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1. Set-up
- Set-up OP-Bereich, wie in Abb. gezeigt. 1A, A '. Die wichtigsten Komponenten des Set-up gehören ein Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor, Narishige Mikromanipulator mit Nadelhalter, Leica steromicroscope, Glasfaser-Beleuchtung, ECM 830 Square Wave Elektroporation System mit Elektroden, Heizkissen und einem Verdampfer für Isofluran Narkose.
- Reinigen Sie alle Werkzeuge mit einem Bransonic Ultraschallreiniger mit Metriclean2 Schaumarmes Lösung für Beschallung chirurgische Instrumente. Sterilisieren Instrumente durch Autoklavieren. Sterilisiert Werkzeuge werden dann in Germex gehalten.
- Bereiten Sie Spritzen mit warmen steriler Kochsalzlösung und sterile Ringer-Laktat-Lösung.
2. Anästhesie
- Legen Tier in einem kleinen (12cm x 20cm) Betäubung Kammer. Mit einem Verdampfer, liefern 5% Isofluran Anästhesie und Sauerstoff bei 1l/min (Abb. 1A, A '). Bemerkenswert ist, ist es wichtig, Isofluran Auspuff sammeln mit einem Spülsystem.
- Entfernen Tier aus der Kammer beim Atmen tief und regelmäßig wird. Toe Quetsch-und Lidschlag-Reflex-Tests werden verwendet, um Vollnarkose zu gewährleisten.
- Legen Sie schwanger Maus auf dem Rücken auf einem Heizkissen (37 ° C). Das Heizkissen ist zunächst durch Abreiben mit 70% Ethanol sterilisiert und dann mit einer sterilisierten, fusselfreien Gaze abgedeckt. Verwenden Sie eine Atemmaske und Maske Gerät zu liefern Isofluran (2,25%) während der Operation.
- Inject Buprenorphin (0.1mg/kg Körpergewicht) subkutan unter die Haut am Nacken.
- Monitor Tier während der Operation für tiefe und regelmäßige Atmung. Das Tier sollte nicht schnappen, atmen flach und schnell. Flache, schnelle Atmung kann ein Anzeichen einer flachen Narkose werden, und der Durchfluss von Isofluran sollte erhöht werden. Wenn das Tier beginnt zu keuchen, reduzieren Sie die Strömung von Isofluran. Im Falle eines Atemstillstands, schalten Isofluran aus und erhöhen Zustrom von Sauerstoff bis Tier erholt. Starten Sie Isofluran bei einer geringeren Konzentration.
3. Tierische Vorbereitung für Chirurgie
- Band Vorderbeine des Tieres auf die Heizkissen und prüfen Sie erneut für einen Widerruf Reaktion durch Einklemmen des Rückfußes mit einer stumpfen Zange.
- Mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen, verbreitet eine dicke Schicht von Enthaarungscreme (dh Nair) auf den Bauch. In festen Strichen, sicherzustellen, dass die Unterwolle komplett beschichtet ist. Lassen Sie bei einem mittleren von drei Minuten, Kontrolle zeitweise mit einem sterilen Wattestäbchen für die Haarentfernung. Wet eine sterile Gaze mit sterilem Wasser und wischen Sie den Bauch, bis alle Spuren verschwunden sind. Wiederholen Sie mit Chlorhexidin (dh Stanhexidine) Haut sauberer und Wasser. Dry den Bauch mit einem sauberen, sterilen Gaze.
- Sterilisieren Inzisionsstelle mit einem Chlorhexidin (dh Stanhexidine) um mehr sterilem Wasser gefolgt. Dry den Bauch mit einem sauberen, sterilen Gaze. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 70% Ethanol und einem frischen, sterilisierten Wattestäbchen.
- Legen Sie eine sterile Gaze über den Bauch mit einem Schlitz in der Mitte, durch die die Uterushörner während der Operation gezogen werden.
4. Inzision und Freilegung der Uterushörner
- Zur Freilegung der Uterushörner, suchen Sie zunächst der Linea alba, wie die schwache Linie unter der Haut an der Mittellinie. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Haut von der Bauchwand und schneiden Sie ein kleines, gerade Schnitt aus der Mitte des Bauches nach unten mit der Haut Schere (ca. 1 cm in der Länge).
