Photolyse von caged-Verbindungen ermöglicht die Produktion von schnellen und lokalisierten Anstieg der Konzentration von verschiedenen physiologisch aktiven Verbindungen. Hier zeigen wir, wie Patch-Clamp-Aufnahmen mit der Photolyse von caged cAMP kombiniert oder caged Ca für das Studium der olfaktorischen Wahrnehmung in dissoziierten Maus Riechzellen erhalten.
Methodenartikel
Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Photolyse von caged-Verbindungen ermöglicht die Produktion von schnellen und lokalisierten Anstieg der Konzentration von verschiedenen physiologisch aktive Verbindungen 1. Caged-Verbindungen sind Moleküle aus physiologisch inaktiv durch eine chemische Käfig, der durch einen Blitz von UV-Licht gebrochen werden kann. Hier zeigen wir, wie Patch-Clamp-Aufnahmen mit der Photolyse von caged-Verbindungen für das Studium der olfaktorischen Wahrnehmung in dissoziierten Maus Riechzellen kombiniert zu erhalten. Der Prozess der olfaktorischen Wahrnehmung (Abbildung 1) erfolgt in den Cilien von Riechzellen, wo Geruchsstoff Bindung an Rezeptoren führt zu einer Erhöhung der cAMP, dass zyklische Nukleotid-gesteuerte (CNG)-Kanäle 2 öffnet. Ca Eintrag durch CNG-Kanäle aktiviert Ca-aktivierte Cl-Kanäle. Wir zeigen, wie die Neuronen aus dem olfaktorischen Epithel der Maus 3 und wie CNG-Kanäle oder Ca-aktivierte Cl-Kanäle durch Photolyse von caged cAMP 4 oder caged Ca 5 aktivieren distanzieren </ Sup>. Wir verwenden eine Blitzlampe 6,7 gegenüber UV-Blitze, die Ciliargegend gelten Uncage cAMP oder Ca während Patch-Clamp-Aufnahmen getroffen werden, um den Strom in der whole-cell Voltage-Clamp-Konfiguration 8-11 messen.
Protokoll
1. Instrumentierung
- Um die Reaktion olfaktorischer Sinnesneuronen auf die Photolyse eingeschlossener Verbindungen zu messen, verwenden wir eine Blitzlampe in Kombination mit einem typischen Patch-Clamp-Aufbau, der folgende Komponenten umfasst: einen Patch-Clamp-Verstärker, eine Aufnahmeelektrode und eine Referenzelektrode, die mit dem Kopfverstärker eines Patch-Clamp-Verstärkers verbunden sind, einen Digitalisierer, einen Computer, Software zur Datenaufnahme, Mikromanipulatoren, ein Epifluoreszenzmikroskop, ein Perfusionsystem, einen Anti-Vibrations-Tisch und eine Faraday-Käfig (Abbildung 2).
- Um einen intensiven Blitz aus ultraviolettem (UV) Licht zu erzeugen, verwenden wir eine Xenon-Blitzlampe (Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit, Abbildung 3A), die funktioniert, indem ein Hochspannungskondensator über eine Kurzbogen-Blitzröhre entladen wird, die mit Xenon-Gas gefüllt ist6-7. Der Lichtblitz kann manuell oder über den Computer ausgelöst werden, wobei dieselbe Software verwendet wird, die auch die elektrophysiologische Datenaufnahme steuert.
- Ein UV-Kurzpassfilter, der für Entkäfigungsanwendungen optimiert ist (270–390 nm), wird in einen Ausgangsslot der Blitzlampe eingesetzt, und ein Quarz-Lichtwellenleiter wird mit dem Mikroskop verbunden (siehe 1.5).
