Vorhersage von HIV-1 Korezeptor Usage (Tropismus) durch Sequenzanalyse mit einem Genotypische Ansatz

Summary

Die Vorhersage des Korezeptor Nutzung von HIV-1 ist für die Verwaltung einer neuen Klasse von antiretroviralen Medikamenten, dh Korezeptor-Antagonisten erforderlich. Es kann durch Sequenzanalyse die durchgeführt werden Env Gens und anschließende Interpretation durch eine Internet-basierte Interpretation Systems (geno2pheno _[Korezeptor]).

Abstract

Maraviroc (MVC) ist der erste lizenzierte antiretrovirale Medikament aus der Klasse der Korezeptor-Antagonisten. Es bindet an den Host Korezeptor CCR5, das von der Mehrzahl der HIV-Stämme verwendet, um die humanen Immunzellen (Abb. 1) zu infizieren. Andere HIV-Isolate eine andere Korezeptor, die CXCR4. Welcher Rezeptor verwendet wird, wird in dem Virus vom Env-Protein (Fig. 2) bestimmt. Abhängig von der Korezeptor verwendet, werden die Viren als R5 oder X4, bzw. klassifiziert. MVC bindet an den CCR5-Rezeptor Hemmung der Eintrag von R5 Viren in die Zielzelle. Im Verlauf der Erkrankung kann X4-Viren entstehen und wachsen die R5-Viren. Bestimmung der Korezeptor Nutzung (auch als Tropismus) ist daher zwingend vor der Verabreichung von MVC, wie EMA und FDA gefordert.

Die Studien für MVC Effizienz MOTIVATE MERIT und 1029 wurden mit dem Trofile Assay von Monogram, San Francisco, USA durchgeführt Dies ist ein qualitativ hochwertiges Assay basierend auf sophisorgfältigster Bearbeitung rekombinanten Tests. Die Akzeptanz für diesen Test für die tägliche Routine ist eher gering außerhalb der USA, da die europäischen Ärzten eher mit dezentralen Experten Labors, die auch gleichzeitige Resistenztestung meidet. Diese Laboratorien haben mehrere Qualitätssicherung Auswertungen, die letzte in 2011 ¹ präsentiert unterzogen.

Seit einigen Jahren haben wir Tropismus Bestimmungen basierend auf Sequenzanalyse von der HIV env-V3-Genregion (V3) ² durchgeführt. Diese Region trägt genügend Informationen, um eine zuverlässige Prognose durchführen. Die genotypische Bestimmung der Korezeptor Nutzung stellt Vorteile wie: kürzere Umschlagszeit (entspricht Resistenztestung), niedrigere Kosten, die Möglichkeit, die Ergebnisse an die Bedürfnisse der Patienten anzupassen und die Möglichkeit der Analyse von klinischen Proben mit sehr geringer oder gar nicht nachweisbare Viruslast (VL ), zumal die Zahl der Proben mit VL analysiert <1000 Kopien / uletwa in den letzten Jahren erhöht (Abb. 3).

Die wichtigsten Schritte für Tropismus-Tests (Abb. 4) zeigt in diesem Video:

Ein. Sammeln einer Blutprobe
2. Isolierung der HIV-RNA aus dem Plasma und / oder HIV proviralen DNA aus mononukleären Blutzellen
3. Amplifikation des env-Bereich
4. Amplifikation der V3-Region
5. Sequenzreaktion des V3 Amplikon
6. Aufreinigung der Sequenzierungsproben
7. Sequenzierung der gereinigten Proben
8. Sequence Editing
9. Sequenzierung Dateninterpretation und Tropismus Vorhersage

Protocol

Das Protokoll ist in Abb. zusammengefasst. 4.

Ein. Entnahme von Blutproben

1. Sammeln Sie mindestens 3 ml Blut in EDTA-Röhrchen in der klinischen Seite.
2. Die Proben können bis zu einer Woche lagern bei 4 ° C.
3. Senden Sie die EDTA-Blutproben so bald wie möglich an das Labor auf dem normalen Postweg.

