GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung

Zusammenfassung

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) ist eine automatisierte Plattform für die Entdeckung und Optimierung von Enzym-Cocktails für Biomasse Abbau. Es kann zu mehreren Rohstoffen und Mischungen von Enzymen, die mehrere Komponenten angepasst werden.

Zusammenfassung

Die hohen Kosten von Enzymen für die Biomassezersetzung sind ein wesentliches Hindernis für die wirtschaftliche Umwandlung von lignocellulosehaltigen Rohstoffen in flüssige Verkehrskraftstoffe wie Ethanol. Wir haben eine integrierte Hochdurchsatzplattform namens GENPLAT zur Entdeckung und Entwicklung neuartiger Enzyme und Enzymcocktails für die Freisetzung von Zuckern aus unterschiedlichen Vorbehandlungs-/Biomasse-Kombinationen entwickelt. GENPLAT besteht aus vier Elementen: einzelnen reinen Enzymen, statistischem Versuchsdesign, robotergestützter Pipettierung von Biomassesuspensionen und Enzymen sowie automatisierter farbmetrischer Bestimmung der freigesetzten Glc- und Xyl-Mengen. Einzelne Enzyme werden durch Expression in Pichia pastoris oder Trichoderma reesei hergestellt oder chromatographisch aus kommerziellen Cocktails beziehungsweise aus Extrakten neuartiger Mikroorganismen gereinigt. Simplex-Gitter-Mischungsmodelle (fraktionale faktorielle Modelle) werden mithilfe kommerzieller statistischer Versuchsplanungssoftware erstellt. Enzymgemische hoher Komplexität werden mittels robotergestützter Pipettierung im 96-Well-Format zusammengestellt. Die Messung der freigesetzten Glc- und Xyl-Mengen erfolgt automatisiert durch enzymgekoppelte farbmetrische Assays. Optimierte Enzymgemische mit bis zu 16 Komponenten wurden an einer Vielzahl von Rohstoff- und Vorbehandlungskombinationen getestet.

GENPLAT ist anpassbar für Gemische aus reinen Enzymen, Gemischen kommerzieller Produkte (z. B. Accellerase 1000 und Novozym 188), Extrakten neuartiger Mikroben oder Kombinationen daraus. Zur Herstellung und Prüfung von Gemischen aus ˜10 reine Enzyme benötigen weniger als 100 μg jedes Proteins und weniger als 100 Gesamtreaktionen, wenn mit einer endgültigen Gesamtladung von 15 mg Protein/g Glucan gearbeitet wird. Wir verwenden Enzyme aus verschiedenen Quellen. Enzyme können aus natürlichen Quellen wie Pilzkulturen (z. B. Aspergillus niger, Cochliobolus carbonumund Galerina marginata) oder sie können durch Expression der kodierenden Gene (aus der wachsenden Zahl mikrobieller Genomsequenzen gewonnen) in Wirtsorganismen wie E. coli, Pichia pastorisoder einen fadenförmigen Pilz wie T. reeseiProteine können auch aus kommerziellen Enzymcocktails (z. B. Multifect Xylanase, Novozyme 188) gewonnen werden. Eine zunehmende Zahl reiner Enzyme, darunter Glycosylhydrolasen, esterolytisch wirkende Zellwandenzyme, Proteasen und Lyasen, ist über kommerzielle Anbieter erhältlich, z. B. Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) und PROZOMIX (www.prozomix.com).

Die Software Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) wird verwendet, um Simplex-Raster-Designs zu erstellen und Reaktionen (in diesem Fall die Freisetzung von Glc und Xyl) zu analysieren. Die Mischungen enthalten 4–20 Komponenten, deren Anteile zwischen 0 und 100 % variieren können. Zu den Versuchspunkten gehören typischerweise die äußeren Eckpunkte sowie eine ausreichende Anzahl dazwischenliegender Punkte, um ein gültiges Modell zu generieren. In der Terminologie des Versuchsdesigns handelt es sich bei den meisten unserer Studien um „Mischungs“-Experimente, was bedeutet, dass die Summe aller Komponenten einer festgelegten Gesamtproteinzuladung entspricht (angegeben als mg/g Glucan). Die Anzahl der Mischungen im Simplex-Raster hängt sowohl von der Anzahl der Komponenten in der Mischung als auch vom Grad des Polynoms (quadratisch oder kubisch) ab. Beispielsweise umfasst ein Experiment mit sechs Komponenten 63 separate Reaktionen mit einem erweiterten speziellen kubischen Modell, das Dreifachwechselwirkungen erfassen kann, während nur 23 einzelne Reaktionen mit einem erweiterten quadratischen Modell erforderlich sind. Bei Mischungen mit mehr als acht Komponenten ist ein quadratisches Versuchsdesign praktikabler, und nach unserer Erfahrung sind solche Modelle in der Regel statistisch valide.

