bei 37 ° C auf dem Wasserbad Kreiselbrecher Schüttler bei 120 rpm unter 5% CO ₂ für 2 bis 3 Tage oder bis sie kugelförmig.

2. Die Messung der gesamtwirtschaftlichen Oberflächenspannung

1. Die Gewebeoberfläche Tensiometer. Die Apparatur ist in Abb. dargestellt. 1 und 2. Die Kompression Zelle (Abb. 3) besteht aus zwei Kammern besteht. Die äußere Kammer (OC) ist ein 37 ° C Umwälzpumpe angeschlossen und dient dazu, die Temperatur der inneren Kammer (IC) zu regulieren. Die Kammern sind aus Delrin gefräst gebaut und enthalten Quarzfenster zur Visualisierung des Aggregats. Die untere Einheit (LA) Schrauben in die Basis der inneren Kammer und wird auf 1 verwendet) Position des Aggregats in der inneren Kammer, 2) Siegel der Unterseite der inneren Kammer, 3) heben das Aggregat zur Kompression zu initiieren, und (4 ) regeln den Abstand zwischen den parallelen Platten und damit die Verdichtung des Aggregats. Der zentrale Kern (CC) der Montage ist einstellbar. Die Spitze des zentralen Kerns (der Sockel) ist aus glattem Teflon bestehen und agiert als die untere Druckplatte (LCP). Die obere Druckplatte (UCP) ist ein Teflon Zylinder 15mm lang, die aus dem Gleichgewicht Arm hängt (B) durch eine Flamme-begradigt Nickel-Chrom-Draht (NCW) *. Im Verlauf eines Experiments wird die Zelle Aggregat (A) auf der unteren Platte positioniert und aufgewachsen, bis er an der oberen Platte. Die obere Platte ist, das Gleichgewicht Arm (B) verbunden. Compression des Aggregats bewirkt eine Verschiebung des Gleichgewichts Arm. Die Waage ist ein Cahn / Ventron Modell 2000 Aufnahme Elektrowaage, die auf der Nullabgleich-Prinzip arbeitet. Der Drehpunkt der Waage Arm hat einen Anker in einem permanenten Magnetfeld. Wenn die Balance in Betrieb ist, ist es kontinuierlich moduliert den Strom durch die elektromagnetische Montage, was wiederum hält die Balance Arm in die horizontale Position. Wenn ein Objekt aus dem Gleichgewicht Arm, die Spannung, die das Gleichgewicht gilt für den Arm in der liegenden ode halten suspendiertNTAL Position, ist proportional zum Objekt wiegen. Diese Spannung misst die externe Druckkraft aufgebracht, um das Aggregat. Das Aggregat der Form wird durch visuelle Beobachtung durch ein 25 x Nikon SMZ10A Stereoskop gekoppelt an einen Computer mit einem Framegrabber ausgestattet überwacht. Um die Adhäsion von Zellverbänden, die Druckplatten zu minimieren, sowohl die untere und obere Druckplatten wurden mit Poly (2-Hydroxyethylmethacrylat) {Poly (HEMA)}, einem polymeren Material, um die Zellen nicht beachtet ¹⁶ beschichtet.
   * Der Draht ist schwer gerade durch den Strang ein 15-Zoll Länge des Drahtes aus einer Retorte stand und Spannen eine kleine Binder Clip bis zum Ende. Ein Bunsenbrenner wird dann nach oben und laufen über die gesamte Länge des Drahtes, bis der Draht glüht rot. Die begradigt Draht kann dann in die entsprechenden Längen geschnitten werden. Ein kleiner Haken ist durch Biegen des Drahtes ca. ¼ eines Zoll vom Ende mit zwei Rasierklingen gebildet. Das andere Ende wird dann in den Lauf der unteren Druckplatte eingesetzt.
2. Aggregate Kompression.
   1. Der Innenraum ist mit vorgewärmten CO _{2-unabhängige} Zellkulturmedium (Gibco / BRL, NY) gefüllt.
   2. Aggregate mit einer Größe von etwa 200-300 μ auf der unteren Druckplatte (Abb. 4A) positioniert. Aggregate werden durch Absaugen ein Aggregat in Zellkulturmedium auf halber Höhe die Spitze einer Pasteurpipette mit einem Silikon-Glühlampe, die Übertragung der Pipette in die innere Kammer und der Positionierung der Spitze der Pipette über dem LCP geladen. Das Aggregat wird dann vorsichtig auf die LCP durch leichtes Drücken der Glühbirne vertrieben. Alternativ ist das Aggregat erlaubt, durch die Schwerkraft auf die LCP fallen.
   3. Die obere Druckplatte (UCP) ist über dem Aggregat positioniert und sich absetzen dürfen, zur Schaffung einer pre-Kompression deutlich UCP Gewicht Grundlinie.
   4. Das LCP wird dann erhöht, bis das Aggregat gegen die UCP (Abb. 4B) komprimiert wird. Einstellen der Höhe des inneren Kerns der unteren Apparat wird die Kontrolle verschiedener Grade der Komprimierung. Die Kompression ist durch Beobachtung durch ein Binokular mit einer CCD-Videokamera ausgestattet überwacht.
