Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Zusammenfassung

Wir veranschaulichen die Verwendung eines axialen optischen Pinzetten-Systems mit konstanter Kraft, um die mechanischen Eigenschaften kurzer DNA-Moleküle zu untersuchen. Durch axiales Dehnen der DNA minimieren wir sterische Behinderungen und Artefakte, die bei herkömmlicher lateraler Manipulation auftreten, und können so DNA-Moleküle von etwa 100 nm Länge untersuchen.

Zusammenfassung

Einzelmolekültechniken zum Dehnen von DNA mit Konturlängen unter einem Kilobasepaar sind mit experimentellen Schwierigkeiten behaftet. Viele interessante biologische Vorgänge wie die Bindung von Histonen und die proteinvermittelte Schleifenbildung von DNA^1,2 finden jedoch auf dieser Längenskala statt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die mechanischen Eigenschaften von DNA eine bedeutende Rolle bei grundlegenden zellulären Prozessen wie der Verpackung von DNA in kompakte Nukleosomen und Chromatinfasern spielen^3,4. Es ist daher offensichtlich wichtig, die mechanischen Eigenschaften kurzer DNA-Abschnitte zu verstehen. In dieser Arbeit stellen wir eine praktische Anleitung zu einer von uns entwickelten Einzelmolekül-Optischen-Zange-Technik bereit, mit der das mechanische Verhalten von DNA mit Konturlängen von nur wenigen hundert Basenpaaren untersucht werden kann.

Die Hauptbarriere beim Dehnen kurzer DNA-Abschnitte besteht darin, dass herkömmliche optische Pinzetten im Allgemeinen dafür ausgelegt sind, eine Kraft in einer Richtung lateral zur Probebühne aufzubringen^5,6, (siehe Abb. 1). Bei dieser Geometrie wird der Winkel zwischen der Kugel und der Deckglasoberfläche, an die die DNA gebunden ist, für DNA-Abschnitte im Submikrometerbereich sehr steil. Nun muss die axiale Position berücksichtigt werden, was eine Herausforderung darstellen kann, und da die Dehnung die Mikrokugel näher an das Deckglas zieht, verstärken sich sterische Effekte. Darüber hinaus erzeugen laterale Dehnungen aufgrund der Asymmetrie der Mikrokugeln unterschiedliche Drehmomentniveaus, die durch die Rotation der Mikrokugel innerhalb der optischen Falle entstehen, da sich die Richtung der Reaktionskraft während der Dehnung verändert.

Alternative Methoden zum Dehnen von Submikrometer-DNA stoßen auf ihre eigenen, einzigartigen Hindernisse. Beispielsweise ist eine Doppelstrahl-Optische Falle auf die Dehnung von DNA über eine Wellenlänge begrenzt, wobei Interferenzeffekte zwischen den beiden Fallen sowie Lichtstreuung zwischen den Mikrokügelchen zunehmend zu einem erheblichen Problem werden. Der Ersatz einer der Fallen durch eine Mikropipette würde vermutlich ähnliche Herausforderungen mit sich bringen. Obwohl man direkt das axiale Potential zur DNA-Dehnung nutzen könnte, wäre ein aktives Rückkopplungssystem erforderlich, um eine konstante Kraft aufzubringen, dessen Bandbreite jedoch recht begrenzt wäre, insbesondere bei niedrigen Kräften.

Wir umgehen diese grundlegenden Probleme, indem wir die DNA mithilfe eines axialen optischen Pinzetten-Systems mit konstanter Kraft direkt vom Deckglas wegzogen^7,8. Dies wird erreicht, indem die Kugel in einem linearen Bereich des optischen Potentials eingefangen wird, in dem die optische Kraft konstant ist – ihre Stärke kann durch Anpassung der Laserleistung eingestellt werden. Das Einfangen im linearen Bereich fungiert zudem als rein optische Kraftklemme für die DNA, die sich axial über nahezu 350 nm erstreckt. Gleichzeitig kompensieren wir thermische und mechanische Drift, indem wir die Position des Stages feinjustieren, sodass ein Referenzmikrosphäre, die am Deckglas haftet, stets an derselben Position und im gleichen Fokus verbleibt, was eine nahezu unbegrenzte Beobachtungsdauer ermöglicht.