2. Isolierung von HIV-RNA und / oder DNA

1. Erhalten virale RNA und / oder DNA von 1000 ul Vollblut, Serum oder Plasma, mit dem MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation I Kit I und die MagNA Pure Compact System.
2. Eluieren die gewonnenen RNA oder DNA in 50 ul TE-Puffer. Alternativ können andere Nukleinsäuren Reinigungsverfahren verwendet werden.

3. Amplifikation des env-Bereich

Verstärken des env-Bereich (2 und 4) entweder von Plasma-RNA oder proviraler DNA. Ein 1245 bp langes Produkt, das den Großteil des Env-Proteins (nt 6556-7811 according bis HXB2) erzeugt wird.

1. RNA-Proben: RT-PCR-Reaktion
   1. Virale RNA stellt eine sehr komplexe Sekundärstruktur (Abb. 4), die die RT-Reaktion zu behindern kann. Um dieses Problem zu vermeiden, inkubieren 10 ul RNA bei 65 ° C für 10 Minuten (bereits in der PCR-Röhrchen und in der PCR-Maschine) und dann die Temperatur auf 50 ° C.
   2. Fügen Sie 40 ul des PCR Master Mix einschließlich der Primer Env-F und Env-R.
      
      Master Mix für die RT-PCR In-House-System:
      

      	Volumen / Reaktion (ul)	Endkonzentration
      RNase-free H 2 O	14,4
      5x Puffer (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	10	1x
      5x Q-Solution	10	1x
      dNTP Mix (10 mM)	2	400 uM von jedem dNTP
      Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0,3	0,6 uM
      RNase-Inhibitor (RNasin)	1	5 Einheiten / Reaktion

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 nach HXB2)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   3. Führen die RT-Reaktion bei 50 ° C für 30 Minuten.
   4. Ausführen des ersten PCR wie folgt:
      
      

      95 ° C, 15min	1 x
      95 ° C, 30 Sek. 50 ° C, 30 Sek. 72 ° C, 2 min
      95 ° C, 30 Sek. 56 ° C, 30 Sek. 72 ° C, 2 min	38 x
      72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

      1 x
2. DNA-Proben: PCR-Reaktion
   
   Für proviralen DNA-Proben wird kein anfänglichen RT-Reaktion benötigt wird, und die PCR-Reaktion kann direkt starten.
   1. Fügen Sie 40 ul PCR Master Mix bis 10 ul provial DNA.
      
      
      Master Mix für die PCR-In-House-System:
      

      	Volumen / Reaktion (ul)	Endkonzentration
      RNase-free H 2 O	15,4
      5x Buffer (HotStarTaq DNA Polymerase)	10	1x
      5x Q-Solution	10	1x
      dNTP Mix (10 mM)	2	400 uM von jedem dNTP
      Enzym-Mix (HotStarTaq DNA Polymerase)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0,3	0,6 uM

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   2. Führen Sie die PCR-Bedingungen wie zuvor für RNA-Proben (Schritt 3.1.4) beschrieben.

4. Amplifikation der V3-Region: nested PCR

1. Für die verschachtelte PCR, verwenden 5 ul aus der ersten PCR-Reaktion (ohne vorherige Analyse in Agarosegel) als Matrize und fügen 95 ul PCR Master Mix.
   
   Master Mix für Nested-In-House PCR

   	Volumen / Reaktion (ul)	Endkonzentration
   H 2 O	61,9
   10x PCR Buffer	10	1x
   5x Q-Solution	20	1x
   dNTP Mix (10 mM)	2	200 uM von jedem dNTP
   Primer Env-2F (100 uM)	0,3	0,6 uM
   Primer Env-2R (100 uM)	0,3	0,6 uM
   HotStarTaq DNA Polymerase	0,5	2,5 Einheiten / Reaktion

   
   
   Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864)
   
   
2. Führen Sie die PCR wie folgt:

   93 ° C, 15min	1 x
   95 ° C, 30 Sek. 50 ° C, 30 Sek. 72 ° C, 90 Sek.	1 x
   95 ° C, 30 Sek. 56 ° C, 30 Sek. 72 ° C, 90 Sek.	43 x
   72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