Alle Enzymmengen werden als Prozentsatz der endgültigen Gesamtmengen angegeben (die in unseren Experimenten typischerweise 15 mg Protein/g Glucan beträgt). Für „Kern“-Enzyme ist die untere Prozentschranke auf 5 % festgelegt. Diese Schranke leitet sich aus unseren Erfahrungen ab, wonach die Ausbeuten an Glc und/oder Xyl sehr gering waren, wenn eines der Kernenzyme in einer Konzentration von 0 % vorlag. Schlechte Modelle entstehen, wenn zu viele Proben sehr niedrige Glc- oder Xyl-Ausbeuten zeigen. Die Festlegung einer unteren Grenze bestimmt zugleich eine obere Grenze. Das heißt, bei einem Experiment mit sechs Komponenten beträgt, wenn die untere Grenze für jede einzelne Komponente bei 5 % liegt, die obere Grenze jeder einzelnen Komponente 75 %. Die unteren Grenzen für alle anderen als „zusätzlich“ betrachteten Enzyme sind auf 0 % festgelegt. Die Bezeichnungen „Kern“ und „zusätzlich“ sind teilweise willkürlich und variieren je nach Substrat, aber in unseren Studien umfassen die Kernenzyme zur Freisetzung von Glc aus Maisstover die folgenden Enzyme aus T. reesei: CBH1 (auch bekannt als Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-Glucosidase), EX3 (Endo-β1,4-Xylanase, GH10) und BX (β-Xylosidase).

Protokoll

1. Enzymproduktion

1. Produzieren Proteine ​​in Pichia pastoris durch Klonierung der entsprechenden Gene in Vektoren pPICZ oder pPICZα und die Umwandlung in P. pastoris. Wachsen Zellen in 300-ml Ansätzen in verblüffte 500-ml-Kolben mit Methanol Induktion alle 24 h (Banerjee et al., 2010a).
2. Konzentrieren Sie sich und entsalzen die Kultur Filtrate durch Tangentialflussfiltration.
3. Bewahren Sie die Enzyme in kleinen Portionen in 20% Glycerin bei -80 ° C. Der Konzentrationsbereich ist 1-10 mg / ml.

2. Design of Experiment

1. Geben Sie die Anzahl der Enzyme getestet werden, deren obere und untere Proportionen (zB einen geringeren Anteil von 5% für Kern-Enzyme), und die Art des experimentellen Designs (zB quadratisch oder kubisch) in die Design-Expertsoftware.
2. Berechnen Sie die Menge in ug jedes Enzym hinzugefügt, um eine Gesamtbelastung von 15 mg / g Glucan zu machen, und dann berechnen die Höhe des jeweiligen Enzyms in ul zu ergänzenjede Reaktion.
3. Generate Excel-Arbeitsblätter Angabe Quelle Laborgeräte, Quelle Brunnen, Ziel-geräte, Ziel Brunnen und Transfervolumen für die Abgabe von Wasser und Enzymen nach dem experimentellen Design und importieren Sie es in der Biomek FXP Software mit dem Transfer-from-Datei-Funktion.

3. Enzymatische Hydrolyse

1. Suspend der Biomasse Gülle in 50 mM Natriumcitrat, pH 4,8, enthält 5 pg / ml Tetracyclin und 5 pg / ml Cycloheximid, in dem Paddel Reservoir.
2. Robotically pipet 200 ul der Gülle in jede Vertiefung einer 96-Well-Deep-Well-Platten mit Reaktion Span-8-1000-ul Pipettenspitzen mit den letzten 0,5 cm abgeschnitten. Mix der Schlamm einmal bei 100 ul / sec und dann absaugen das gleiche Volumen aus dem Paddel Reservoir und verzichten in den Platten.
3. Dispense die Enzyme in die gleiche Platte mit dem Programm in den Beckman FX eingetragen.
4. Seal die Platten mit durchstechbarer CapMats.
5. Invert und tippen Sie aufdie Platten mehrfach zu überwinden Oberflächenspannung. Legen Sie die Platten bei 50 ° C für 48 Stunden in der Hybridisierung Inkubator rotierenden bei 10 Umdrehungen pro Minute.

