Methodenartikel
* These authors contributed equally
Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).
Nagetier-Parvoviren (PV) wie Ratten H-1PV und MVM, sind kleine ikosaedrische, einzelsträngige, DNA-Viren. Das Genom enthält zwei Promotoren P4 und P38, die die Expression von nicht-strukturellen (NS1 und NS2) und Kapsid-Proteine (VP1 und VP2), die jeweils 1 zu regulieren. Sie ziehen hohe Zinsen als Antikrebsmittel für ihre onkolytischen und oncosuppressive Fähigkeiten, aber dabei nicht-pathogen für den Menschen 2. NS1 ist das zentrale viraler Cytotoxizität 3. Zur weiteren Verbesserung ihrer natürlichen antineoplastischen Aktivitäten wurden Derivate von diesen Vektoren durch Ersetzen des Gens, das für die Kapsidproteine mit einem therapeutischen Transgens (zB ein zytotoxisches Polypeptid, Cytokin, Chemokin, Tumorsuppressor-Gen usw.) 4 erzeugt wurde. Die rekombinanten Parvoviren (recPVs) Vektor behält die NS1 / 2 kodierenden Sequenzen und die PV-Genom Telomere, die notwendig für die virale DNA-Amplifikation und Verpackung sind. Herstellung vonrecPVs nur, wenn die Produzentenzellen (in der Regel HEK293T), durch Co-Transfektion der Zellen mit einem zweiten Vektor (pCMV-VP) Exprimieren des Gens, das für die VP-Proteine (Abb. 1) 4. Die recPV Vektoren auf diese Weise erzeugt werden, sind Replikation defekt. Obwohl recPVs erwies sich verbesserte oncotoxic Aktivitäten in Bezug auf die elterliche Viren, von denen sie erzeugt worden sein besitzen, bleibt ihre Produktion eine große Herausforderung und stark behindert die Verwendung dieser Mittel im Anti-Krebs-klinische Anwendungen.
Wir fanden, dass die Einführung eines Ad-5-abgeleiteten Vektor, der das E2a, E4 (orf6) und die VA-RNA-Gene (zB pXX6 Plasmid) in HEK293T verbessert die Herstellung von recPVs um mehr als 10-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet. Basierend auf dieser Erkenntnis, haben wir eine neue Ad-VP-Helfer, dass die genomische adenoviralen Elemente notwendig, recPVs Produktion zu verbessern sowie die parvovir enthält gebautuns VP-Einheit 5-Gen. Die Verwendung von Ad-VP-Helfer-, ermöglicht die Herstellung von rec-PV unter Verwendung eines Protokolls, die vollständig von den viralen Infektion Schritte (im Gegensatz zu Plasmid-Transfektion gegenüberliegenden), die Ermöglichung der Verwendung von Zelllinien, die schwer zu transfizieren (zB NB324K) ( Abb.. 2). Wir stellen eine Methode verbessert das groß die Menge des produzierten rekombinanten Virus, wodurch sowohl die Produktionszeiten und-kosten, ohne dass die Qualität des Endproduktes 5. Darüber hinaus ist die großtechnische Herstellung von recPV (in Suspension Zellen und Bioreaktoren) nun denkbar.
Beachten Sie, dass ein Labor mit Sicherheitsstufe 2 für die Produktion rekombinanter Parvoviren (recPV) ist erforderlich.
Das Protokoll ist in zwei Hauptteile gegliedert. Der erste Teil (Herstellung von recPV durch Transfektion) benötigt, um die minimale Menge an recPVs, die als Inokulum dient im zweiten Teil des Protokolls (Herstellung von recPVs durch Infektion) zu erzeugen. Sobald eine kleine Menge von recPVs erzeugt wird, der erste Teil des Protokolls weggelassen werden kann, und die rekombinanten Parvovirus kann nur durch Infektion Bereitstellen des Gens, das für die Parvovirus-Kapsidproteine durch die Adenovirus-Helferfunktionen (....
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Wir haben gezeigt, dass recPV Produktion durch die Anwesenheit von adenoviralen Genom-Elemente erhöht werden kann. Wir haben die recPV Ausbeuten von mehr als 10-fach (0,3 bis 5 TU / Zelle) erhöht, indem Adenovirus genomische Element über Transfektion und durch mehr als 100-fach Co-Infizieren der Zellen mit Ad-VP-Helfer in Kombination mit dem in recPV Vergleich zu herkömmlichen Protokollen. Die hier beschriebene Protokoll kann durch die Bestimmung der am besten geeigneten Zeitpunkt für die Lieferung der Adenovirus-Genom-.......
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Wir haben nichts zu offenbaren.
Wir danken dem Team des DKFZ Virus Produktion und Entwicklung ausgeben, insbesondere Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, und Mandy Roscher. Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) und der Helmholtz-Gemeinschaft im Rahmen des Deutschen Krebsforschungszentrums / Cancéropôle du Grand-Est gemeinsamen Programm in Applied Tumorvirologie unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| MEM | Sigma | M4655 | |
| Fötale Rinderserum | PAA | A15-101 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Fugene | Roche | 047097050001 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Adeno-X Schnelle Titer Kit | Clontech | 632250 |
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