- Die Intensität des Lichtblitzes und damit das Ausmaß der Photolyse kann durch Änderung bestimmter Parameter angepasst werden:
Spannung oder Kapazität6. Tatsächlich hängt die Lichtintensität von der im Kondensator gespeicherten Energie ab, die sich nach der Standardformel 0,5 CV2 aus dem Kapazitätswert und der anliegenden Spannung ergibt. Am Bedienfeld unserer Blitzlampe kann einer von drei Kapazitätswerten gewählt werden (C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF oder C3 = 3000 μF), und die Spannung kann zwischen 100 und 385 Volt variiert werden (Abbildung 3A), wodurch eine gespeicherte Energie zwischen 5 und 220 J entsteht. Die Blitzdauer variiert zwischen 0,5 und 1 ms bei voller Halbwertsbreite und hängt vom gewählten Kapazitätswert ab. Vor der Auswahl einer anderen Kapazität oder der Einstellung einer niedrigeren Spannung muss der Kondensator über den Entlademodus am Bedienfeld der Blitzlampe entladen werden (Abbildung 3A).
Die Lichtenergie steht jedoch nicht einfach im Verhältnis zur gespeicherten elektrischen Energie, da vielfältige physikalische Effekte bei Gasentladungen sowie nichtlineare Verluste im Schaltkreis bei steigender elektrischer Energie eine Rolle spielen6. Um die mit einem Lichtblitz verbundene Energie zu messen, kann ein Joulemeter wie das JM10 von RappOptoElectronics verwendet werden. Beachten Sie, dass die Energie am Ausgang des Quarz-Lichtwellenleiters mit eingesetztem UV-Filter im Bereich von 1–15 mJ pro Blitz liegt, wie im Benutzerhandbuch der Rapp OptoElectronic Flash Unit angegeben.
Eine Photodiodenanordnung (Abbildung 3B) wird zusammen mit der Blitzlampe bereitgestellt und kann verwendet werden, um Intensitätsänderungen des Lichts in Abhängigkeit von C und V abzuschätzen. Tatsächlich ist der Ausgang der Photodiode proportional zur Lichtintensität. Gemäß den Anweisungen im Benutzerhandbuch wird der Lichtleiter an den Eingang der Photodiodenanordnung angeschlossen, während der Ausgang mit einem Oszilloskop verbunden wird. Abbildung 3C zeigt die maximale Ausgangsspannung der Photodiode als Reaktion auf Lichtblitze für die drei verfügbaren Kapazitätswerte C1, C2 oder C3 unserer Blitzlampe in Abhängigkeit von der angelegten Spannung. Diese Werte ändern sich mit der Alterung der Blitzlampe. Es ist empfehlenswert, regelmäßig die Photodiode zur Überprüfung der Alterung der Blitzröhre zu verwenden.
Anstatt Kapazität und/oder Spannung am Bedienfeld zu verändern, erreicht man eine präzisere und schnellere Steuerung der Lichtintensität, indem Neutraldichtefilter in einen zweiten Filterslot der Blitzlampe eingesetzt werden (Abbildung 3A). Dieser Ansatz ist schneller, und zudem bleibt die Blitzdauer, die vom gewählten Kapazitätswert abhängt, unverändert. Mit Neutraldichtefiltern, die eine Transmission von 100 % bis 0,1 % ermöglichen, kann die Blitzintensität über einen weiten Bereich schnell justiert werden. - Der Lichtblitz wird über einen Quarz-Lichtwellenleiter auf das auf Bodengläsern kultivierte Neuron gelenkt (Abbildung 2). Der Lichtleiter wird mithilfe eines Adapters an die Epifluoreszenz-Einheit des inversen Mikroskops angeschlossen. Ein modifizierter Filterwürfel ohne Anregungsfilter leitet den UV-Strahl über einen dichroitischen Spiegel zum Neuron.
- Das Licht wird durch ein 100x-Ölimmersionsobjektiv fokussiert. Der durch den Blitz erfasste Bereich wird sichtbar gemacht, indem der Lichtleiter in einen Beleuchter eingesetzt wird, der eine kontinuierliche Quelle sichtbaren Lichts bereitstellt. Das Bild (im Video gelb dargestellt) wird über eine mit dem Mikroskop verbundene CCD-Kamera auf einem Monitor angezeigt. Der Umriss des beleuchteten Bereichs wird am Monitor eingezeichnet, um die Position des UV-Blitzes für die Experimente festzulegen. Vor der Abgabe des UV-Blitzes wird der Zilienbereich des Neurons in den am Monitor markierten Bereich gebracht.