- Mit einer gebogenen Pinzette und Schere, wiederholen Sie den Vorgang mit dem Bauchfell.
- Legen Sie steriler Gaze mit einer kleinen vertikalen Schlitz über Schnitt und dämpfen mit erwärmtem steriler Kochsalzlösung.
- Slide Pinzette in den Einschnitt und suchen Sie die Gebärmutter. Halten offenen Einschnitt mit einer Pinzette beim Entfernen der Gebärmutter Hörner.
- Vorsichtig greifen die Gebärmutter zwischen dem ersten und zweiten sichtbaren Embryonen und ziehen Sie die Embryonen auf die Gaze. Entfernen Sie beide Seiten des Uterushörner, indem auf die sterile Gaze und zählen die Anzahl der Embryonen ist auch jede Resorptionen oder "ungesund" (z. B. kleinere Körpergröße) Embryonen. Wet die Uterushörner mit Kochsalzlösung und vorsichtig wieder die Hälfte der Gebärmutter in den Bauch.
5. Die Injektion von DNA in Ventrikel
- Chirurgische Nadeln sind mit einem Sutter Flaming Micropipette Puller mit Borosilikat-Mikropipetten mit Kapillaren vorbereitet (Programm: Wärme = 750, Pull = 30, Vel = 90, Time = 150). Mit einem sterilen Skalpell, ist die Nadelspitze sanft aus in einem 45 Grad Winkel rasiert.
- So laden Sie die Nadel, sind Pasteurpipetten zu einem schmalen Durchmesser unter einer Flamme gezogen. Ein Mundstück ist es, die Be-Pipette befestigt zu erarbeiten ~ 10 ul 3mg/ml Endotoxin-freie DNA mit 0,01% Methyl-grün gemischt (Anmerkung: Methyl-grünen Farbstoff ermöglicht DNA-Injektionen zu visualisieren). Der gefüllte Nadel wird dann auf einem Mikromanipulator Stativ montiert und an den FemtoJet Injektor.
- Beginnend mit dem Embryo am nächsten an der Eierstöcke, Pinzetten kreisförmigenwerden verwendet, um sanft wiederum der Embryo innerhalb der Dezidua, so dass es positioniert ist "face-forward", so dass Injektionen in einem rostral kaudal auftreten. Eine Faseroptik-Lichtquelle für die Beleuchtung wird verwendet, um zu visualisieren der Mittellinie des embryonalen Gehirns, die durch die großen lateralen Ventrikel in rostralen Regionen (Abb. 1B, B ') flankiert wird.
- Der Embryo wird in der Position mit kreisenden Zange gehalten. Die Nadel ist über der Gebärmutter so positioniert, dass der Winkel für die Einreise in das Gehirn ist etwa 45 Grad. Mit dem Mikromanipulator und eine schnelle und stetige Bewegung wird die Nadelspitze durch die Gebärmutterwand und in den lateralen Ventrikel des Embryos eingesetzt. Die Injektionen werden in Richtung der Seitenventrikel, 3. Ventrikel oder subretinalen Raum zum Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut, bzw. Ziel gerichtet. Beachten Sie, dass das embryonale Gehirn Bläschen offen sind, in einem frühen embryonalen Stadium, so dass DNA injiziert in die Seitenventrikel wird in der 3. Ventrikel fließen.
- Drücken Sie das Fußpedal zur Endotoxin-freie DNA (1-3 mL) mit einer Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor injizieren. Eine erfolgreiche Injektion ist einfach visualisiert durch die Verbreitung der Methyl-grünen Farbstoff in den embryonalen Ventrikel im Gehirn. Die Nadel wird dann langsam durch Zurückziehen bis zum Bruch zu vermeiden entfernt.
6. Elektroporation
- Die injizierten Embryonen (noch innerhalb der Gebärmutter) ist auf dem steriler Gaze darüber liegenden Bauch der Mutter und nass gründlich mit warmen Kochsalzlösung gelegt. Bitte beachten Sie ** Der Zusatz von Kochsalz auf die Membranfläche ist wesentlich für eine effiziente Durchgang eines elektrischen Stromes ermöglichen.