   5. Aggregate Bilder aufgenommen, digitalisiert und analysiert mit ImageJ. Scheinbare UCP Gewichtsveränderung ist kontinuierlich auf einem Strip-Chart Recorder, Erreichen der Form Gleichgewicht durch die Abflachung der Cahn Waage Spannungsausgang bezeichnet aufgezeichnet. Jedes Aggregat ist auf 2 verschiedene Grade der Komprimierung unterzogen.
3. Berechnung von zusammengesetzten Oberflächenspannung.
   In Form Gleichgewicht, kann die Kohäsivität der ein Aggregat von Zellen zwischen parallelen Platten, auf die sie nicht haftet komprimierten aus der Young-Laplace-Gleichung (Abb. 5), wo σ erhalten werden Kohäsivität, F die Kraft, um das Aggregat zu komprimieren , &pgr; r ₃ ² ist der Bereich der Oberfläche des Aggregats auf die Kraft F ausgeübt wird, und R ₂ und R ₃ sind jeweils der Radius des Äquators der komprimierten aggregieren und den Radius eines Bogens der Definition seiner Oberfläche Profil normalen zum Komprimieren von Platten und sich zwischen ihnen (Abb. 6). Die Messung der Druckkraft und Geometrie an Kraft und Form Gleichgewicht und die Anwendung dieser Messungen, die Young-Laplace-Gleichung erzeugt Zahlenwerte der scheinbaren Gewebe Oberflächenspannung. Nach Erreichen des Gleichgewichts und Berechnung von σ _1, sind Aggregate dekomprimiert und erlaubt, eine zweite Gleichgewicht Ansatz und σ ₂ berechnet wird, wie oben beschrieben.
4. Bestätigung der aggregierten Liquidität.
   Die berechnete Oberflächenspannung einer flüssigen Aggregatzustand wird, wenn zwei verschiedene Kompressionen ausgesetzt bleiben konstant. In solchen Aggregaten das Verhältnis von σ ₂ / σ ₁ wird gleich 1 und kleiner sein als das Verhältnis der Kraft an jeder nachfolgenden Kompression (F ₂ / F ₁₎ angewendet. Im Gegensatz dazu wird die berechnete Oberflächenspannung eines elastischen Aggregats gehorchen dem Hookeschen Gesetz und Erhöhung proportional zur angelegten Kraft. Für elastische Aggregate das Verhältnis von σ ₂ / σ ₁ nicht gleich 1 sein, sondern stattdessen Ansatz das Verhältnis von F ₂ / F _1. Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit Aggregate werden auch unabhängig von der Körnung ^2,17. Nur Messungen, bei denen die Oberflächenspannung ist unabhängig von der aufgebrachten Kraft und Größe verwendet werden, um durchschnittlich für jede Zelllinie σ berechnen.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Unten ist eine Tabelle der typischen TST für Aggregate Rattenprostata Fibroblasten (RPF) und Rattenprostata glatten Muskelzellen (RPSMC). Wie in Abb. zu sehen. 7 Aggregate von RPF-Zellen haben eine Oberflächenspannung von 22,8 ± 1,1 dyn / cm. Darüber hinaus waren die mittleren Werte der Oberflächenspannung nach der Kompression 1 und nach der Komprimierung 2 gemessen statistisch identschen, wenn sie von einem gepaarten t-Test verglichen. Wir haben auch das Verhältnis von σ ₂ / σ ₁ und F ₂ / F _1, um sicherzustellen, dass diese Aggregate nicht gehorchen dem Hookeschen Gesetz, da sie, wenn sie verhalten würde, wie elastische Festkörper verglichen. Wie in Tabelle 1, das Verhältnis von σ ₂ / σ ₁ gilt in der Tat Ansatz 1,0 demonstriert. Darüber hinaus wurde das Verhältnis von F ₂ / F ₁ signifikant größer als σ ₂ / σ ₁ (gepaarter t-Test, P <0,05), eine weitere Bestätigung, dass diese Aggregate nicht gehorchen dem Hookeschen Gesetz und in der Tat wie Flüssigkeiten verhalten. Im Gegensatz RPSMCs gehorchte Hookeschen Gesetz. Wie sich in Tabelle 1, das Verhältnis von σ ₂ / σ ₁ ist deutlich größer als 1 und war statistisch nicht unterschiedlich als die von F ₂ / F _1. Um weiter zu zeigen Flüssigkeit-ähnliches Verhalten, erkundeten wir die Beziehung zwischen Oberflächenspannung (σ) und dem Gesamtvolumen. Wie in Abb. zu sehen. 8, Lautstärke unabhängig von Sigma für RPF-Zellen (rot Regressionsgerade, r ² = 0,002), während es scheint einige Abhängigkeit von Sigma auf Volumen für RPSMCs (blau Regressionsgerade, r ² = 0,146) werden. Diese Daten bestätigen, dass RPF Aggregate in einer Flüssigkeit wie verhalten, während die der RPSMCs mehr als elastische Festkörper verhalten scheinen. Nur diejenigen Aufmaß von Aggregaten verhalten, als Flüssigkeiten erhalten würde verwendet, um die Oberflächenspannung berechnet werden.