- Die Größe des UV-Lichtflecks wird durch die Objektivvergrößerung, den Durchmesser des Lichtleiters und die Position des Lichtleiters am Rücken des Mikroskops bestimmt. Wir verwenden ein 100x-Ölimmersionsobjektiv. Der Durchmesser des kreisförmigen Flecks wird gemessen, indem Licht von einem Beleuchter auf eine Mikrometerskala gerichtet wird, die auf dem Objekttisch des Mikroskops platziert ist. Der Fleckdurchmesser beträgt in unserem Aufbau etwa 16, 33, 50 oder 105 μm bei einem Lichtleiter mit einem Durchmesser von jeweils 200, 400, 600 oder 1250 μm.
2. Lösungen herstellen
Präparation
- Ringer-Lösung: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM Glukose, 1 mM Natriumpyruvat (pH 7,4 mit 1 M NaOH eingestellt).
- Stop-Mix-Lösung: Ringer-Lösung mit 0,1 mg/ml BSA, 0,3 mg/ml Leupeptin und 0,02 mg/ml DNaseI.
- Ringer-Lösung ohne zweiwertige Kationen: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM Glukose, 1 mM Natriumpyruvat (pH 7,4 mit 1 M NaOH). Für die enzymatische Dissoziation 200 μM Cystein und 2 U/ml Papain hinzufügen.
Hinweis: Die Lösungen für die Dissektion steril filtrieren.
Lösungen für die Patch-Clamp-Aufzeichnung
Extrazelluläre Lösungen
- Extrazelluläre Ringer-Lösung: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM Glukose, 1 mM Natriumpyruvat (pH 7,4 eingestellt mit 1 M NaOH).
- Ringer-Lösung mit niedrigem Ca-Gehalt: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM Glukose, 1 mM Natriumpyruvat (pH 7,4 eingestellt mit 1 M NaOH).
Intrazelluläre Lösungen
Bereiten Sie Lösungen von „caged“-Verbindungen immer bei gedämpftem Licht vor und verwenden Sie sie auch unter solchen Bedingungen, um eine Zersetzung der „caged“-Verbindungen durch Umgebungslicht zu vermeiden. Schützen Sie die Behälter vor Licht, indem Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken.
Gesperrtes cAMP:
- Stellen Sie eine intrazelluläre Lösung her, die 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP und 0,1 mM NaGTP enthält (pH 7,4 mit 1 M KOH eingestellt).
- Stellen Sie eine Stammlösung her, indem Sie cAMP in Cages (BCMCM-cAMP4) in DMSO bei 50 mM lösen. Erstellen Sie Aliquots zu je 5 μl. Lagern Sie bis zu einem Jahr bei -20°C.
- Lösen Sie ein Aliquot der cAMP-in-Cages-Stammlösung in der intrazellulären Lösung, um eine Endkonzentration von 50 μM cAMP in Cages zu erhalten. Mischen Sie mit einem Vortex.
- Erstellen Sie Aliquots von jeweils 1 ml der intrazellulären cAMP-in-Cages-Lösung. Lagern Sie bis zu zwei Monate bei -20°C bis zur Verwendung.
Gefangenes Ca:
Wir bereiten intrazelluläre Lösungen, die 3 mM DMNP-EDTA5 enthalten, zu 50 % beladen mit 1,5 mM Ca.
- Stellen Sie eine intrazelluläre Lösung her, die 140 mM KCl (oder CsCl), 10 mM HEPES (pH 7,4 eingestellt mit 1 M KOH oder CsOH) enthält.
- Öffnen Sie ein Gefäß mit 5 mg DMNP-EDTA. Geben Sie 52,8 μl einer 0,1-M-Calciumchlorid-Standardlösung und 1 ml intrazelluläre Lösung hinzu. Mischen Sie mit einem Vortex.
- Um eine Freisetzung des verkapselten Ca durch Umgebungslicht zu vermeiden, überführen Sie die Lösung in ein mit Aluminiumfolie abgedecktes Röhrchen. Fügen Sie intrazelluläre Lösung hinzu, um ein Endvolumen von 3,5 ml zu erreichen. Mischen Sie mit einem Vortex. Portionieren Sie die verkapselte Ca-haltige intrazelluläre Lösung in Aliquots von etwa 1 ml und lagern Sie diese bis zu zwei Monate bei -20 °C bis zur Verwendung.
