Chronische Verengung des Ischiasnerv und Schmerzen Überempfindlichkeit Testing in Ratten

Summary

Aufgrund der Einfachheit des chirurgischen Eingriffs und der robusten Verhaltensauffälligkeiten, ist eine chronische Verengung der Ischiasnerv eines der herausragenden Tiermodellen des neuropathischen Schmerzes. Innerhalb von 24 Stunden nach der Operation wird Schmerzen Überempfindlichkeit gegründet und kann quantitativ gemessen werden mit Hilfe eines von Frey Aesthesiometer (mechanische Prüfung) und plantar Analgesie Meter (Thermal-Test).

Abstract

Chronischen neuropathischen Schmerzen, die sich aus Schäden des zentralen oder peripheren Nervensystems, ist eine weit verbreitete und schwächenden Krankheit, die 18.7% der Bevölkerung ^1,2. Die Symptome umfassen spontane (Kribbeln, Brennen, Elektroschock-wie-) Schmerzen, Gefühlsstörungen, Parästhesien, Allodynie (Schmerzen infolge von normalerweise nicht-schmerzhafte Reize) und Hyperalgesie (erhöhte Reaktion auf schmerzhafte Reize). Die sensorischen Symptome sind komorbiden Verhaltensstörungen mit Behinderungen, wie Schlaflosigkeit und Depressionen. Um chronischen neuropathischen Schmerzen untersuchen mehreren Tiermodellen imitiert peripheren Nervenverletzungen entwickelt worden sind, ist eine der am weitesten verbreitete Bennett und Xie (1988) einseitige Ischiasnerv chronischen Verengung Verletzungen (CCI) ³ (Abbildung 1). Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Durchführung und Prüfung CCI Schmerzen Überempfindlichkeit.

CCI wird unter Narkose durchgeführt, mit dem Ischiasnerv auf der einen Seite, indem sie als ausgesetztkin Einschnitt, und Durchtrennen des Bindegewebes zwischen den gluteus superficialis und M. biceps femoris. Vier Chromsäure Darm Ligaturen sind locker um den Ischiasnerv bei 1 mm Abständen gebunden, um nur verschließen, aber nicht verhaften epineurale Blutfluss. Die Wunde wird mit Nähten in der Muskel-und Heftklammern in der Haut geschlossen. Das Tier wird dann erlaubt, sich von der Operation für 24 Stunden erholen, bevor Schmerzen Überempfindlichkeit Test beginnt.

Für Verhaltenstests werden Ratten in das Gerät gestellt und Tests dürfen, um das Testverfahren zu gewöhnen. Das Gebiet getestet ist die Mitte der Fußsohle der Hinterpfote (Abbildung 2), die innerhalb der Ischiasnerv Verteilung fällt. Mechanische Rücknahmeschwelle wird durch mechanisch stimuliert beide verletzten und unverletzten Hinterpfoten mit Hilfe eines elektronischen dynamische plantare von Frey Aesthesiometer oder manuell von Frey Haaren ⁴ bewertet. Die mechanische Rücknahmeschwelle ist der maximale Druck ausgeübt(In Gramm) löst das Zurückziehen der Pfote. Für die Messung der thermischen Wegziehlatenz, zuerst von Hargreaves et al (1988) beschrieben, wird die Hinterpfote zu einem Strahl von Strahlungswärme durch eine transparente Glasoberfläche unter Verwendung einer plantaren Analgesie m ^5,6 ausgesetzt. Der Rückzug auf die Latenz Hitzereiz wird als die Zeit für Zurückziehen der Pfote in beiden verletzten und unverletzten Hinterpfoten aufgezeichnet. Nach CCI, mechanische Rücknahmeschwelle, sowie thermische Wegziehlatenz im verletzten Pfote sind beide deutlich reduziert, im Vergleich zum Baseline-Messungen und der unverletzten Pfote (Abbildung 3). Die CCI-Modell von peripheren Nervenverletzungen mit Schmerzen Überempfindlichkeit Tests kombiniert wird, liefert ein Modellsystem, um die Wirksamkeit potenzieller Therapeutika untersuchen zu chronischen neuropathischen Schmerzen zu modifizieren. In unserem Labor setzen wir neben CCI thermische und mechanische Empfindlichkeit der Hinterpfoten, die Rolle der neuro-immunologische Interaktionen in der Pathogenese zu untersuchenund Behandlung von neuropathischen Schmerzen.