3. Analysieren des PCR-Produkts auf einem 1% Agarosegel (Abb. 4). Das erwartete Produkt ist 902 bp langen.
4. Aufreinigung der Sequenzierungsproben.
   1. Reinige das PCR-Produkt mit dem Qiagen PCR-Purification-Kit, mit dem Protokoll, Lösungen und Mikro-Spalten, die vom Lieferanten zur Verfügung gestellt. Eluieren in 30-100 ul PE-Puffer, je nach Bandenintensität.
   2. Alternativ können die Proben unter Verwendung von Exonuklease werdenI und Fast AP (Thermo alkalische Phosphatase). Zu diesem Zweck fügen Sie 6 ul Exo-AP Mix bis 15 ul PCR-Produkt und inkubieren 15 Minuten bei 37 ° C.

      580 ul H 2 O

      66 ul schnelle AP

      13,4 ul Exo I

5. Sequenzreaktion des V3 Amplikon

1. Die Sequenz besteht aus einer Reaktion PCR-Reaktion unter Verwendung nur eines der folgenden Primer:
   
   Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980)
   Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371)
   Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000)
   Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549)
   Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507)
   Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664)
   Erste Wahl Primer sind: Env-2, Env-6 oder Env-7, Env-11
2. Verwenden Sie 1 ul aus dem gereinigten V3 Amplikon als Vorlage und fügen 9 ul PCR Master-Mix.
   
   Sequenzierung Master Mix:

   4 ul-Sequenz Mix (HIV-Genotypisierung Kit)

   4 ul H 2 O

   1 ul Primer (100 pmol / ul)

3. Führen Sie die Reihenfolge Reaktion wie folgt:

   96 ° C, 10 Sek.
   50 ° C, 10 Sek.	36 x
   60 ° C, 45 Sek.
   4 ° C ∞

6. Aufreinigung der Sequenzierungsproben

Entschlacken Sequenzen using Sephadex G-50 superfine.

1. Füllen Sie die entsprechende Anzahl von Brunnen in der Spalte "loader" mit Sephadex G-50 superfine. Übertragen der Sephadex zur Filterplatte MAHVN4510 durch Umdrehen.
2. Fügen Sie 300 ul Milli-Q H ₂ O in jede Vertiefung in der Filterplatte und inkubieren Sie es für mindestens 3 Stunden bei 2-8 ° C.
3. Zentrifuge die Platten für 5 min bei 910Xg und 4-15 ° C. Entsorgen Sie die Durchströmung.
4. Fügen Sie 10 ul H ₂ O zu der Sequenz Produkt und dann Pipette der Sequenz auf dem gequollenen Sephadex Platte.
5. Um das gereinigte Produkt erhalten, zentrifugieren die Platte für 5 min. bei 910Xg und 4-15 ° C und der Durchfluss gesammelt.

7. Sequenzierung der gereinigten Proben auf dem Sequenzer ABI Prism 3130 XL

1. Vor jedem Lauf, ändern Sie die Puffer und prüfen Sie die Lautstärke des Polymers (POP7). Wenn nötig, ersetzen Sie die alte Polymer Kolben durch einen neuen ersetzen.
2. Verwenden Sie die gespeicherten Lauf Bedingungen, einschließlich einer Injektion von 18 Sekunden.
3. In dieser Maschine erfolgt die Sammlung der Signaldaten einen Lauf mit 16-Sequenz Proben etwa 60 min (36 cm Kapillare) oder 150 min (50 cm Kapillare).

8. Sequence Editing

1. Verwenden Sie das Programm Lasergene (DNA-Star) zum Ausrichten und bearbeiten Sie die Sequenzen (Abb. 5). Anderen Sequenz Bearbeitungsprogramme können verwendet werden. Verwenden Sie ein "V3-Consensus B" und das env Konsensussequenz als Referenzen.
2. Lasergene schafft eine Konsensussequenz der analysierten Probe mit allen Rohdaten und speichern es als FASTA Datei. Die FASTA-Datei ist eine Textdatei, die einen Header mit dem Namen der Probe und der Nukleotidsequenz enthält.