Hinweise: Während der Experimente lichtempfindliche Lösungen von caged-Verbindungen mit Aluminiumfolie vor Licht schützen und auf Eis lagern. Die intrazelluläre Lösung steril filtrieren.
3. Dissoziation von olfaktorischen Sinnesneuronen der Maus
Die Tiere wurden gemäß den italienischen Richtlinien für die Verwendung von Laboratoriumstieren (Decreto Legislativo 27/01/1992, Nr. 116) und den Leitlinien der Europäischen Union für Tierversuche (Nr. 86/609/EWG) behandelt.
- Bereiten Sie drei Glasboden-Dishs vor, die mit 10 mg/ml Concanavalin-A und 10 mg/ml Poly-L-Lysin beschichtet sind.
- Um die Dissektion vorzubereiten, stellen Sie 1 ml nulldivalenten Ringer-Lösung her. Füllen Sie zwei 50 mm Sylgard-beschichtete Petrischalen mit Ringer-Lösung und stellen Sie sie auf Eis. Kühlen Sie außerdem eine Papain-Cystein-Mischung, 0,5 ml der Stop-Lösung und eine Spritze mit einem 0,22 μm-Filter, die etwa 10 ml Ringer-Lösung enthält.
- Töten Sie eine Maus durch CO2-Asphyxie, gefolgt von Enthauptung. Entfernen Sie die Haut über dem Schädel, schneiden Sie entlang der Kieferlinien und legen Sie den Kopf in eine Sylgard-beschichtete Petrischale.
- Platzieren Sie die Schale unter einem Stereomikroskop. Teilen Sie den Kopf mit einem Skalpell entlang der Mittellinie sagittal. Drehen Sie eine Kopfhälfte so, dass die mediale Seite nach oben zeigt. Entfernen Sie vorsichtig das Septum, um die Conchae zu exponieren (siehe auch Cygnar et al., 201013).
- Entfernen Sie mit Pinzette Nr. 3 und einem Skalpell die Conchae, die mit dem Riechepithel ausgekleidet sind. Überführen Sie sie in eine Sylgard-beschichtete Petrischale.
- Unter Verwendung feiner Pinzette Nr. 55 lösen Sie die Stücke des Riechepithels von den anhängenden Teilen der Conchae. Überführen Sie sie in ein Reagenzglas mit 1 ml nulldivalenter Ringer-Lösung. Geben Sie die Papain-Cystein-Mischung hinzu. Zerkleinern Sie das Epithel mit Mikroscheren und inkubieren Sie drei Minuten bei Raumtemperatur. Zerkleinern Sie erneut vorsichtig mit Mikroscheren und warten Sie weitere 5 Minuten.
- Überführen Sie mit einer flammenglätteten Pasteurpipette in ein Reagenzglas mit 0,5 ml der Stop-Lösung.
- Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 300 g (1500 U/min). Entsorgen Sie das Überstand und geben Sie etwa 1 ml gefilterte Ringer-Lösung hinzu. Triturieren Sie vorsichtig mit einer flammenglätteten Pasteurpipette.
- Geben Sie etwa 0,3 ml der Zellsuspension in die Mitte der drei Glasboden-Dishs. Lassen Sie die Zellen etwa eine Stunde bei +4°C sedimentieren. Fügen Sie Ringer-Lösung hinzu.
4. Aufnahme
- Stellen Sie Patch-Pipetten aus Borosilikat-Kapillaren her, um Widerstände von 3–7 MΩ zu erreichen, wenn sie mit intrazellulärer Lösung gefüllt sind.
- Platzieren Sie eine Glas-Bodenschale, die dissoziierte olfaktorische Sinnesneuronen enthält, auf dem Objekttisch des invertierten Mikroskops. Spülen Sie mit Ringer-Lösung.
- Schützen Sie eine Spritze, die die intrazelluläre Lösung mit „caged“-Verbindungen enthält, mit Aluminiumfolie vor Licht und lagern Sie sie gekühlt. Arbeiten Sie bei gedämpftem Licht, um eine Zersetzung der „caged“-Verbindungen durch Umgebungslicht zu vermeiden.