4. Bestimmung von Glc und Xyl

1. Centrifuge die Reaktion Platten für 3 min bei 1250 xg in einem Ausschwingrotor zentrifugiert.
2. Transfer 100 ul des Überstands in reguläre 96-Well-Platten mit dem AP96 pod des Biomek FX.
3. Die Inkubation bei 90-95 ° C für 10 min, um die Enzyme zu inaktivieren, und dann Zentrifuge bei 1250 xg für 30 sec.
4. Für Glc Messungen, Transfer 12 ul der Überstände in regelmäßigen 96-Well-Platten. Addieren Sie 192 hinzu ul der Glucose-Oxidase / Peroxidase (GOPOD) Reagenz. Die Inkubation bei 50 ° C für 20 min und die Absorbanz bei 510 nm in einem Mikroplatten-Reader. Blank ist Reaktionsgemisch ohne Enzym.
5. Für Xyl Messungen, Transfer 4 ul in 384-Well-Platten. Fügen Sie den Reagenzien des Assays und lesen Sie die Platten bei 340 nm. Leerwird das Reaktionsgemisch ohne Enzym.

5. Data Analysis

1. Konvertieren Sie die Extinktionswerte auf ihre% Glc und Xyl Renditen auf den bekannten Glc und Xyl Inhalt der ursprünglichen Biomasse. Importieren Sie diese Prozentsätze wie die Reaktionen in den Design-Expert-Software. Überprüfen Sie die statistischen Parameter umfassen, um sicherzustellen, dass die Kriterien für eine robuste Modell erfüllt sind.
2. Bestätigen Sie das beste Modell Vorhersage experimentell.

6. Repräsentative Ergebnisse mit GENPLAT:

(1) Erstellung von optimierten Mischungen der einzelnen reine Proteine. Die Ergebnisse zeigen, welche Enzyme wichtig sind, und in welchem ​​Verhältnis, und auch die Enzyme sind nicht wichtig. Einige Proteine, die reichlich vorhanden sind in der T. reesei Sekretom (Nagendran et al., 2009), wie Cip1 und Cip2, scheinen keine Rolle in Glc Lüftspiel aus Maisstroh vorbehandelt durch Ammoniak-Faser-Erweiterung (AFEX) oder alkalische hyd rogen Peroxid (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Auf der anderen Seite sind einige Proteine ​​unerwartet wichtig. Zum Beispiel sind Endo-Xylanasen von Glykosylhydrolase Familien 10 und 11 sowohl für Glc Freisetzung wichtig, eine Xylanase kann nicht für die anderen (. Banerjee et al, 2010b, c) zu ersetzen. Cel61A, eine kleine Protein in der T. reesei Sekretom, ist sehr wichtig für Glc aber nicht Xyl freizugeben. Einige Enzyme sind für die Freilassung der beiden Glc und Xyl wichtig, wohingegen andere nur für den einen oder anderen (Banerjee et al., 2010c) sind notwendig.

Ein synthetisches Gemisch mit 16 Komponenten, die jeweils in einer Konzentration von 0,94 mg / ml (dh eine nicht-optimierte Mischung), veröffentlicht 38% der verfügbaren Glc von AFEX-vorbehandelte DDG. Unter identischen Bedingungen Hydrolyse, eine optimierte Mischung, in denen die Konzentrationen der 16 Komponenten im Bereich von 0% bis 32%, veröffentlicht 52% der Glc (Abb. 2). Dieses Experiment zeigt den Nutzen der Konstruktion definierte Mischungen.