9. Sequenzierung Dateninterpretation und Tropismus Vorhersage

1. Sequenzierung Interpretation der Daten wird durch die web-basierte Interpretation System durchgeführt geno2pheno _[Korezeptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Für den Tropismus Vorhersage, können verschiedene FPR-Einstellungen gewählt werden. Die Standardeinstellung ist nach den deutsch-österreichischen Therapierichtlinien. Für FPR ≥ 20%, wird das Virus als R5 klassifiziert, wenn FPR ≥ 20% und X4 für FPR <12,5%.
2. Laden Sie die FASTA-Datei in dem Server. Dieser Server übersetzt die Nukleotidsequenz in Aminosäuren, fluchtet sie mit der V3-Consensus-Sequenz B und ergibt ein Subtyp Klassifizierung. Darüber hinaus erzeugt er eine Vorhersage des Korezeptor Nutzung (Abb. 4), ausgedrückt als falsch positiv Rate (FPR).

10. Repräsentative Ergebnisse

Die geno2pheno _[Korezeptor] Ausgabe zeigt eine abgestufte Interpretation des Tropismus. Je nach der Wahrscheinlichkeit des Korezeptor Nutzung variiert die Auslegung Text-und Hintergrundfarbe von grün (<20% FPR), was auf eine sichere Verwaltung für MVC, zu gelb, was auf eine mögliche, mit geringem Risiko und schließlich auf rot. Rot ist die Farbe deutenING nicht MVC verschreiben. Darüber hinaus erzeugt der Server eine pdf Bericht gedruckt werden können, gefüllt mit Patienten und Sample-Daten, und an den Arzt. Beispiele für geno2pheno _[Korezeptor] Ausgang sind in Abb. 6.

Abbildung. Ein. Schematische Replikation von HIV. Das Virion muss den zellulären CD4-Rezeptor binden und so die CCR5 oder CXCR4 als Korezeptor entweder. Die Korezeptor CCR5 mit CCR5-Antagonisten wie Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry) blockiert werden. Nach dem Verschmelzen der viralen und zellulären Membranen wird das Virus-Nucleocapsid im Zytoplasma freigesetzt. Das Nukleokapsid zerlegt und die virale RNA-Komplex freigesetzt wird in das Zytoplasma. Die virale reverse Transkriptase (RT) der genomischen RNA transkribiert in provirale DNA, die dann in den Zellkern transportiert wird, und integriert in das Genom des Wirts durch die HIV-Integrase. Zellulären RNA-Polymerasen transcribe viralen Genom-und Boten-RNAs aus dem Provirus Genom. Die viralen Proteine ​​werden im Cytoplasma hergestellt und transportiert, um der Zelloberfläche. Die Viruspartikel Knospe als unreifen, nicht-infektiösen Virionen aus den Zellen. Die HIV-Protease spaltet die Proteine ​​produzieren, um infektiöse Partikel. Hemmung der einen der Schritte führt zu einer Unterbrechung des Replikationszyklus.

Die antiretrovirale Medikamente und die Replikation Schritt, dass sie verhindern, sind rot markiert.

Die viralen RNA und Provirus-DNA (Material für Tropismus oder Widerstand Analyse verwendet) sind grün markiert.

Abbildung 2. HIV Provirus Genom. Die HIV-Partikel mit unterschiedlichen strukturellen Proteinen und beherbergt verschiedene Enzyme und Proteine ​​sowohl von viralen und zellulären Ursprungs gebaut. Die Abbildung zeigens die Position der Gene innerhalb des viralen Genoms. Die Oberflächenproteine ​​gp120 und gp41 darstellen Spikes auf der Oberfläche des Virions und den Kontakt zum menschlichen Zelle, um die Membranfusion durchzuführen. Im unteren Teil der Figur sind die PCR-Amplifikationsprodukte und die Primer im Protokoll gezeigt.

Abbildung 3. Anteil der Patienten mit einer niedrigen Viruslast (VL)-Messungen für Drogen-Resistenz oder Tropismus Bestimmung am Institut für Virologie, Universität Köln (Deutschland) analysiert.

Abbildung 4. Insgesamt Schema des Experiments .. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur sehen.

