Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Zusammenfassung

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren ist der Grundstein der modernen experimentellen Embryologie, was zur Aufklärung von mehreren Entwicklungspfaden. Verschiedene leistungsfähige und gut etablierten transgenen Technologien zur Verfügung, um Genexpression in der Maus zu manipulieren, so dass für die Erzeugung sowohl Verlust-und Gain-of-function-Modelle. Allerdings ist die Erzeugung von Maus Transgenik sowohl kosten-und zeitaufwendig. Alternative Methoden der Gen-Manipulation wurden daher häufig gesucht. In utero Elektroporation eine Methode der Gentransfer in die Live-Maus-Embryonen ^1,2, dass es uns gelungen, ^3,4 angepasst ist. Er basiert weitgehend auf den Erfolg der in ovo Elektroporation Technologien, die häufig in Küken ⁵ zum Einsatz kommen. Kurz gesagt, ist die DNA in die offenen Kammern des sich entwickelnden Gehirns und die Anwendung eines elektrischen Stromes bewirkt die Bildung von transienten Poren in Zellmembranen injiziert, so dass für die Aufnahme von DNA in die Zelle. In unseren Händen, können Embryonen effizient so früh wie embryonale Tag (E) 11,5 elektroporiert werden, während die Ausrichtung der jüngeren Embryonen eine Ultraschall-geführte Mikroinjektion Protokoll, wie zuvor ⁶ beschrieben erfordern würde. Umgekehrt ist E15.5 dem neuesten Stand wir leicht elektroporieren kann, aufgrund der Beginn der parietalen und frontalen Knochen Differenzierung, die Mikroinjektion behindert in das Gehirn. Im Gegensatz dazu ist die Netzhaut zugänglich über das Ende der Embryogenese. Embryonen können zu jedem Zeitpunkt während der embryonalen oder frühen postnatalen Phase gesammelt werden. Die Injektion eines Reporter-Konstrukt ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen.

Bis heute hat in utero Elektroporation wurde am häufigsten für die Analyse der Neokortex Entwicklung ^1,2,3,4 verwendet. Neuere Studien haben die embryonalen Netzhaut ^7,8,9 und Thalamus ^10,11,12 ausgerichtet. Hier präsentieren wir eine in utero Elektroporation Protokoll, das leicht angepasst werden kann, um verschiedene Bereiche des embryonalen ZNS Ziel geändert. Wir beweisen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir die embryonalen Telencephalon, Diencephalon und Netzhaut Ziel. Repräsentative Ergebnisse vorgestellt werden, erste, welche die Anwendung dieser Technik, um DNA-Expressionskonstrukte in den Seitenventrikel eingeführt, so dass wir Vorläuferzellen Reifung, Differenzierung und Migration in der embryonalen Telencephalon überwachen. Wir zeigen auch, dass diese Technik verwendet werden, um DNA, die Zwischenhirn Gebiete rund um den ^3. Ventrikel Ziel sein, so dass die Flugrouten der differenzierenden Neuronen in Zwischenhirn Kerne überwacht werden. Schließlich zeigen wir, dass die Verwendung von Mikromanipulatoren uns genau vorstellen DNA-Konstrukte in kleine Zielgebiete, einschließlich der subretinalen Raum ermöglicht, so dass wir den Einfluss der Manipulation der Genexpression auf der Netzhaut Entwicklung zu analysieren.

Protokoll

1. Set-up

1. Set-up OP-Bereich, wie in Abb. gezeigt. 1A, A '. Die wichtigsten Komponenten des Set-up gehören ein Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor, Narishige Mikromanipulator mit Nadelhalter, Leica steromicroscope, Glasfaser-Beleuchtung, ECM 830 Square Wave Elektroporation System mit Elektroden, Heizkissen und einem Verdampfer für Isofluran Narkose.
2. Reinigen Sie alle Werkzeuge mit einem Bransonic Ultraschallreiniger mit Metriclean2 Schaumarmes Lösung für Beschallung chirurgische Instrumente. Sterilisieren Instrumente durch Autoklavieren. Sterilisiert Werkzeuge werden dann in Germex gehalten.
3. Bereiten Sie Spritzen mit warmen steriler Kochsal....