Protokoll

1. Pinzetteneinstellung

1. Der Strahl eines 1064-nm-Lasers wird in zwei orthogonal polarisierte Strahlen aufgeteilt. Einer wird zur Manipulation des Biomoleküls verwendet, während der andere zu Kalibrierungszwecken dient (siehe Abb. 2).
2. Die Intensität des Manipulationsstrahls wird durch einen akusto-optischen Deflektor (AOD) gesteuert, während Position und Fokus jedes Strahls unabhängig durch Strahlsteuerspiegel bzw. optische Teleskope geregelt werden.
3. Die Strahlen werden anschließend mit einem weiteren polarisierenden Strahlteiler wieder zusammengeführt und durch einen letzten Satz teleskopischer Optiken weiter konditioniert, um die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs leicht zu überschreiten. Eine 50-%-Überfüllung des Kalibrierungsstrahls führt zu einer engen optischen Falle, während ein etwas kleinerer Faktor für den Manipulationsstrahl, etwa 20 %, einen flacheren Fokus ergibt, der sich in einen größeren nutzbaren Bereich des linearen Potentials umsetzt. Die Strahlen werden durch ein PlanApo 60x/1.4 Öl-Immersions-Objektiv stark fokussiert und auf die Probenzelle gelenkt.
4. Dieser optische Pinzettensetup wird mit einem selbstgebauten Hellfeldmikroskop kombiniert, das Beleuchtung von einer Halogenlampe bereitstellt, die durch einen Kondensor auf die Probenkammer fokussiert wird. Das Hellfeldbild wird durch einen dichroitischen Spiegel vom Laserlicht getrennt und anschließend auf zwei CCD-Kameras abgebildet. Eine CCD-Kamera dient als primäre Datenaufnahmeeinheit und wird softwaregesteuert ausgelöst, um präzise Abtastraten zu erzielen, während die zweite CCD-Kamera ein einzelnes festhaftendes Referenzmikrosphärchen abbildet, dessen Position als Rückkopplungsregelung dient, um Driftbewegungen des Mikroskops auszugleichen.
5. Die Probe wird grob relativ zum Objektiv mittels eines XY-Stages positioniert und anschließend präzise durch eine integrierte dreidimensionale Piezo-Bühne justiert.
6. Das vorwärts gestreute und transmittierte Laserlicht wird vom Hellfeldkondensor gesammelt und auf einen Photodetektor fokussiert. Das resultierende Signal wird über einen Anti-Aliasing-Filter bei 100 kHz gefiltert, verstärkt und mit 200 kHz mittels einer DAQ-Karte aufgezeichnet.

2. Kalibrierung der scheinbaren Größe der Kugel gegenüber der axialen Position

1. Füllen Sie eine Probenkammer⁹ mit einer dispergierten Lösung von Polystyrol-Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 800 nm, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt sind. Lassen Sie die Lösung 10–15 Minuten ruhen und spülen Sie anschließend vorsichtig mit Puffer, um überschüssige Mikrokugeln zu entfernen.
2. Suchen Sie eine zufällig an der Deckglasoberfläche haftende Mikrokugel und justieren Sie die Höhe der Probenkammer, bis sich die Mikrokugel etwa 1 μm unterhalb der Fokusebene befindet, um ein defokussiertes Bild zu erzeugen.
3. Um die scheinbare Größe des Bildes zu messen, bestimmen Sie zunächst das Zentrum der Mikrokugel mithilfe der geometrischen Mustererkennungsfunktion in LabView.
4. Erzeugen Sie anschließend ein radiales Intensitätsprofil der Mikrokugel, indem Sie über 360° um das Zentrum jeder Querschnittsebene mitteln. Das radiale Profil, das einem weißen Ring in jedem der Hellfeldbilder entspricht, kann mit einer quadratischen Funktion angepasst werden, um einen Helligkeitsmaximum zu ermitteln. Der Abstand zwischen diesem Maximum und dem Zentrum kann als Maß für die scheinbare Größe der Kugel verwendet werden.
5. Verwenden Sie den kalibrierten Piezotisch, um die axiale Position der Mikrokugel schrittweise zu erhöhen, und nehmen Sie mit der CCD-Kamera bei jeder axialen Position ein Bild auf.
6. Wiederholen Sie die Bildanalyse für jedes aufeinanderfolgende Bild, um die scheinbare Größe der Mikrokugel mit ihrer axialen Position zu korrelieren (siehe Abb. 3). Die mit dieser Methode erzielte axiale Auflösung beträgt etwa 1,4 nm⁷.