Protocol

1. Ischiasnerv chronische Verengung

Aseptische Techniken sollten für den chirurgischen Eingriff verwendet werden. Desinfizieren Sie die chirurgische Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und bereiten im Voraus sterilen Instrumenten (z. B. feine Scheren, Pinzetten und Haken), Gaze, Klammern und Abstrichen durch Autoklavieren. Bei mehreren Operationen, zu reinigen und erneut sterilisieren Instrumente mit 70% Ethanol oder einem trockenen Kügelchen Sterilisator zwischen Ratten. Eine chirurgische Maske, Haar Motorhaube und sterile Handschuhe getragen werden sollten.

Für Einengung des Nervs, bereiten Sie die Chromsäure Darmnaht indem es in kleine Stücke von etwa 3 cm Länge in steriler Kochsalzlösung eingetaucht, um Austrocknen zu verhindern. Zum Verschließen der Wunde, verwenden Sie handelsübliche sterile Seidenfäden.

1. Betäuben die Ratte in einem Induktionsofen Kammer mit 5% Isofluran in O _2, dann liefern 2% Isofluran in O ₂ über eine maßgeschneiderte Gesichtsmaske, und überwachen die anästhesierten Tier während des Verfahrens. Gemeinsame alternative Anästhetika werden inhaliert Halothan oder intraperitoneale Natrium-Pentobarbital. Ketamin, als N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor-Antagonisten, zu vermeiden, da diese Rezeptoren bei der Entwicklung von neuropathischem Schmerz sind wichtig ist.
2. Rasieren Sie das linke Hinterbein der Ratte. Dann legen Sie das Tier auf einem thermo-regulierten Heizmatte bei 37 ° C und gelten Schmier-Augensalbe auf die Augen.
3. Sterilisieren Sie den rasierten Bereich mit drei alternativen Anwendungen von 70% Isopropylalkohol und Jod-Lösung.
4. Mit der Ratte, die auf seiner Brust / Thorax-, erheben linken Hinterbein und in Position halten mit dem femor bei 90 ° an der Wirbelsäule mit Kreppband auf dem Fuß.
5. Einen Einschnitt in der Haut parallel, aber 3-4 mm unterhalb des femor und kostenlos die Haut vor der Muskel um die Inzision durch Durchtrennen des Bindegewebes.
6. Mit einem stumpfen Schere, durch das Bindegewebe zwischen den gluteus superficialis und der Bizeps geschnittenfemoris.
7. Benutzen Sie einen Haken, um die Lücke zwischen den beiden Muskeln erweitern, so dass klare Visualisierung des Ischias-Nervs.
8. Mit gebogenen stumpfen Pinzette und Mikro-Schere, sanft frei ca. 10 mm des Ischias-Nervs (proximal des Ischias-Trifurkation) aus dem umgebenden Bindegewebe.
9. Unter dem Mikroskop und eine gute Lichtquelle, binden vier Ligaturen (Chromsäure Gut 4.0, Ethicon, USA) mit einem doppelten Knoten, 1 mm voneinander entfernt, proximal der Trifurkation des Ischias-Nervs. Für jede Blattschraube, mit einem einzelnen losen Schleife starten, dann greifen die beiden Enden nahe an der Schlaufe und ziehen, bis die Schleife wird gerade noch gemütlich und die Ligatur nicht entlang der Nerven gleiten. Um die Schleife in der richtigen Position zu halten, legen Sie eine zweite Schleife auf der Oberseite des ersten, den Knoten zu vervollständigen. Schließlich schnitt die losen Enden der Ligatur auf rund 1mm. Einengung des Nervs sollte minimal sein, und sofort gestoppt, wenn ein kurzes Zucken beobachtet wird, um zu verhindern, Verhaftung von the epineurale Blutfluss. Über dem Anziehen der Ligaturen führt zu Axotomie und Autotomie (Selbstverstümmelung), beide unerwünschte Nebenwirkungen, die bei erfolgreicher Erprobung Schmerzen Überempfindlichkeit auszuschließen.
10. Verwendung Nähte (Mersilk 5.0, Ethicon), um die Muskelschicht und Klammern (Autoclip, 9 mm) zu schließen, um die Haut zu befestigen. Weiter verwenden Jodlösung (Riodine), um die Wunde zu sterilisieren.
11. Beachten Sie die Ratte eng während der Narkose Erholungsphase, und lassen Sie ihn in einem separaten Käfig mit flachem Papier Betten (nicht der Standard der Tierhaltung Betten) zu erholen, um die unbewussten Tier Ersticken zu verhindern.
    Vor Angabe von postoperativen Analgesie Ermittler sollte die Tatsache berücksichtigen, kann dies mit Schmerzen Überempfindlichkeit Tests stören. In der Tat gibt es Hinweise, dass die lokale Anwendung von Anästhetika, Lidocain, zum Zeitpunkt der Schädigung kann die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen zu verändern, und verringern den Grad der Hyperalgesie in den letzten Wochen ^7. Für weitere Diskussion zu diesem matter siehe Beitrag von Bennett et al ^8.

