Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

Summary

Ein Verfahren zur Foto-Verkapselung von Zellen in einer vernetzten PEG-Hydrogel beschrieben. Hypoxische Signalisierung innerhalb gekapselt murine Insulinom (MIN6) Aggregate verfolgt wird mit einem fluoreszierenden Marker-System. Dieses System ermöglicht serielle Untersuchung von Zellen in einem Hydrogel Gerüst und Korrelation von hypoxischen Signalisierung mit Veränderungen in der Zelle Phänotyp.

Abstract

In Diabetes mellitus Typ 1, autoimmune Zerstörung der Bauchspeicheldrüse β-Zellen führt zu einem Verlust der Insulin-Produktion und potenziell tödlichen Hyperglykämie. Als alternative Behandlungsoption, um exogene Insulin-Injektion, hat die Transplantation von funktionell Pankreasgewebe wurde ^1,2 erforscht. Dieser Ansatz bietet das Versprechen einer natürlicheren, langfristige Wiederherstellung der Normoglykämie. Schutz des Spenders Gewebe aus dem Immunsystem des Wirtes ist erforderlich, um zu verhindern Ablehnung und Kapselung ist eine Methode verwendet, um dieses Ziel zu erreichen.

Biologisch gewonnene Materialien, wie Alginat ³ und Agarose ^4, haben die traditionelle Wahl für Kapsel Bau gewesen, aber kann eine Entzündung oder fibrotische Überwucherung ^5, die Nährstoff-und Sauerstofftransport behindert auslösen können. Alternativ sind auch synthetische Poly (ethylenglycol) (PEG)-basierte Hydrogele nicht erniedrigend, leicht funktionalisiert, in hoher Reinheit zur Verfügung,haben steuerbaren Porengröße, und sind äußerst biokompatibel, ^6,7,8. Als zusätzlichen Vorteil können PEG-Hydrogele schnell in einem einfachen Foto-Vernetzungsreaktion, der keine Anwendung von nicht-physiologischen Temperaturen ^6,7 gebildet werden. Ein solches Vorgehen ist hier beschrieben. In der Vernetzungsreaktion, UV-Degradation des Photoinitiators, 1 - [4 - (2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-Hydroxy-2-methyl-1-Propan-1-on (Irgacure 2959), produziert freie Radikale, die Attacke der Vinyl-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen zu Di-PEG (PEGDM) induzieren Vernetzung an den Kettenenden. Die Vernetzung kann innerhalb von 10 Minuten erreicht werden. PEG-Hydrogele in einer solchen Art und Weise aufgebaut haben gezeigt, dass positiv Stützzellen ^7,9, und die geringe Photoinitiatorkonzentration und kurze Exposition gegenüber UV-Bestrahlung wirkt sich nicht nachteilig auf die Lebensfähigkeit und Funktion der eingekapselten Gewebe ^10. Während wir unsere Methacrylat-PEG mit dem unten beschriebenen Verfahren können PEGDM auch directly von Herstellern wie Sigma bezogen.

Eine Konsequenz der Kapselung ist die Isolierung der Zellen aus einem Gefäßnetz. Zufuhr von Nährstoffen, vor allem Sauerstoff, wird somit reduziert und begrenzt durch Diffusion. Dies reduziert die Verfügbarkeit von Sauerstoff kann insbesondere Auswirkungen β-Zellen, deren Insulin-Sekretion ist stark abhängig von Sauerstoff ^11-13. Capsule Zusammensetzung und Geometrie wird auch Auswirkungen Diffusionsraten und Längen für Sauerstoff. Deshalb beschreiben wir auch eine Technik zur Identifizierung von hypoxischen Zellen in unserem PEG-Kapseln. Die Infektion der Zellen mit einem rekombinanten Adenovirus kann für ein fluoreszierendes Signal erzeugt, wenn intrazelluläre Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) Wegen ¹⁴ sind aktiviert. Als HIFs die primäre Regulatoren der transkriptionellen Antwort auf Hypoxie sind, stellen sie ein ideales Ziel Marker für den Nachweis von Hypoxie-Signalisierung ^15. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache und schnelle Erkennung von HYPOXIc-Zellen. Kurz gesagt, hat das Adenovirus die Sequenz für ein rot fluoreszierendes Protein (Ds Red DR von Clontech) unter der Kontrolle eines Hypoxie-responsive element (HRE) Trimer. Stabilisierung von HIF-1 durch niedrigen Sauerstoffgehalt fahren Transkription des fluoreszierenden Proteins (Abbildung 1). Weitere Einzelheiten über den Bau des Virus wurden bisher ¹⁵ veröffentlicht. Das Virus ist in 10% Glycerin bei -80 ° C so viele 150 ul Aliquots in 1,5 ml Röhrchen in einer Konzentration von 3,4 x ¹⁰ 10 pfu / mL.