- Suchen Sie bei 100facher Vergrößerung nach einem isolierten olfaktorischen Sinnesneuron mit intakten Zilien. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um den Zilienbereich innerhalb des auf dem Monitor eingezeichneten Kreises zu positionieren, um so den zuvor identifizierten UV-Blitz-Bereich zu lokalisieren.
- Füllen Sie eine Patch-Pipette mithilfe einer flexiblen Nadel mit der intrazellulären Lösung, die die „caged“-Verbindung enthält. Entfernen Sie Luftblasen von der Pipettenspitze. Setzen Sie die Pipette in den Halter am Kopfverstärker des Patch-Clamp-Verstärkers ein. Nähern Sie sich mit dem Mikromanipulator dem Soma des Neurons an und üben Sie sanften Unterdruck aus, um eine Gigaseal zu bilden. Stellen Sie die Spannung auf -60 mV ein und erhöhen Sie den Unterdruck, um mit standardmäßigen Patch-Clamp-Techniken den Ganzzellmodus zu erreichen12.
- Warten Sie mindestens zwei Minuten, damit sich die „caged“-Verbindung in den Zilien ausbreiten kann.
- Starten Sie am Computer ein Stimulationsprotokoll und nehmen Sie die Antwort auf. Nutzen Sie ein Tiefpassfilter bei 1 kHz und digitalisieren Sie mit einer Abtastrate von mindestens 2 kHz.
- Ein typisches Stimulationsprotokoll hält die Spannung konstant und löst einen UV-Blitz der Blitzlampe aus, um die „caged“-Verbindung im Zilienbereich durch Photolyse freizusetzen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Sie sollten in der Lage sein, eine lokale Freisetzung von „caged“ cAMP oder „caged“ Ca im Zilienbereich eines isolierten olfaktorischen Sinnesneurons zu erzeugen und die Stromantwort in der Ganzzell-Spannungsclamp-Konfiguration aufzuzeichnen.
Abbildung 4 zeigt einen typischen Innenstrom, der durch einen UV-Blitz ausgelöst wird, der die Photolyse von verkapseltem cAMP bewirkt, bei einer Spannung von -60 mV in Gegenwart einer extrazellulären Ringer-Lösung mit niedrigem Ca-Gehalt aufgezeichnet. Unter diesen Bedingungen beruht der Innenstrom auf Na-Einstrom über CNG-Kanäle. Die Anstiegsphase des Stroms war schnell und wurde durch eine einfache exponentielle Funktion mit einer Zeitkonstante von 3,4 ms angepasst.
Die Abbildungen 5A-B zeigen die Antworten eines weiteren olfaktorischen Sinnesneurons in einer Lösung mit niedrigem Ca-Gehalt und in Ringer-Lösung mit 1 mM Ca. Die Anstiegsphase des Stroms bei -60 mV wurde deutlich langsamer und mehrphasig (Abbildung 5 A-B). Dies beruht auf der Wirkung von Ca, das über CNG-Kanäle in die Zilien eindringt und einen sekundären Cl-Strom aktiviert10. Die frühere kationische Stromkomponente, die auf die Aktivierung der CNG-Kanäle zurückzuführen ist, ist in der Ringer-Lösung mit 1 mM Ca geringer als in der Lösung mit niedrigem Ca-Gehalt, bedingt durch die Blockade durch die durchdringenden Ca-Ionen, die den Gesamtstrom reduzieren.
Eine andere Möglichkeit, den Anstieg des Ca in den Cilien zu verringern, besteht darin, das Neuron bei +60 mV zu klemmen (Abbildung 5 C-D). Die aufsteigende Phase der Antwort infolge der cAMP-Freisetzung bei +60 mV ließ sich gut durch eine einfache Exponentialfunktion mit einer Zeitkonstante von 6,7 ms beschreiben, was auf das Vorhandensein nur einer Stromkomponente hinweist.