- GenePaddle Elektroden werden verwendet, um die Gebärmutter nach der Injektion von DNA Griff. Fünf quadratische elektrische Impulse von 40-50V und 50 ms sind bei einer Rate von einem Impuls pro Sekunde mit einer ECM8300 BTX Elektroporation System (Abb. 1C, C ') geliefert.
- Decken Sie die injizierten / elektroporiert Embryo mit Schutzfolie nass Gaze und fahren bis zur nächsten Embryo.
- Nach Abschluss der Injektion / Elektroporation von allen gewünschten Embryonen, spitzen Gegenstand auf das Uterushörner zurück in den Bauchraum (Abb. 1D).
- Entfernen Sie vorsichtig das andere Uterushorn und beginnen wieder mit dem Embryo am nächsten an der Eierstöcke.
7. Suture und Heften
- Sobald alle Embryonen sind zurück in der Gebärmutter, in die Bauchhöhle ~ 2-3 ml warme Kochsalzlösung hinzuzufügen.
- Zum Schließen der Wunde, durch das Entfernen der Gaze auf den Bauch und die Identifizierung der Seiten des Peritoneum zu beginnen. Begin Naht des Bauchfells mit schwarzem geflochtenen Seidenschnur. Es wird nicht empfohlen, resorbierbares Nahtmaterial für dieses Verfahren verwenden, da es in der Regel schwächer und kann zu postoperativen Blutungen und Infektionen führen. Verankern Sie die Leitung auf dem Bauchfell am nächsten zum Brustbein und fahren Sie mit Stich vom Anker. Sicherstellen, dass alle Nähte dicht sind, und dass keine zugrunde liegende Organe oder der Haut wurde versehentlich in das Peritoneum angenäht. Clip der restlichen Naht und entsorgen.
- Pull Haut geschlossen über die Naht mit einer Pinzette. Mit 9 mm Reflex ™ Hautverschluss Klammern, Clip die Haut über der Wunde, dabei nicht zu heften Sie die Naht unterhalb oder auf der Haut zu eng zu ziehen. Die bevorzugte Methode ist, um die Haut zu halten und vom Körper weg mit einer Pinzette, und kommen in einem 90 Grad Winkel mit der Klammer-Tool. Fahren Sie bis Wunde geschlossen ist (etwa drei Heftklammern). Sobald Sie fertig sind, sicherzustellen, Heftklammern dicht sind durch leichtes Drücken mit der Naht-Werkzeug (Abb. 1D).
8. Post-OP-Pflege
- Zur Überwachung Aufwachraum, schalten weiblichen auf ihren Bauch, und schalten Sie Isofluran. Keeping das Tier das Gesicht in der Atemschutzgeräte, wiederum Sauerstoff bis zu 3% auf aus der Narkose zu helfen. Das Tier sollte auf einem sauberen, trockenen Gaze auf dem Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern platziert werden.
- Während das Tier groggy, spritzen 2 ml Ringer-Lösung subkutan unter den Hals des Tieres Haut.
- Halten Sie das Tier unter Sauerstoffzufuhr für einige Minuten und Erwärmung Gazekompressen um wecken das Tier. Kurze Spurts der Bewegung des Tieres zu beachten, da es zu einer normalen Atmung zurückkehrt. Beachten Sie für einige Minuten, bis Tier scheint bewusst und wach.
- Spray des Weibchens Bauch mit Gentamicin-Spray und wickeln Sie das Tier in eine sterile Gaze.
- Übertragen Sie die Tiere in einen sterilen Käfig mit autoklaviert Betten und Karton Gehäuse.
- Wasserflaschen sollten gründlich gereinigt werden, sterilisiert und befüllt mit sterilem Wasser. Zu 500 ml Wasser hinzufügen, 2 ml Sulfamethazin Antibiotika (25% Aktien).
- Verwalten 0,05 mg / kg subkutan Buprenorphin am Morgen nach der Operation.
- Überwachen Sie den weiblichen eng für die ersten 24 Stunden nach der Operation. Wenn die Tiere länger als 24 Stunden aufbewahrt werden, sind Frauen, neue ster verschobenile Käfigen am Tag 2.