3. Kartierung des optischen Potentials des Manipulationsstrahls

1. Beginnen Sie mit der kollinearen Ausrichtung des Manipulationsstrahls und des Kalibrierstrahls. Der Kalibrierstrahl sollte am hinteren Objektivbrennpunkt etwa 50 mW betragen, während der Manipulationsstrahl deutlich schwächer sein sollte, beispielsweise 10 mW.
2. Schalten Sie den Manipulationsstrahl aus und fangen Sie eine freie Mikrokugel im wesentlich steiferen Fangstrahl des Kalibrierstrahls ein.
3. Schalten Sie nun den Manipulationsstrahl ein. Da der Manipulationsstrahl viel schwächer ist als der Kalibrierstrahl, wird die axiale Position der Mikrokugel leicht gestört. Die resultierende Änderung der axialen Position kann anhand der bereits beschriebenen defokussierten Hellfeldbilder gemessen werden.
4. Schalten Sie den Manipulationsstrahl aus und verschieben Sie bei weiterhin im Kalibrierstrahl gefangener Mikrokugel die axiale Fokusebene des Kalibrierstrahls durch Justierung der teleskopischen Linse. Schalten Sie den Manipulationsstrahl wieder ein, messen Sie die daraus resultierende Verschiebung der Mikrokugel und wiederholen Sie diesen Vorgang.
5. Die Verschiebungen ΔX können gegen die axiale Position des Fokus des Kalibrierstrahls aufgetragen werden. Die axiale Position, die der größten Verschiebung der Mikrokugel entspricht, bestimmt das Zentrum des linearen Bereichs der optischen Falle (siehe Abb. 4).
6. Der letzte Schritt zur Bestimmung der optischen Kraft des Manipulationsstrahls als Funktion der axialen Position erfordert eine sorgfältige Messung der Steifigkeit des Kalibrierstrahls. Stellen Sie hierzu die durch den Kalibrierstrahl gefangene Mikrokugel durch Justierung der teleskopischen Linse auf etwa einen Mikrometer über der Oberfläche ein, während der Manipulationsstrahl ausgeschaltet ist.
7. Zeichnen Sie die thermische axiale Bewegung der Mikrokugel auf, indem Sie die Intensität des transmittierten Lichts mit einem Photodetektor messen.
8. Die Autokorrelation des Signals kann durch eine einfache exponentielle Abklingfunktion angepasst werden, um die Zeitkonstante der Fluktuationen, τ_z, zu erhalten.
9. Der hydrodynamische Reibungskoeffizient ζ der Mikrokugel kann aufgrund der Nähe der Mikrokugel zu einer Oberfläche korrigiert werden^5,10. Die Steifigkeit der Kalibrierfalle ergibt sich dann zu κ_z = ζ / τ_z (siehe Zusatzmaterial A und B).
10. Wenn die Steifigkeit der Kalibrierfalle bekannt ist, können die zuvor gemessenen axialen Verschiebungen in eine Kraft umgerechnet werden: ƒ_z = κ_z ΔX. Die Integration dieser Kurve liefert eine räumliche Abbildung des axialen optischen Potentials des Manipulationsstrahls (siehe Abb. 4).

