Methodenartikel

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

DOI:

10.3791/3071

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22. Juli 2011

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1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin , 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin , 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Tregs sind potente Suppressoren des Immunsystems. Es besteht ein Mangel an einzigartigen Oberflächenmarker um sie zu definieren, damit sind die Definitionen der Tregs in erster Linie funktional. Hier beschreiben wir eine optimierte In-vitro- Assay ermöglicht die Identifizierung immune Ungleichgewicht bei den Probanden mit Risiko für die Entwicklung von T1D.

Zusammenfassung

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Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind kritische Mediatoren der Immuntoleranz gegenüber Selbst-Antigenen. Darüber hinaus sind sie von entscheidender Bedeutung Regulatoren der Immunantwort auf eine Infektion. Trotz der Bemühungen um eine einzigartige Oberfläche Marker auf Tregs zu identifizieren, ist die einzige Besonderheit ihrer Fähigkeit, die Proliferation und Funktion der Effektor-T-Zellen unterdrücken. Es ist zwar klar, dass nur in vitro-Untersuchungen können bei der Beurteilung der menschlichen Treg-Funktion verwendet werden, wird diese Problematik bei der Beurteilung der Ergebnisse von Querschnitts-Studien, in denen gesunder Zellen und Zellen von Patienten mit Autoimmunerkrankungen (wie Typ 1 Diabetes-T1D) müssen isoliert verglichen werden. Es gibt eine große Variabilität zwischen den Labors in der Anzahl und Art der Responder-T-Zellen, Art und Stärke der Stimulation Treg: Responder-Verhältnisse und die Anzahl und Art der Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der menschlichen In-vitro-Suppression-Tests verwendet. Diese Variabilität macht einen Vergleich zwischen Studien zur Messung Treg-Funktion schwierig. Die Treg-Feld muss ein standardisiertes Unterdrückung Assay, die gut funktionieren wird sowohl mit gesunden Probanden und Patienten mit Autoimmunerkrankungen. Wir haben eine in vitro-Assay-Unterdrückung, die sehr wenig Intra-Assay-Variabilität in der Stimulation von T-Zellen von gesunden Freiwilligen im Vergleich zu Patienten mit zugrunde liegenden autoimmune Zerstörung der Bauchspeicheldrüse β-Zellen isoliert zeigt entwickelt. Das Hauptziel dieses Stückes ist es, ein in vitro menschliche Unterdrückung Assay, der Vergleich zwischen den verschiedenen Fächergruppen ermöglicht beschreiben. Darüber hinaus hat dieser Test das Potenzial, einen kleinen Verlust in nTreg Funktion beschreiben und rechnen mit weiteren Verlust in der Zukunft, also die Identifizierung von Personen, die präventive immunmodulatorische Therapie 1 profitieren könnten. Im Folgenden bieten wir ausführliche Beschreibung der Schritte in diesem Verfahren beteiligt. Wir hoffen, dass die Standardisierung der in vitro Suppression Assay verwendet werden, um Treg-Funktion Maßnahme beitragen. Darüber hinaus bieten wir diesen Test als ein Werkzeug zu einem frühen Zustand des Immunsystems Ungleichgewicht und eine mögliche funktionelle Biomarker für T1D zu erkennen.

Protokoll

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1. Vor dem Einrichten einer Unterdrückung Assay, überprüfen muss man Mantel tosylactivated Beads mit anti-human CD3 (Klon UCHT1, Endkonzentration 1μg/ml) für Zell-Stimulation und danach, ob die Perlen effizient durch die Einrichtung eines In-vitro-Proliferation-Assay mit menschlichen beschichtet T-Zellen

  1. Nehmen Sie 1 ml der M-450 tosylactivated Perlen aus der Original-Durchstechflasche, in Magnetfuß und halten, bis alle Perlen auf der Seite des Rohres haften geblieben sind. Entfernen Sie den Puffer, während Röhre befindet sich noch in der magnetischen stehen. Nehmen Sie Schlauch aus magnetischen stehen und 1ml von buffer1 wird das Reagenzglas in m....

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Diskussion

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Als einzige Besonderheit an Tregs, sollte suppressive Funktion zuverlässig und gleichmäßig zwischen den Fächern geprüft werden in verschiedenen Phasen der Entwicklung der Krankheit innerhalb der gleichen und zwischen unterschiedlichen Studien. Wir bieten Ihnen Details der Unterdrückung Test in unserem Labor als unseren Beitrag zur Standardisierung von diesem Assay entwickelt. In unserem umfangreichen Studie zur Optimierung, haben wir festgestellt, dass T-Zell-Stimulation mit anti-human CD3-beschichteten Beads (UCHT1 Klo.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Diese Studie wurde vom Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetesat Medical College of Wisconsin und Kinder Research Institute of Wisconsin unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse oder Erstellung des Manuskripts.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes oder Instrument Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
Ficoll-Paque PLUS Amersham Pharmacia Biotech 17-1440-03
DPBS-1X Gibco 14190-144
Trypanblau Invitrogen 15250-061
Anti-CD4-Microbeads Miltenyi 130-045-101
Pre-Trennfilter Miltenyi 130-041-407
LS Spalte Miltenyi 130-042-401
EDTA Invitrogen 15575-020
BSA Sigma-Aldrich B4287
Anti-human CD4-APCCy7 (Klon RPA-T4) BD Pharmingen 557852
Anti-human CD25-PE (Klon M-A251, IL-2Rα) BD Pharmingen 555432
Anti-human CD8-FITC (Klon RPA-T8) BD Pharmingen 555366
Anti-human CD14-FITC (Klon M5E2; LPS-Rezeptor) BD Pharmingen 555397
Anti-human CD32-FITC (Klon FLI8.26; FcyR-Typ II) BD Pharmingen 555448
Anti-human CD116-FITC (Klon M5D12; GM-CSFRα Kette) BD Pharmingen 554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13
Anti-human CD3 Ancell 144-024
Buffer1 Homemade 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH 7,6
Buffer2 Homemade PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH-Wert 7,4
Buffer3 Homemade 0,2% BSA pH 8,5 Tris/0.1
Vollständige RPMI Medien Homemade RPMI 1640 Medium 2 mM L-Glutamin 5 mM HEPES 100 U / ug / ml peni / Strept 0,5 mM Natriumpyruvat
[3 H] Thymidin Perkin Elmer NET027Z005MC
Menschen gebündelt AB-Serum Atlanta Biologicals S40110
Multiscreen Ernte Platte Millipore MAHFC1H60
Microscint 20 Perkin Elmer 6013621

Referenzen

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  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R.

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Schlagwörter

In vitro SuppressionsassayMessung der Treg Funktionregulatorische T ZellenDurchflusszytometrische SortierungCD4 positive T ZellenEinbau von tritiummarkiertem Thymidinmononukle re Zellen des peripheren Blutesantigenpr sentierende ZellenScreening auf ImmunungleichgewichteBiomarker f r Typ 1 Diabetes

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