9. Repräsentative Ergebnisse
Neocortex
Der Neocortex ist die Region des ZNS, die für die visuelle und sensomotorische Verarbeitung und höheren kognitiven Funktionen ist. Es ist der glutamatergen Projektion Neuronen und GABAergen Interneuronen, die aus der dorsalen und ventralen Telencephalon abgeleitet werden, bzw. besteht. Um die Rolle verschiedener Gene in neokortikalen Entwicklung, verwenden wir in utero Elektroporation entweder misexpress oder Sperrung der Ausdruck (dh durch die Verwendung von shRNA Konstrukte) verschiedener Gene in der dorsalen oder ventralen Telencephalon 1,3,4. Um misexpress Gene in der embryonalen Telencephalon, verwenden wir eine bicistronische Expressionsvektor (pCIG2), mit einer CMV-Promotor-Enhancer βactin und eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES)-Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP; in pCIG2) Kassette, so dass transfizierten Zellen, die durch Epifluoreszenz (Abb. 2A-C) nachgewiesen werden. Wir nutzten diese Technik, um die Expression-Konstrukten in das Telencephalon Einführung von E11.5 bis E15.5 (angezeigten Daten an E12.5;. Abb. 2). Dadurch, dass Embryonen zu entwickeln mehrere Tage nach der Elektroporation, sind wir in der Lage, die Differenzierung und Migration von GFP-markierten Vorläufern zu verfolgen. Als Differenzierung erfolgt, 3 Tage nach der Elektroporation GFP +-Zellen differenzieren und wandern aus der ventrikulären Zone (vz), subventrikulären Zone (SVZ) und Zwischenzone (iz) und in der kortikalen Platte (cp;. Abb. 2C). , Basalen Vorläuferzellen (dh Tbr2; Wenn Gehirne bei E12.5 elektroporiert nach 24 Stunden analysiert werden, können wir frühere Ereignisse in Vorläuferzellen der Reifung und der neuronalen Migration durch Co-Kennzeichnung mit Markern der apikale Vorläuferzellen (. Abb. 2A dh Pax6) zu überwachen; . Abb. 2B) und postmitotischen neokortikalen Neuronen (dh Tbr1;. Abb. 2C).
Diencephalon
Der Hypothalamus liegt an der ventralen Basis des ZNS und fungiert als Gateway zwischen den endokrinen und vegetativen Nervensystems. Bei der Entwicklung der mehrere Kerne, aus denen sich die reifen Hypothalamus von einer gemeinsamen Stammform Zone unterscheiden, die Linien der ventral-äußerste Region des embryonalen Zwischenhirns. Derzeit sind die molekularen Mechanismen, die Vorläuferzellen der Zellproliferation, der neuronalen Differenzierung und die Bildung von Hypothalamus Kerne regulieren wenig verstanden. Wir haben in utero Elektroporation Reportergenexpression der embryonalen Zwischenhirns Ziel durch die Injektion von DNA in der 3. Ventrikel des E12 embryos.We folgte dann die Verteilung der GFP bei der Differenzierung von Neuronen bei E14. Mit dieser Methodik haben wir erfolgreich die GFP-Expression auf den Thalamus, pre-Thalamus und Hypothalamus (Abb. 3A) ausgerichtet. Die Analyse der koronalen Abschnitte zeigt, dass es uns gelungen, die GFP-Expression zu Vorläuferzellen gezielt diese Linie der ventrikulären Zone des 3. Ventrikels und Neuronen, die aus dem Erdmantel Zone migrieren, um Kerne zu bilden (Abb. 3B)
Retina
Die Netzhaut ist die neuronale Schicht des Auges, verantwortlich für die Umwandlung von Licht Photonen in elektrische Impulse an das Gehirn weitergeleitet. Es entwickelt sich als Ausstülpung des embryonalen Zwischenhirns, und damit wird aus dem Neuralrohr abgeleitet. Das neuronale Netzhaut entwickelt sich aus einer apikalen Vorläuferzellen Fach, dass neben den subretinalen Raum, einen Hohlraum, der das Auge trennt den Kopf Mesenchym liegt. Targeting DNA-Konstrukte zu retinalen Vorläuferzellen erfordert daher, dass Injektionen in ein kleines Zielgebiet vorgenommen werden. Mit Mikromanipulatoren, haben wir es geschafft, erfolgreich Ziel dieser kleinen Fläche in Embryonen von E13.5 bis E15.5 (gezeigt wird E15.5 electroporations der PCIC mit mCherry Reporter; Abb. 4).. Wenn elektroporiert retinae 24 Stunden nach der Transfektion untersucht werden, beobachten wir, dass die meisten mCherry +-Zellen sind in der äußeren Schicht Neuroblasten (onbl), wo Teilung Vorläuferzellen befinden, und nicht in den retinalen Ganglienzellen (gcl; Einschub) befindet, wo postmitotischen Zellen zu lokalisieren.
