Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Zusammenfassung

Wir veranschaulichen die Verwendung eines axialen optischen Pinzetten-Systems mit konstanter Kraft, um die mechanischen Eigenschaften kurzer DNA-Moleküle zu untersuchen. Durch axiales Dehnen der DNA minimieren wir sterische Behinderungen und Artefakte, die bei herkömmlicher lateraler Manipulation auftreten, und können so DNA-Moleküle von etwa 100 nm Länge untersuchen.

Zusammenfassung

Einzelmolekültechniken zum Dehnen von DNA mit Konturlängen unter einem Kilobasepaar sind mit experimentellen Schwierigkeiten behaftet. Viele interessante biologische Vorgänge wie die Bindung von Histonen und die proteinvermittelte Schleifenbildung von DNA^1,2 finden jedoch auf dieser Längenskala statt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die mechanischen Eigenschaften von DNA eine bedeutende Rolle bei grundlegenden zellulären Prozessen wie der Verpackung von DNA in kompakte Nukleosomen und Chromatinfasern spielen^3,4. Es ist daher offensichtlich wichtig, die mechanischen Eigenschaften kurzer DNA-Abschnitte zu verstehen. In dieser Arbeit stellen wir eine praktische Anleitung zu einer von uns entwickelten Einzelmolekül-Optischen-Zange-Technik bereit, mit der das mechanische Verhalten von DNA mit Konturlängen von nur wenigen hundert Basenpaaren untersucht werden kann.

Die Hauptbarriere beim Dehnen kurzer DNA-Abschnitte besteht darin, dass herkömmliche optische Pinzetten im Allgemeinen dafür ausgelegt sind, eine Kraft in einer Richtung lateral zur Probebühne aufzubringen^5,6, (siehe Abb. 1). Bei dieser Geometrie wird der Winkel zwischen der Kugel und der Deckglasoberfläche, an die die DNA gebunden ist, für DNA-Abschnitte im Submikrometerbereich sehr steil. Nun muss die axiale Position berücksichtigt werden, was eine Herausforderung darstellen kann, und da die Dehnung die Mikrokugel näher an das Deckglas zieht, verstärken sich sterische Effekte. Darüber hinaus erzeugen laterale Dehnungen aufgrund der Asymmetrie der Mikrokugeln unterschiedliche Drehmomentniveaus, die durch die Rotation der Mikrokugel innerhalb der optischen Falle entstehen, da sich die Richtung der Reaktionskraft während der Dehnung verändert.

Alternative Methoden zum Dehnen von Submikrometer-DNA stoßen auf ihre eigenen, einzigartigen Hindernisse. Beispielsweise ist eine Doppelstrahl-Optische Falle auf die Dehnung von DNA über eine Wellenlänge begrenzt, wobei Interferenzeffekte zwischen den beiden Fallen sowie Lichtstreuung zwischen den Mikrokügelchen zunehmend zu einem erheblichen Problem werden. Der Ersatz einer der Fallen durch eine Mikropipette würde vermutlich ähnliche Herausforderungen mit sich bringen. Obwohl man direkt das axiale Potential zur DNA-Dehnung nutzen könnte, wäre ein aktives Rückkopplungssystem erforderlich, um eine konstante Kraft aufzubringen, dessen Bandbreite jedoch recht begrenzt wäre, insbesondere bei niedrigen Kräften.

Wir umgehen diese grundlegenden Probleme, indem wir die DNA mithilfe eines axialen optischen Pinzetten-Systems mit konstanter Kraft direkt vom Deckglas wegzogen^7,8. Dies wird erreicht, indem die Kugel in einem linearen Bereich des optischen Potentials eingefangen wird, in dem die optische Kraft konstant ist – ihre Stärke kann durch Anpassung der Laserleistung eingestellt werden. Das Einfangen im linearen Bereich fungiert zudem als rein optische Kraftklemme für die DNA, die sich axial über nahezu 350 nm erstreckt. Gleichzeitig kompensieren wir thermische und mechanische Drift, indem wir die Position des Stages feinjustieren, sodass ein Referenzmikrosphäre, die am Deckglas haftet, stets an derselben Position und im gleichen Fokus verbleibt, was eine nahezu unbegrenzte Beobachtungsdauer ermöglicht.