Abbildung 5. Sequenz Bearbeitung mit Lasergene. Die V3 Amplikon mit mindestens einem Vorwärts-und einem Rückwärts-Primer sequenziert wird. Lasergene alignés die ". Abi" Dateien aus dem Sequenzer mit dem Referenz-Sequenzen "V3-Consensus B" erhalten und env. Lasergene schafft eine Konsensus-Sequenz mit allen Zeilen zur Verfügung. Die Referenz-Sequenzen können markiert (und werden dann in grau dargestellt) werden, damit sie nicht zu der Probe Konsensussequenz nicht beitragen.

Abbildung 6. Tropismus Vorhersage Berichte des geno2pheno generiert _[Korezeptor] tool.The Berichte werden als PDF-Dateien, die gespeichert und fertig im Computer generiert. Zusätzliche Daten wie uns Name des Patienten, das Datum der Blutentnahme, etc., können manuell aufgenommen werden mittels eines pdf writer Programm. Besondere Bemerkungen können ebenfalls hinzugefügt werden. These Daten sind ausschließlich auf dem Computer des Benutzers und nicht auf der geno2pheno _[Korezeptor] server. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur sehen.

Discussion

Die V3-Sequenz erlaubt eine zuverlässige virale Tropismus Vorhersage, wie in klinischen Studien ^3-9 gezeigt. In der Tat ist genotypischen Bestimmung in der geltenden europäischen und deutsch-österreichischen Richtlinien ¹⁰ vorgesehen.

Verglichen mit phänotypischen Testung, wird nicht nur die Zeit, die kürzer Umsatz (entspricht Resistenztestung), sondern auch die Kosten. Darüber hinaus ist ein großer Vorteil der genotypischen Tests, dass die Ergebnisse als FPR werden benotet und kann daher auf die Bedürfnisse der Patienten angepasst werden. Trofile Ergebnisse, auf der anderen Seite, sind einfach R5 oder X4 Berichten und den Zugang zu den Rohdaten wird nicht gegeben.

Derzeit deuten die europäischen Richtlinien eine FPR Cut-off von 20% ^10, während die österreichisch-deutschen Richtlinien zur Anpassung der FPR cut-off speziell für jeden Patienten die Bedürfnisse ^{11 zu} ermöglichen. In dieser Linie für Patienten mit einem breiten Spektrum von antiretroviralen Medikamenten Möglichkeiten, höhere FPR cut-offs (> 20%) sind empfbeendet. Umgekehrt bei stark vorbehandelten Patienten mit begrenzten therapeutischen Optionen unteren FPR cut-offs (> 5%) verwendet werden. Diese Art der Therapie Führung ist derzeit laufenden durch den Widerstand testet den NRTIs, NNRTIs, PIs und INIs, wo teilweise wirksamen Arzneimitteln in der Behandlung von Patienten mit eingeschränkter therapeutischer Optionen enthalten sein können. Darüber hinaus mit der wachsenden Zahl von genotypisch-gestützte Therapie Veränderungen, die klinisch relevanten FPR cut-offs werden ständig von einer Jury aus Bioinformatiker, Virologen und Mediziner eingestellt.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der genotypischen Tropismus Tests ist die Möglichkeit zur Analyse klinischer Proben mit sehr geringen oder gar Viruslast (VL). In diesen Fällen, wenn Plasma RNA nicht amplifizierbare kann der Provirus-DNA sequenziert werden und für zuverlässige Vorhersagen ^9,12. Zu beachten ist, ist die Zahl der Patienten mit niedrigen oder nicht nachweisbaren Viruslast stark in den letzten Jahren zugenommen. Bis heute hat die Trofile Assay erlaubt nur die Analyse von Proben von Patienten mit VL <1000 Kopien / ml. Allerdings haben Voruntersuchungen gezeigt, dass Provirus-DNA kann auch sein adecuate durch Trofile ¹³ getestet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I	Roche Diagnostics	04 802 993 001
MagNA Pure Compact System	Roche Diagnostics	03731146001
T3000 Thermocycler	Biometra	050-723
One Step RT-PCR Kit	Qiagen	210215
HotStarTaq Master Mix Kit	Qiagen	203445
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Exonuklease I (Exo I)	Fermentas	EN0582
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase	Fermentas	EF0651
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystems	4337457
Sephadex G-50 Superfine	GE Healthcare	17-0041-01
ABI Prism 3130 XL Kapillarsequenzer	Applied Biosystems	3130xl