_content "> (2) Schaffung von optimierten Cocktails für unterschiedliche Vorbehandlung / Substrat-Kombinationen. Current kommerziellen Cellulase Präparate sind" one-size-fits-all ". In Wirklichkeit hängt die besten Cocktail-sowohl auf dem Substrat und der Vorbehandlung. Ein einzelnes Produkt wie Accellerase 1000 gibt unterschiedliche Erträge aus verschiedenen Substraten auf die gleiche Weise vorbehandelt, und aus dem gleichen Substrat ausgesetzt unterschiedlichen Vorbehandlungen (Abb. 1). Wir haben GENPLAT verwendet werden, um Mischungen von reinen Enzymen für mehrere Vorbehandlungen und Vielfaches Rohstoffe (Banerjee et optimieren al., 2010c). Abbildung 2 zeigt, wie die optimale Enzym Proportionen von 16 reine Enzyme für AFEX-vorbehandelte Maisstroh, AHP-vorbehandelten Maisstroh und AFEX-vorbehandelte DDG unterscheidet. Nur 11 Enzyme sind in Abb. gezeigt. 2, da die optimale Anteile der übrigen fünf (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 und Cel12A) wurde festgestellt, dass 0% (Banerjee et al., 2010c).

(3) Novel Enzym entdeckt T. gemacht reesei und A. niger auf unterschiedlichen Substraten gewachsen. Ein besonderes Extrakt steigerte Glc Ausbeute bei unseren Kern hinzugefügt. Die verantwortliche Protein wurde gereinigt und gezeigt, dass ein Roman Glykosylhydrolase nicht in jeder kommerziellen Enzympräparat (Banerjee und Walton, unveröffentlichte Ergebnisse) werden.

(4) Entdeckung der besseren Enzyme. Nachdem mit GENPLAT die Enzyme sind die wichtigsten für den Abbau eines gezeigtinsbesondere Biomasse, haben wir ein besseres Verständnis für die Enzyme der Schwerpunkt für die Verbesserung sein sollte. Bessere Beispiele der kritischen Enzyme könnten durch die Suche in der Natur gefunden werden oder gemacht durch Protein-Engineering. (Ein Enzym könnte "besser" als ihre T. reesei homolog in mehrfacher Hinsicht abhängig von der gewünschten Eigenschaft, sank z. B. höhere spezifische Aktivität, größere Synergie, proteolytische Empfindlichkeit oder eine höhere thermische Stabilität). GENPLAT bietet eine sinnvolle Plattform für die Bestimmung von potentiell bessere Enzyme, weil es eine realistische komplexe Cocktail (wichtig, weil keine Biomasse Enzym arbeitet in Isolation) und eine realistische Substrat (wichtig nutzt, da die Ergebnisse mit reiner Cellulose oder anderen künstlichen Substraten möglicherweise nicht relevant für natürliche Lignozellulose Materialien).

(5) Gewerbliche Enzym-Optimierung. Ausreichend große Mengen reiner Enzyme noch nicht in der realen Welt existieren. Bis sie es tun, Ethanol proProduzenten müssen auf kommerzielle Produkte wie Accellerase 1000 und MultifectXylanase verlassen. Allerdings Mischungen von handelsüblichen Enzymen in der Regel besser als jeder einzelne ein, und GENPLAT kann zur optimierten Cocktails von mehreren kommerziellen Enzyme Design. Abbildung 3 zeigt die Verwendung von GENPLAT um eine Mischung von vier kommerziellen Enzympräparate optimieren. Die optimale Proportionen für die Freigabe von Glc von AFEX-vorbehandelte DDG wurde festgestellt, dass 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pektinase, 22% Novozyme 188 und 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al., 2010c) werden. 3B zeigt die Unterschiede in Glc Ausbeute von AFEX-DDG mit vier Enzympräparate, die optimierte kommerzielle Mischung führt zu einer höheren Rendite als Glc Accellerase1000 allein SpezymeCP allein, oder ein 16-Komponente synthetischen Mischung. Dieses Experiment zeigt auch, dass die 16-Komponente synthetischen Mischung fehlt ein oder mehrere Enzyme für eine optimale Glc Release, das in einem oder mehreren der kommerziellen Enzyme benötigt werden. GENPLAT können unsed zu identifizieren solcher Komponenten.