Durch die Freisetzung von Ca mittels Licht in den Zilien eines olfaktorischen Sinnesneurons sollte ein rasch ansteigender Strom messbar sein. Dieser Strom wird von Cl-Ionen getragen. Abbildung 6 A zeigt Einwärtsströme bei -50 mV, die durch die lichtinduzierte Freisetzung von gebundenem Ca in Reaktion auf UV-Blitze unterschiedlicher Intensität hervorgerufen wurden. Die Anstiegsphase der Ca-aktivierten Cl-Ströme wurde gut durch eine einfache Exponentialfunktion beschrieben, mit Zeitkonstanten zwischen 3,8 und 5 ms (Abbildung 6 B).
Abbildung 1. Olfaktorische Transduktion in den Zilien olfaktorischer Sinnesneuronen. Duftstoffmoleküle binden an Duftstoffrezeptoren (OR), wodurch ein G-Protein aktiviert wird, das seinerseits Adenylatcyclase (ACIII) aktiviert, was zu einem Anstieg des intrazellulären cAMP führt. cAMP öffnet cyclische Nukleotid-gesteuerte (CNG) Kanäle, wodurch Na- und Ca-Ionen eindringen können. Der Anstieg des intrazellulären Ca aktiviert Ca-aktivierte Cl-Kanäle. Caged-cAMP oder caged-Ca kann über eine Patch-Pipette in die Zilien eingebracht werden, wo es diffundiert. Ein Blitz aus UV-Licht bewirkt die Photolyse der caged-Verbindung (modifiziert, mit Genehmigung, nach Pifferi et al. 20062).
Abbildung 2. Das Patch-Clamp-Aufzeichnungs- und Flash-Photolyse-System. Die Komponenten des Aufbaus umfassen einen Patch-Clamp-Verstärker, einen Computer, einen Digitalisierer, ein Epifluoreszenzmikroskop, eine Xenon-Blitzlampe, eine CCD-Kamera und einen Monitor. Blaue und violette Linien zeigen jeweils den sichtbaren Licht- und UV-Lichtweg.
Abbildung 3. Xenon-Blitzlampe. (A) Lichtquelle, die zur Blitz-Photolyse verkapselter Verbindungen verwendet wurde. (B) Photodiodenmodul zur Beurteilung der Intensität des Lichtblitzes. (C) Der Lichtleiter der Blitzlampe wurde mit dem Eingang der Photodiode verbunden, und der Ausgang wurde auf einem Oszilloskop dargestellt. An dem Schalter an der Frontplatte der Blitzlampe wurde einer der drei verfügbaren Kapazitätswerte (C1, C2 oder C3) ausgewählt, und die Spannung wurde durch Drehen des Knopfs an der Frontplatte verändert. Die Ausgangsspannung der Photodiode als Reaktion auf unterschiedliche Blitzintensitäten wurde in Abhängigkeit von der angelegten Spannung für jeden Kapazitätswert aufgetragen: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF oder C3 = 3000 μF. Ein Lichtleiter mit einem Durchmesser von 600 μm wurde verwendet.
Abbildung 4. Patch-Clamp-Aufzeichnung als Reaktion auf die Photolyse von gebundenem cAMP in einer extrazellulären Lösung mit niedrigem Ca²⁺-Gehalt. (A) Ganzzellstromantwort, hervorgerufen in einem isolierten olfaktorischen Sinnesneuron durch Photolyse von gebundenem cAMP, lokalisiert in den Zilien. Ein UV-Blitz wurde zum Zeitpunkt freigesetzt, der durch den Pfeil angegeben ist. Das Haltepotential betrug -60 mV. (B) Die ansteigende Phase des Stroms wurde gut durch eine einfache exponentielle Funktion (gestrichelte Linie) mit einer Zeitkonstante von 3,4 ms beschrieben.