Abbildung 1. Einführung in die in utero Elektroporation Set-up und Methodik. (A) Die wichtigsten Komponenten des OP-Set-up gehören ein Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor (1), Narishige Mikromanipulator mit Nadelhalter (2), Leica steromicroscope (3), faseroptische Beleuchtungssysteme System (4), ECM 830 Square Wave Elektroporation System mit Elektroden (5) und Heizkissen (6). (A ') Das Tier ist betäubt mit einem Verdampfer für Isofluran Narkose. (B, B ') Kurz nach der Narkose sind die Uterushörner ausgesetzt und DNA mit schnellen Grün gemischt wird in den embryonalen Gehirn Bläschen injiziert. Eine erfolgreiche Injektion wird visualisiert durch die Verfolgung der schnellen grünen Farbstoff (B '). (C, C ') Nach der DNA erfolgreich injiziert wird, sind die Paddle-Elektroden auf beiden Seiten der Gebärmutter, Positi platziertenantrieb oniersystem der Embryo, so dass die DNA wird nach dem positiven Pol in die Region des Gehirns der Wahl gezogen werden. (D, D ') Nachdem alle gewünschten Embryonen injiziert werden, die Gebärmutter ist zurück in den Bauchraum (D) gedrückt wird, wird das Bauchfell vernäht, und die Haut wird geheftet (D'). Die schwangere Frau ist dann erlaubt sich zu erholen und die Elektroporation Welpen sind an der gewünschten Zeitpunkten gesammelt.
Abbildung 2. Repräsentatives Beispiel für dorsal telencephalic Elektroporation. (AC): Mikroskopische Aufnahme eines koronalen Schnitt durch eine E13.5 dorsalen Telencephalon bei E12.5 mit pCIG2 elektroporiert. Elektroporiertem GFP +-Zellen sind bekannt für ihre Expression von Markern der apikalen Vorfahren analysiert (Pax6 +, rot, A), basale Vorläuferzellen (Tbr2 +, rot, B) und postmitotischen Neuronen (Tbr1 +, rot, C). cp, kortikalen Platte; SVZ, Subventrikularzone, vz; ventrikuläre Zone.
Abbildung 3. Repräsentatives Beispiel für Zwischenhirn Elektroporation. (A) A ventrale Ansicht eines E14 Gehirns, die bei E12 wurde mit pCIG2 elektroporiert. GFP Epifluoreszenz sichtbar in den Thalamus, demonstrieren vor Thalamus und Hypothalamus, die Ausbreitung der mikroinjiziert pCIG2 Plasmid während der 3 rd Ventrikels. (B) Mikroskopische Aufnahme Frontalschnitt durch Elektroporation Gehirn, welche die Migration von GFP +-Zellen aus der ventrikulären Zone und in den Mantel-Zone, wo hypothalamischen Kerne bilden. 3V, dritten Ventrikel; T, Thalamus, Hy, Hypothalamus, mz, Mantel-Zone; Tel, Telencephalon; PreT, prethalamus; vz, ventrikuläre Zone.
Abbildung 4. Repräsentatives Beispiel für Netzhaut-Elektroporation. Frontalschnitt durch eine E16.5 Auge mit PCIC bei E15.5 elektroporiert zeigt die Akkumulation von mCherry + Zellen in der äußeren Schicht Neuroblasten und nicht in Brn3b + retinalen Ganglienzellen in den Ganglienzellen. Der Einschub ist ein höherer Vergrößerung Bild von dem eingerahmten Bereich. gcl, retinalen Ganglienzellen Schicht; le, Linse; onbl, äußere Schicht Neuroblasten; re, Netzhaut.