2. Measurements of Pain Verhaltensweisen

1. Täglichen Umgang mit Ratten für mehrere Tage vor dem Start des Experiments wird empfohlen, um die Ratten zu ihren Handler zu gewöhnen, Stress reduzieren und das Risiko zu beißen.
2. Vor der Verhaltenstests, müssen Ratten auf das Testverfahren und die Tiergehege gewöhnt werden. Die Testumgebung muss ruhig gehalten werden und gut kontrolliert, mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit, und führte zu einem ähnlichen Tageszeit jedes Test-Session.
3. Schmerz Überempfindlichkeit Test sollte mehrmals vor CCI (Baseline) und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der IHK durchgeführt werden, wie gewünscht.

3. Mechanische Rücknahmeschwelle

1. Am Tag der Prüfung, statt Ratten in den gehobenen Mesh geschossiges Tests Käfig 15-30 Minuten vor der Messung Rücknahmeschwellen, so dass Exploration und Käfig GrooMing-Aktivitäten einzustellen und Ratten zu werden entspannt und stationär.
2. Mit Hilfe eines dynamischen plantaren von Frey Aesthesiometer (Ugo Basile, Italien), positionieren Sie den Touch-Stimulator-Einheit mit dem Filament direkt unterhalb der Mitte der Fußsohle der Hinterpfote, die Vermeidung der Metallgitter, und drücken Sie die Starttaste. Dies hebt das Filament mechanisch stimuliert die Fußsohle der Hinterpfote mit zunehmender Kraft.

Handbuch von Frey Haare sind eine Reihe von zunehmenden Durchmesser Fäden, die so kalibriert, dass eine bestimmte Kraft zu induzieren, wenn auf die Haut aufgetragen werden. Sie können als Alternative zu einer elektronischen dynamischen plantaren von Frey Aesthesiometer zur Messung der Zurückziehen der Pfote Schwellenwert, wie zuvor ⁴ verwendet werden. Es gibt auch mehrere alternative Hersteller von elektronischen von Frey aesthesiometers (zB IITC, USA und Somedic, Schweden).

3. Notieren Sie sich die mechanischen Rücknahmeschwelle von beiden verletzten und unverletzten hindpaws, in einem ausbalancierten Ordnung. Dieses Gerät wirkt auf die Pfote und bei Entzug Reaktion das System automatisch und zeigt die maximale Kraft (in Gramm). Wenn eine zweideutige Antwort auftritt (dh im Falle der Gehfähigkeit oder Grooming), wiederholen Sie den Reiz und notieren Sie die Schwelle wieder. Lecken oder Schütteln der Hinterpfote nach Stimulation ist ein Zeichen von Verhalten mit Schmerzen verbunden.
4. Wiederholen Sie die mechanische Stimulation 3 mal im Abstand von ca. 5 min zwischen Reizen, notieren Sie die Schwellenwerte, und dann berechnet den Mittelwert der Pfote Rücknahmeschwellen.

4. Thermische Wegziehlatenz

Die Infrarot (IR) Wärme Intensität der Plantar-Prüfgerät sollte vor dem Start des Experiments angepasst werden. In unserem Labor stellen wir die IR-Intensität, um eine durchschnittliche Pfotenrückzugslatenz von etwa 10 Sekunden bei unbehandelten Ratten zu geben, und wir stellen Sie die Cut-off-Latenz bei 20 Sekunden, um Gewebe zu vermeiden DammAlter im Falle des Scheiterns, eine Pfote zu entfernen.