Diskussion

In utero Elektroporation kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Entwicklungs-Prozesse analysiert werden. Zum Beispiel kann die Transfektion von Reportergen wie GFP, mCherry oder alkalische Phosphatase verwendet werden, um Abstammung Tracing und neuronalen Migration Experimente durchzuführen. Alternativ kann die Rekombinase Cre transient exprimiert werden, um selektiv beseitigen eine floxed Allel in einem räumlich-und / oder zeitlich gesteuert. Darüber hinaus können shRNA oder dominant negative Konstrukte k.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kategorie
Feine Schere	Feine Science Tools Inc.	14078-10	Chirurgische Werkzeuge
Iris Schere, gebogen	Feine Science Tools Inc.	14061-10	Chirurgische Werkzeuge
Olsen-Hegar Ex-Delicate Nadelhalter	Feine Science Tools Inc.	12002-12	Chirurgische Werkzeuge
Ring Pinzette, 9mm	Feine Science Tools Inc.	11103-09	Chirurgische Werkzeuge
Eye dressing Pinzette	Feine Science Tools Inc.	11051-10	Chirurgische Werkzeuge
Dumont Nr. 7 DMX Pinzette	Feine Science Tools Inc.	11271-30	Chirurgische Werkzeuge
Dumont Nr. 5 DMX Pinzette	Feine Science Tools Inc.	11251-30	Chirurgische Werkzeuge
Tissue ForceP-Adson	Feine Science Tools Inc.	11027-12	Chirurgische Werkzeuge
Reflex Clip-Applikator	World Precision Instruments	500343	Chirurgische Werkzeuge
Perforierte Löffel, 15 mm Durchmesser	Feine Science Tools Inc.	10370-18	Chirurgische Werkzeuge
Autoclip Remover	Mikron	427637	Chirurgische Werkzeuge
Silk schwarz Geflochtener	Ethicon Inc.	K871	Chirurgische Werkzeuge
Reflex Hautverschluss Stainless Steel Wound Clips	World Precision Instruments	500346	Chirurgische Werkzeuge
ECM 830 Square Wave Elektroporationssystem	VWR-CanLab	58018-004	Instruments
Pinzette w / Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plattenelektrode	Protech International Inc.	CUY650P5	Instruments
Pinzette w / Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plattenelektrode	Protech International Inc.	CUY650P7	Instruments
Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor	VWR CanLab	CA62111-488	Instruments
Fußschalter für Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor	VWR CanLab	CAACCESS (Sonstiges)	Instruments
Bransonic Ultraschallreiniger Modell 1510R-DTH	VWR CanLab	CA33995-534 CPN-952 bis 118	Instruments
Sutter P97 Mikropipette Puller	Sutter Instrument, Carsen Group Inc.	P-97	Instruments
Mikropipetten - Borosilikatglas mit Filament OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, Länge 10 cm	Sutter Instrument	BF100-78 bis 10	Instruments
3-Achsen-Manipulator Coarse	Carl Zeiss Canada Inc.	M-152	Instruments
Magnetic Haltevorrichtung für Mikromanipulator	World Precision Instruments	M1	Instruments
Grundplatte aus Stahl für Mikromanipulator	World Precision Instruments	5052	Instruments
Micropipette Halter	World PrNTSCHEIDUNG Instruments	MPH3	Instruments
Micropipette Griff	World Precision Instruments	5444	Instruments
Stereomikroskop	Leica	MZ6	Instruments
Vaporizer für Isofluran Narkose	Porter Instruments Company	MODELL 100-F	Instruments
Metriclean2 Schaumarmes Lösung für Beschallung chirurgische Instrumente	Metrex Research Corporation	10-8100	Chirurgische Reagenzien
Gentamicin 40mg/ml in 0,2 g Methylenblau Antibiotikum Spray nach dem Vernähen	Sigma Aldrich	G1264	Chirurgische Reagenzien
Germex zur Sterilisation chirurgischer Instrumente	Vétoquinol	DIN # 00141569	Chirurgische Reagenzien
BNP Augensalbe	Vétoquinol	DIN # 00516414	Chirurgische Reagenzien
Nair ®	Distributed by Church & Dwight Co., Inc.	im Handel erhältlich	Chirurgische Reagenzien
Stanhexidine 4% w / v Haut Reiniger	Omega Laboratories Inc.	01938983	Chirurgische Reagenzien
Buprenorphin (Temgesic) analgetische	Schering-Plough	531-535	Chirurgische Reagenzien
Sulfa "25" Sulfamethazin Antibiotikum	Professional Veterinary Laboratories	DIN # 00308218	Chirurgische Reagenzien
Ringer-Laktat-Lösung	Baxter Corporation	DIN # 0061085	Chirurgische Reagenzien
Saline - 0,9% Natriumchlorid	B-Braun Medical Inc.	DIN # 01924303	Chirurgische Reagenzien
Inhalationsnarkose - Isofluran USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	DIN # 02237518	Chirurgische Reagenzien
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Chirurgische Reagenzien