Abbildung 1. Keine einzige kommerzielle Enzympräparation ist optimal für alle Untergründe und alle Vorbehandlungen. Fünf Substrate und drei Vorbehandlungen wurden unter ähnlichen Bedingungen von Schleifen (0,5 mm Korngröße) verglichen, Enzymbeladung (15 mg / g Glucan) und Hydrolysebedingungen (48 h, 50 ° C). A. Verdauung verschiedener AFEX-vorbehandelte Substrate mit Accellerase 1000. B. Verdauung von Maisstroh vorbehandelt durch drei verschiedene Methoden mit Accellerase 1000 (siehe Banerjee et al., 2010c).

Abbildung 2. Optimale Proportionen von 11 Enzymen für die Freisetzung von Glc von AFEX-vorbehandelte Maisstroh (AFEX-CS), alkalische Wasserstoffperoxid-vorbehandelte Maisstroh (AHP-CS) oder AFEX-vorbehandelte getrocknete destillierenERS "Körner (AFEX-DDG). Die Daten stammen aus Banerjee et al. (2010c). Die Zahlen entlang der Oberseite der Balken sind die Glc Erträge als prozentualer Anteil der gesamten Glc in der Biomasse Probe.

Abbildung 3. A. Die Verwendung von GENPLAT eine optimierte Mischung von vier kommerziellen Enzympräparate für die Freigabe von Glc von AFEX-vorbehandelte DDG zu produzieren. Multifect Xylanase aus den kleinsten Beitrag (4%) und wurde daher von dieser ternären Diagramm weggelassen. B. Glc Erträge aus AFEX-DDG mit verschiedenen Enzym-Behandlungen unter identischen Bedingungen Hydrolyse (15 mg / g Glucan Enzym, 48 h, 50 ° C) . "Vier-Komponenten-commercial" hat die Proportionen aus dem Experiment in Abb. bestimmt. 3A.

Diskussion

Es ist allgemein anerkannt, dass die Senkung der Kosten von Enzymen ist wichtig, die Entwicklung eines wirtschaftlichen Lignocellulose Ethanol-Industrie. Die derzeit verfügbaren kommerziellen Enzym-Cocktails sind komplex und schlecht definierte Mischungen aus vielen Proteinen (Nagendran et al., 2009), und sie sind vorwiegend für den Einsatz auf den Säure-vorbehandelten Maisstroh angepasst. Um die Entwicklung besserer Enzym-Cocktails zu beschleunigen, haben mehrere Labors mit hohem Durchsatz-Plattformen für die Enzym-Entdeckung und Charakterisierung entwickelt. .; Decker et Roboter Abgabe von Enzymen und Biomasse Schlämmen, statistische Design of Experiments, und / oder automatisierten Bestimmung von Glc und Xyl (Berlin et al, 2007: Die Anstrengungen in diesem Bereich eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften auch in GENPLAT gefunden eingebaut al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT erweitert diese früheren Bemühungen, die meisten deutlich in der Komplexität der Enzym-Mischungen, die aus maximal 6-Komponenten analysiert werden kann inden früheren Studien an mehr als 16 in unserem neuesten Werk (Banerjee et al., 2010c). Weitere wichtige Merkmale der GENPLAT sind die Verwendung von einem Wulst Mischkammer (Paddel-Reservoir), dass stover Schlämme während der Abgabe der Schwebe zu halten kann; schonende Durchmischung während der Verdauung von end-over-end Rotation und automatisierte kolorimetrischen Bestimmung von Glu und Xyl.

Materialien

Ausrüstungen und Software zum Einsatz:

1. Design-Expert-Software, Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) ( http://www.statease.com )
2. Biomek FXP Laborautomation Workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP-Software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle-Reservoir (Modell VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Platten, 96-tiefe (1,5-ml) gut (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Durchstechbare CapMats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotierende Hybridisierung Inkubator (Modell 5420, VWR)
8. Swinging-Becherzentrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
9. Platten, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Platten, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Verwendete Reagenzien:

1. Pichia pastoris und Vektoren: strain X33 und pPICZ und pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei und Vektoren: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL) und pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b).
3. Accellerase 1000 (Lot-Nummer 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 4,8,
5. Tetracycline Lager: 10 mg / ml
6. Cycloheximid Lager: 10 mg / ml
7. GOPOD Assay-Kit, Katalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Irland)
8. Xylose-Assay-Kit, Katalog K-Xylose (Megazyme, Bray, Irland)