4. Strecken einer DNA-Probe

1. Befestigen Sie die Kammer⁹, die an der Oberfläche verankerte DNA-Moleküle (< 1 kbp) enthält, und stellen Sie, während Sie das Hellfeldbild beobachten, den Fokus des Manipulationsstrahls durch Justierung des Teleskops leicht oberhalb der ungedehnten Mikrokügelchen ein. Passen Sie dann die Position des Stages an, bis eines der Mikrokügelchen eingefangen ist.
2. Positionieren Sie das Mikrokügelchen grob in der Mitte der XY-Ebene der optischen Falle. Erzeugen Sie in LabView eine Serie von Rechteckwellen und senden Sie diese an die AOD, um den Laserstrahl wiederholt ein- und auszuschalten. Steuern Sie sorgfältig die Intensität des Lasers und die Dauer des eingeschalteten Zustands, um eine Erwärmung der Probenkammer zu vermeiden. Verwenden Sie typischerweise etwa 2 mW Laserleistung (gemessen an der Rückapertur des Objektivs) und senden Sie Impulse von 200 ms (an) und 500 ms (aus). Die Amplitude der an die AOD gesendeten Rechteckwelle sollte etwa 0,5 V betragen.
3. Beobachten Sie das Mikrokügelchen, während die Falle wiederholt ein- und ausgeschaltet wird, und prüfen Sie, ob der Laser eine bevorzugte Richtung der Bewegung des Mikrokügelchens induziert. Während Sie iterativ die Position des Mikrokügelchens in X- und Y-Richtung über das Piezostage justieren, sollte sich die zufällige Bewegung des Mikrokügelchens in der XY-Ebene isotrop verhalten, obwohl sie merklich eingeschränkt ist, wenn der Laser eingeschaltet ist.
4. Als Nächstes richten Sie die Kügelchen in Z-Richtung aus. Impulsieren Sie erneut den Laserstrahl ein- und aus, und messen Sie diesmal gleichzeitig die axiale Verschiebung der Mikrokügelchen in Echtzeit. Zentrieren Sie das Stage innerhalb des linearen Bereichs, also dem Punkt, an dem die Z-Verschiebung am größten ist.
5. Nach einer sorgfältigen Ausrichtung in Z-Richtung ist es unerlässlich, zu überprüfen, ob die Falle weiterhin in der Mitte der XY-Ebene zentriert ist. Falls sich die XY-Ausrichtung verändert hat, müssen sowohl die XY- als auch die Z-Ausrichtung wiederholt werden, bis das Mikrokügelchen entlang aller drei Achsen korrekt zentriert ist.
6. Um die DNA zu dehnen, erhöhen Sie die Laserintensität schrittweise, indem Sie ein Spannungssignal von 0 V bis 0,5 V in Schritten von 0,025 V an die AOD senden. Erfassen Sie in jedem Schritt 400 Bilder mit 100 fps und mitteln Sie diese, um die axiale Verschiebung zu erhalten.
7. Die Kraft-Dehnungs-Kurven können nun aufgetragen und an ein modifiziertes WLC-Modell¹¹ angepasst werden (siehe Zusatzmaterial B).

5. Repräsentative Ergebnisse:

Wir zeigen Kraft-Dehnungs-Kurven für zwei DNA-Sequenzen: eine 1298 bp und eine 247 bp lange Sequenz, wobei letztere die kürzeste Sequenz ist, die wir reproduzierbar dehnen konnten. Für kurze DNA-Abschnitte erklärt das herkömmliche Worm-Like-Chain-(WLC-)Modell die Kraft-Dehnungs-Beziehung nicht vollständig, da auf diesen Längenskalen endliche Größeneffekte und eine Dehnung bei Nullkraft infolge von Randbedingungen berücksichtigt werden müssen. Die Kraft-Dehnungs-Messungen müssen daher mit einem modifizierten WLC-Modell angepasst werden, das eine effektive Biegestarrheit und eine Dehnung bei Nullkraft als Anpassungsparameter enthält, wie in den ergänzenden Materialien näher beschrieben. Für große Konturlängen von dsDNA entspricht die effektive Biegestarrheit einfach der nominalen Biegestarrheit (˜50 nm), und die Dehnung bei Nullkraft kann vernachlässigt werden. Wenn jedoch die Konturlänge kürzer wird, nimmt die effektive Biegestarrheit deutlich unter 50 nm ab, und die DNA zeigt bereits bei Nullkraft eine signifikante Dehnung.