1. Am Tag der Prüfung, um Platz Ratten in das Glas geschossiges Tests Käfig 15-30 Minuten vor der Messung Latenz, wodurch Käfig Explorations-und Grooming-Aktivitäten einzustellen und Ratten werden entspannt und stationär.
2. Mit Hilfe eines thermischen plantare Analgesie Instrument (Ugo Basile, Italien), positionieren Sie den Infrarot-Quelle direkt unter der Mitte der Fußsohle der Hinterpfote, und drücken Sie die Starttaste. Dadurch ist die Fußsohle der Hinterpfote mit einem Strahl Strahlungswärme durch eine transparente Glasoberfläche. Es gibt auch alternative Hersteller von thermischen plantare Analgesie Instrumente (zB IITC, USA und Stölting, USA).
3. Notieren Sie sich den Rückzug Latenz von beiden verletzten und unverletzten Hinterpfoten, in einem ausbalancierten Ordnung. Dieses Gerät zeichnet automatisch die Zeit genommen (in Sekunden) vom Beginn der thermischen Reiz auf die Rücknahme der Pfote von der Wärmequelle. Wenn eine zweideutige Antwort auftritt (dh im Falle der ambulantention oder Pflege), wiederholen Sie den Reiz und die Latenz wieder aufnehmen. Lecken oder Schütteln der Hinterpfote nach Stimulation ist ein Zeichen von Verhalten mit Schmerzen verbunden.
4. Wiederholen Sie die Hitze Stimulation mindestens 3 mal im Abstand von ca. 5 min zwischen Reizen, notieren Sie die Latenzen, und dann berechnet den Mittelwert der Pfote Rückzug Latenzen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für mechanische und thermische Rücknahmeschwelle Wegziehlatenz in der ipsilateralen (verletzt) ​​und kontralateralen (unverletzten) Pfoten von Wistar-Ratten gezeigt wird, bevor (Baseline) und 2-12 Tage nach der CCI in 3A und 3B. Aus diesen Figuren ist ersichtlich, dass CCI eine signifikante Reduktion der beiden mechanischen und thermischen Rücknahmeschwellen Rücknahme Latenzen des ipsilateralen Hinterpfote bewirkt, was das Vorhandensein von mechanischen und thermischen Schmerzen Überempfindlichkeit, werden beide der chronischen neuropathischen Schmerzen .

1. Eine schematische Darstellung der Anordnung der Ligaturen in der CCI-Modell. Dieses Tiermodell von neuropathischen Schmerzen handelt Platzierung von vier lose Ligaturen Chromsäure-gut auf den Ischiasnerv, der Mitte des Oberschenkels Ebene. Es führt zu verletzen nur einen Teil der Afferenzen gehen an den Fuß und anschließende Schmerzen Überempfindlichkeit der Hinterpfote.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der Hinterpfote Bereich für Schmerzen Tests verwendet. Die Mitte der Fußsohle direkt hinter der Straßenräuber, wie von der rot gestrichelten Kreis angedeutet, wird für Schmerzen Tests verwendet. Dieser Bereich wird meist durch Endäste des N. ischiadicus innerviert. Die Ferse und Fußballen sollten aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeit der Haut vermieden werden.

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Abbildung 3. Schmerz Überempfindlichkeit nach chronischer Verengung der Ischiasnerv bei Ratten. Nach CCI, gibt es eine signifikante Reduktion der Pfote Rücknahmeschwelle auf mechanische Reize (A) und Pfotenrückzugslatenz auf thermische Reize (B) im verletzten (ipsilateral) Hinterpfote im Vergleich zur unverletzten (kontralateral) Hinterpfote (P <0,01 wiederholten Messungen 2 ANOVA). Die Daten zeigen Mittelwert ± SEM, n = 7 Wistar-Ratten.

Discussion

CCI ist ein weit verbreitetes peripheren Nervenverletzungen Modell der chronischen neuropathischen Schmerzen. Es ist relativ einfach durchzuführen, und produziert robuste und stabile Schmerzen Überempfindlichkeit für mindestens einen Monat nach der Verletzung. Nach CCI, Ratten zeigen abnorme Haltung des verletzten Hinterpfote (Zehen zusammen und hielt plantar-flektierten und Pfote umgestülpt), sowie mehrmaliges Schütteln, Bewachung und Lecken der verletzten Hinterpfote auf das Vorliegen von spontanen Schmerz ^9.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Ausrüstung	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Chromic Darm	Ethicon	G-211	4-0 Dicke
Isofluran	Delvet Pty Ltd, Seven Hills, NSW	n / a
Mersilk	Ethicon	W-580	5-0 Dicke
Autoclip	Becton Dickinson	427631	9 mm Edelstahl
Riodine	Orion	R1000802F	1% w / v Iod
Thermische plantare Analgesie Instrument	Ugo Basile	37370
Dynamische plantare Aesthesiometer	Ugo Basile	37400