Abbildung 1. Übersicht der Gewebeoberfläche Tensiometer.

Abbildung 2. Eine detailliertere Ansicht der Tensiometer Kammer (rechts).

Abbildung 3. Schematische Darstellung der Tensiometer Kammer.

Abbildung 4. Images von unkomprimierten (A) und komprimiert (B) Aggregate.

Abbildung 5. Die Laplace-Gleichung.

Abbildung 6. Schematische Darstellung eines flüssigen Tropfens zwischen zwei parallelen Platten, auf die sie schlecht haftet, auf Form Gleichgewicht komprimiert. R ₁ und R ₂ sind die beiden primären Krümmungsradien an den Tropfen des Äquators und in einer Ebene durch die Achse der Symmetrie hat. R ₃ ist der Radius des Tropfens ist kreisförmigen Kontaktfläche entweder mit Druckplatte. H ist der Abstand zwischen oberer und unterer Druckplatten. X ist eine Seite eines rechtwinkligen Dreiecks mit Hypotenuse R _{2, die sich} bis zu einem Punkt des Kontaktes zwischen den Tropfen die Oberfläche und entweder Druckplatte.

	σ 1 (Dyn / cm ± SEM)	σ 2 (dyn / cm ± SEM)	Pσ 1 vs σ 2	σ 1,2 (dyn / cm ± SEM)	σ 2 / σ 1	F 2 / F 1	Pσ 2 / σ 1 und F 2 F 1
RPF	22,6 ± 1,7	22,9 ± 1,4	> 0,05 *	22,8 ± 1,1	1,04 ± 0,04	1,47 ± 0,06	<0,05
RPSMC	15,0 ± 2,8	23,0 ± 3,2	0,039	NA	1,9 ± 0,3	1,6 ± 0,1	0,16 *

Abbildung 7. TST Messungen und Bestätigung der aggregierten Liquidität für Aggregate Rattenprostata Fibroblasten und glatten Muskelzellen.

Abbildung 8. Beziehung zwischen Sigma und das Volumen für Aggregate der RPF (rote Linie) und RPSMCs (blaue Linie).

Diskussion

Mess-Aggregat Zusammenhalt durch TST ist relativ einfach. Es gibt jedoch wichtige Schritte, die gemeistert werden müssen, um nutzbare TST Daten vorzulegen; 1) Aggregate müssen "gesund". Dies kann durch Sicherstellung, dass Aggregatbildung mit Zellen, die bei optimaler Zusammenfluss vor Ablösung sind beginnt gesteuert werden. Aggregate Größe und Zeit in der Kultur müssen ebenfalls kontrolliert, um die Entwicklung eines nekrotischen Kern innerhalb der Aggregation zu minimieren; 2) Ein weiterer Parameter, TST bee...

Materialien

• Wasserbad / Schüttler (New Brunswick Scientific, Edison, NJ)
• 10 ml Rundkolben (Belco, Vineland, NJ)