Die Daten und die entsprechenden Anpassungen der Kraft-Dehnungs-Kurven sind in Abbildung 5 für die beiden Sequenzen dargestellt. Aus den modifizierten WLC-Anpassungen ergaben sich effektive Biegestarrlängen von 35 nm für die 1298 bp DNA und 25 nm für die 247 bp DNA. Zu Veranschaulichungszwecken zeigen wir jeweils eine einzelne Messung der Kraft-Dehnungs-Kurven für jede Sequenz. In der Praxis würde man die Messungen mehrfach wiederholen und die mittleren Ergebnisse zusammen mit den Standardfehlern ermitteln. Es ist außerdem darauf hinzuweisen, dass nach jeder Kurve unbedingt sichergestellt werden muss, dass die Mikrokugel weiterhin eingefangen ist und sich korrekt innerhalb des linearen Bereichs befindet; andernfalls muss die Mikrokugel wie zuvor im Protokoll beschrieben neu ausgerichtet werden.

Abbildung 1 Prinzip der axialen optischen Pinzetten. (Links) Konventionelle optische Pinzetten erfassen nahe dem Fokus. Die Kugel wird anschließend lateral zur Deckglasoberfläche bewegt, um Zugspannung auszuüben. (Rechts) Bei axialen optischen Pinzetten wird ein Mikrosphäre außerhalb des Fokus, im linearen Bereich des optischen Potentials, eingefangen. In dieser Konfiguration wird das Polymer über einen Bereich von Dehnungen hinweg unter konstanter Spannung gehalten. Außerdem bewegt eine Erhöhung der Laserintensität die Mikrosphäre in axiale Richtung.

Abbildung 2 Schematische Darstellung axialer optischer Fallen. Laserlicht (1064 nm Nd:YVO₄) wird aufgeteilt in zwei Strahlen, indem es durch einen polarisierenden Strahlteiler (PBS) geleitet wird. Der Manipulationsstrahl durchläuft einen akusto-optischen Deflektor (AOD), während der Kalibrierstrahl unabhängig mithilfe teleskopischer Linsen justiert werden kann. Die beiden Strahlen werden anschließend mittels eines weiteren PBS wieder zusammengeführt und durch ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (N.A.) auf die Probe fokussiert. Gleichzeitig wird eine Hellfeldbeleuchtung, die zur Verfolgung der Mikrokugel dient, durch die Probe hindurchgeführt, mit einem Infrarotfilter (IR) versehen und anschließend von zwei CCD-Kameras abgebildet, wobei eine der Kameras Messungen durchführt, während die andere Teil eines Rückkopplungsregelungssystems ist.

Abbildung 3 Kalibrierung der axialen Position. Zur Kalibrierung der axialen Position nehmen wir defokussierte Bilder einer an der Deckglasoberfläche der Kammer haftenden Kugel bei unterschiedlichen axialen Positionen des Stages auf. Die Größe der Mikrokugel ergibt sich aus dem Abstand zwischen ihrem Mittelpunkt und der Position der maximalen Intensität des hellen Rings, der sich um das Bild der Mikrokugel herum ausbildet. Der Ausschnitt zeigt die radiale Intensitätsverteilung, aus der sich die Größe der Kugel bestimmen lässt.

Abbildung 4 Prinzip der Abbildung des optischen Potentials. Um die optische Kraft des Manipulationsstrahls zu bestimmen, wird die axiale Verschiebung gemessen, die dieser auf eine Mikrokugel ausübt, die in einem deutlich stärkeren Kalibrierstrahl gefangen ist. Dabei wird der Mittelpunkt des linearen Bereichs ermittelt, in dem diese Verschiebung maximal ist. Die Kurve der optischen Kraft über die axiale Position kann integriert werden, um das optische Potential zu berechnen.