Protokoll

1. Pinzetteneinstellung

1. Der Strahl eines 1064-nm-Lasers wird in zwei orthogonal polarisierte Strahlen aufgeteilt. Einer wird zur Manipulation des Biomoleküls verwendet, während der andere zu Kalibrierungszwecken dient (siehe Abb. 2).
2. Die Intensität des Manipulationsstrahls wird durch einen akusto-optischen Deflektor (AOD) gesteuert, während Position und Fokus jedes Strahls unabhängig durch Strahlsteuerspiegel bzw. optische Teleskope geregelt werden.
3. Die Strahlen werden anschließend mit einem weiteren polarisierenden Strahlteiler wieder zusammengeführt und durch einen letzten Satz teleskopischer Optiken weiter konditioniert, um die hinte....

Diskussion

Konventionelle optische Fallen stützen sich entweder auf analoge oder computerbasierte Rückkopplungssysteme, um eine konstante Kraft auf ein lichtbrechendes Objekt auszuüben. Diese aktiven Rückkopplungssysteme stoßen bei Bedingungen an ihre Grenzen, unter denen plötzliche Änderungen der Ausdehnung der Probe auftreten, beispielsweise durch die Bindung eines Proteins an DNA oder das schnelle Schrittverhalten eines molekularen Motors entlang eines Filaments. In jüngster Zeit wurden verschiedene passive Methoden zur Anwendun.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz/Ausrüstung	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nd:YVO4-Laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Akusto-optischer Deflektor	IntraAction	DTD-274HA6
Mikroskopobjektiv	Olympus	PlanApo	60X, NA 1,4
Piezo-Stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ-Stage
CCD-Kamera	PixeLink	PL-A741
Photodetektor	Elektro-Optik Tech	ET-3020
Polystyrol-Perlen	Spherotech	SVP-08-10	800 nm, mit Streptavidin beschichtet
Anti-Digoxigenin	Roche	11333089001	Von Schafen
Primer	MWG Operon	Individuelle Oligonukleotide	Ein Primer: Biotin, anderer: Digoxigenin
PCR-Reagenzien	New England Biolabs	Taq-Polymerase, dNTPs
Deckglas	Fisher Scientific
Weitere Chemikalien für Puffer	Fisher Scientific
Zusatzmaterialien
A. Hydrodynamische Reibung C–effizient
Zur Bestimmung der hydrodynamischen Reibung c–Koeffizienten der Mikrokugel in der Nähe einer Oberfläche kann man die folgende Entwicklung verwenden5,10:
wobei die folgende Kurzschreibweise eingeführt wurde:
Die Reibung c–Effizienz wird in Bezug auf die Viskosität der Flüssigkeit definiert. η und dem Radius der Mikrokugel, wobei sich das Zentrum der Mikrokugel in einem Abstand befindet η oberhalb der Oberfläche. Die Summation konvergiert hinreichend gut, wenn sie auf etwa zehn Terme erweitert wird.
B. Einfluss der axialen Position auf die Steifigkeitskalibrierung
Die Kalibrierung der Fallensteifigkeit erfordert einen Kompromiss zwischen der Genauigkeit der Kalibrierung, die mit zunehmendem Abstand von der Oberfläche steigt, und der tatsächlichen axialen Position, an der die Falle experimentell eingesetzt wird. Im Allgemeinen erfolgt die Kalibrierung in einem Abstand von etwa 800–1000 nm von der Oberfläche, was höher liegt als die tatsächliche experimentelle Bedingung.
C. Modell der modifizierten wurmähnlichen Kette (WLC)
Die Kraft-Dehnungs-Kurven können an ein modifiziertes WLC-Modell angepasst werden, das Volumenausschluss-Effekte bei null optischer Kraft wie folgt berücksichtigt:
wo Fopt ist die optische Kraft, xo ist ein Anpassungsparameter für die Ausdehnung bei Nullkraft,xopt ist die Ausdehnung unter Kraft, l ist die Konturlänge der DNA, und l*p ist ein zweiter Anpassungsparameter für ein "wirksam" Persistenzlänge Fwlc wird durch das übliche WLC-Modell beschrieben11 wo ε ist die relative DNA-Streckung.