Abbildung 5. Stromantworten, hervorgerufen durch Photolyse von verkapseltem cAMP in Lösung mit niedrigem Ca-Gehalt und in Ringer-Lösung. (A) Ein olfaktorischer Sinnesneuron wurde in Ringer-Lösung mit 1 mM Ca oder in einer Lösung mit niedrigem Ca-Gehalt bei einem Haltepotential von -60 mV gehalten. Ein UV-Blitz wurde zum Zeitpunkt freigegeben, der durch den Pfeil angegeben ist. (B) Die Stromantworten, auf einer vergrößerten Zeitskala dargestellt, zeigten in Ringer-Lösung eine mehrphasige Anstiegsphase, während die Anstiegsphase in der Lösung mit niedrigem Ca-Gehalt gut durch eine einfache exponentielle Funktion (gestrichelte Linie) mit einer Zeitkonstante von 3,5 ms beschrieben werden konnte. (C) Stromantworten desselben Neurons, wie in (A) gezeigt, in Ringer-Lösung bei einem Haltepotential von -60 mV und +60 mV. (D) Die Stromantworten, auf einer vergrößerten Zeitskala dargestellt, zeigten bei -60 mV eine mehrphasige Anstiegsphase, während bei +60 mV die Anstiegsphase gut durch eine einfache exponentielle Funktion mit einer Zeitkonstante von 6,7 ms (gestrichelte Linie) beschrieben werden konnte.
Abbildung 6. Antworten auf die Photolyse von gebundenem Ca. (A) Ganzzellströme, hervorgerufen durch Photolyse von gebundenem Ca bei -50 mV. UV-Blitze wurden zum Zeitpunkt freigegeben, der durch den Pfeil angegeben ist. Die Blitzintensitäten wurden mit Neutraldichtefiltern variiert. (B) Vergrößerte Zeitskala zeigt den schnellen Anstieg des Stroms nach der Freisetzung von Ca mittels Licht. Die Ströme wurden gut durch eine einfache exponentielle Funktion (gestrichelte Linien) beschrieben, mit Zeitkonstanten von 5, 4,8, 3,8 ms. (Nachgedruckt mit Genehmigung aus Boccaccio & Menini, 200710).
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Diskussion
Flash-Photolyse von caged Verbindungen mit Patch-Clamp-Aufnahmen kombiniert ist eine nützliche Technik, um schnelle und lokale Sprünge in der Konzentration der physiologisch aktive Moleküle sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zellen zu erhalten. Mehrere Arten von Käfigen Verbindungen1 wurden synthetisiert, und diese Technik kann auf verschiedene Arten von Zellen, einschließlich kultivierten Zellen, die Ionenkanäle, die aktiviert oder moduliert werden durch Photolyse von einigen der verfügbaren caged Verbindungen
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ausrüstung | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Adapter-Modul Flash-Lampe Mikroskop | Rapp Optoelectronic | Blitzwürfel 70 | |
| Air Tisch | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322a | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Spiegel für Adapter-Modul | Rapp Optoelectronic | M70/100 | |
| Elektrodenhalter | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday-Käfig | Custom made | ||
| Filter-Würfel | Olymp | U-MWU | Excitation Filter entfernt |
| Flash-Lampe | Rapp Optoelectronic | JML-C2 | |
| Pinzetten Dumont Nr. 55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Glaskapillaren | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Glasboden Gericht | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Illuminator | Olymp | Highlight 3100 | |
| Inverse Mikroskop | Olymp | IX70 | |
| Mikromanipulatoren | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutralfilter | Omega Optical | variiert | |
| Ziel 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Entweder Zeiss oder Olympus |
| Ziel 100X | Olymp | UPLFLN 100XOI2 | Entweder Zeiss oder Olympus |
| Optische UV Kurzpassfilter | Rapp Optoelectronic | SP400 | |
| Patch-Clamp-Verstärkers | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp Optoelectronic | PDA | |
| Quartz-Lichtleiter | Rapp Optoelectronic | variiert | Wir verwenden 600 pm Durchmesser |
| Silberdraht | World Precision Instruments | AGT1025 | |
| Silber Boden Pellet | Warner Instrumente | 64-1309 | |
| Xenon-Bogenlampe | Rapp Optoelectronic | XBL-JML |
| Reagens | Firma | Katalog-Nummer |
|---|---|---|
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2-Standard-Lösung 0,1 M | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cystein | Sigma | C9768 |
| Concanavalin A-Typ V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAse I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glucose | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptin | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papain | Sigma | P3125 |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Referenzen
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- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
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- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
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