Abbildung 5 Kraft-Dehnungs-Kurve. Dargestellt sind Daten für ein zufällig ausgewähltes 1298 bp- und 247 bp-Fragment (Einlage) von doppelsträngiger DNA, das durch axiale optische Pinzetten gestreckt wurde. Die Datenpunkte wurden an das modifizierte WLC-Modell der Gleichung 3 (durchgezogene Linien) angepasst und ergaben effektive Biegestarrheitslängen von 34 nm bzw. 25 nm für die 1298-bp- und 247-bp-Fragmente.

Diskussion

Konventionelle optische Fallen stützen sich entweder auf analoge oder computerbasierte Rückkopplungssysteme, um eine konstante Kraft auf ein lichtbrechendes Objekt auszuüben. Diese aktiven Rückkopplungssysteme stoßen bei Bedingungen an ihre Grenzen, unter denen plötzliche Änderungen der Ausdehnung der Probe auftreten, beispielsweise durch die Bindung eines Proteins an DNA oder das schnelle Schrittverhalten eines molekularen Motors entlang eines Filaments. In jüngster Zeit wurden verschiedene passive Methoden zur Anwendun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz/Ausrüstung	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nd:YVO4-Laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Akusto-optischer Deflektor	IntraAction	DTD-274HA6
Mikroskopobjektiv	Olympus	PlanApo	60X, NA 1,4
Piezo-Stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ-Stage
CCD-Kamera	PixeLink	PL-A741
Photodetektor	Elektro-Optik Tech	ET-3020
Polystyrol-Perlen	Spherotech	SVP-08-10	800 nm, mit Streptavidin beschichtet
Anti-Digoxigenin	Roche	11333089001	Von Schafen
Primer	MWG Operon	Individuelle Oligonukleotide	Ein Primer: Biotin, anderer: Digoxigenin
PCR-Reagenzien	New England Biolabs	Taq-Polymerase, dNTPs
Deckglas	Fisher Scientific
Weitere Chemikalien für Puffer	Fisher Scientific
Zusatzmaterialien
A. Hydrodynamische Reibung C–effizient
Zur Bestimmung der hydrodynamischen Reibung c–Koeffizienten der Mikrokugel in der Nähe einer Oberfläche kann man die folgende Entwicklung verwenden5,10:
wobei die folgende Kurzschreibweise eingeführt wurde:
Die Reibung c–Effizienz wird in Bezug auf die Viskosität der Flüssigkeit definiert. η und dem Radius der Mikrokugel, wobei sich das Zentrum der Mikrokugel in einem Abstand befindet η oberhalb der Oberfläche. Die Summation konvergiert hinreichend gut, wenn sie auf etwa zehn Terme erweitert wird.
B. Einfluss der axialen Position auf die Steifigkeitskalibrierung
Die Kalibrierung der Fallensteifigkeit erfordert einen Kompromiss zwischen der Genauigkeit der Kalibrierung, die mit zunehmendem Abstand von der Oberfläche steigt, und der tatsächlichen axialen Position, an der die Falle experimentell eingesetzt wird. Im Allgemeinen erfolgt die Kalibrierung in einem Abstand von etwa 800–1000 nm von der Oberfläche, was höher liegt als die tatsächliche experimentelle Bedingung.
C. Modell der modifizierten wurmähnlichen Kette (WLC)
Die Kraft-Dehnungs-Kurven können an ein modifiziertes WLC-Modell angepasst werden, das Volumenausschluss-Effekte bei null optischer Kraft wie folgt berücksichtigt:
wo Fopt ist die optische Kraft, xo ist ein Anpassungsparameter für die Ausdehnung bei Nullkraft,xopt ist die Ausdehnung unter Kraft, l ist die Konturlänge der DNA, und l*p ist ein zweiter Anpassungsparameter für ein "wirksam" Persistenzlänge Fwlc wird durch das übliche WLC-Modell beschrieben11 wo ε ist die relative DNA-Streckung.