Frühere Studien in unserem Labor haben gezeigt, dass MIN6 Zellen als Aggregate ihre Lebensfähigkeit zu erhalten über 4 Wochen der Kultur in 20% Sauerstoff gekapselt. MIN6 Aggregate bei 2 kultiviert oder 1% Sauerstoff zeigten beide Zeichen von nekrotischen Zellen (immer noch etwa 85-90% lebensfähig) durch Färbung mit Ethidiumbromid sowie morphologische Veränderungen in Bezug auf Zellen in 20% Sauerstoff. Die glatte Kugelgestalt der Aggregate bei 20% angezeigt wurde lost und Aggregate erschien eher wie unorganisiert Gruppen von Zellen. Während die niedrigen Sauerstoff-Stress nicht verursacht einen ausgeprägten Rückgang der Rentabilität, ist es eindeutig Auswirkungen auf MIN6 Aggregation und Funktion als durch Glukose-stimulierte Insulinsekretion ¹⁵ gemessen. Western-Blot-Analyse der eingekapselten Zellen in 20% und 1% Sauerstoff zeigten ebenfalls eine signifikante Erhöhung der HIF-1α für Zellen in den niedrigen Sauerstoffgehalt, die mit dem Ausdruck des DsRed DR-Protein korreliert kultiviert.

Protocol

1. PEGDM Synthese und photoaktive PEGDM Makromer-Aufbereitung

1. Wiegen Sie 2 g PEG (linear, 10.000 Da) in ein 40 mL Glasröhrchen mit einem harten Kunststoffkappe.
2. Add rund 308μL Methacrylsäureanhydrid und lose Kappe der Ampulle.
3. Microwave das Fläschchen auf hoch für 2 Minuten in einer haushaltsüblichen Mikrowelle. Tragen hitzebeständige Handschuhe, gründlich vortexen das Fläschchen, dann Mikrowelle auf hoch für weitere 5 Minuten.
4. Kurz ermöglichen das Fläschchen, um genug kühl, um mit Handschuhen angefasst werden. Uncap es und langsam Methylenchlorid während wirbelnde das Fläschchen. Add genug, so dass die Lösung klar und homogen erscheint, Vortexen der Probe benötigt. 2 mL - Das Gesamtvolumen von Methylenchlorid verwendet werden sollte 1,5 betragen.
5. Niederschlag PEGDM in 200 ml kaltem, gerührt Diethylether, indem die Lösung getropft.
6. Sammeln Sie die PEGDM durch Vakuumfiltration und trocknen lassen.
7. Lösen Sie die PEGDM in ausreichender MengeVE-Wasser (in der Regel 100 -150 ml).
8. Dialysieren die Lösung gegen entionisiertes Wasser für 5 Tage in Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht cut-off von 1.000 Da. Ersetzen Sie das Wasser einmal täglich.
9. Aliquot der Lösung in geeignete Behälter und frieren bei -80 ° C über Nacht. Lyophilisieren die Lösung für 4 Tage, um ein gereinigtes weißes PEGDM Pulver zu erhalten. Bewahren Sie das Pulver bei 4 ° C, wenn nicht in Gebrauch ist.
10. So bereiten Sie eine photoaktive PEGDM Lösung, zunächst ein 0,5 Gewichtsprozent Photoinitiator Stammlösung durch Auflösen Irgacure 2959 in VE-Wasser. Vortex die Lösung und speichern sie in der Dunkelheit.
11. Bereiten Sie eine 10 Gew.% PEGDM und 0,025 wt% Irgacure 2959 Lösung in Balanced Salt Hanks Solution (HBSS). Vortex gründlich, um sicherzustellen, Auflösung der PEGDM. Wir bereiten in der Regel 1 ml dieser Lösung zu einem Zeitpunkt.
12. Sterilisation der Lösung durch Filtration durch einen 0,2 um Spritzenfilter in ein 1,8 ml Reaktionsgefäß. Wickeln Sie das Rohr in Alufolieund lagern bei 4 ° C

2. Kultur, Infektion und Aggregation von MIN6 Zellen

1. MIN6 Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10% FBS, 7mm Glukose, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 0,5 ug / ml amphotercin B in eine feuchte Umgebung bei 37 ° C und 5% CO ₂ kultiviert.
2. Zum Lösen der Zellen aus dem behandelten Kulturflasche Oberfläche absaugen des Mediums, waschen Sie die Zellen mit 37 ° C Calcium / Magnesium-freien HBSS absaugen HBSS, fügen Sie dann 2 ml 37 ° C Trypsin-EDTA-Lösung und damit die Zellen zu inkubieren für 3 Minuten.
3. Fest jar der Seite des Kolbens auf die Zellen frei zu klopfen, dann 8 ml 37 ° C mittlerer und kräftig Pipette die Zellsuspension nach oben und unten kümmert sich nicht um Blasen zu bringen.
4. Pipette die Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen und führen Sie eine Zellzahl mit einer Zählkammer oder andere Zellzählung Verfahren.
5. In Vorbereitung auf die Zellen mit dem Hersteller zu infizierenVirus, zunächst die Gesamtzahl der Zellen infiziert, und berechnen das Volumen der Virussuspension erforderlich, um die gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI) (50 bis 100 infektiöse Partikel pro Zelle) zu erzielen.
6. Verdünnen Sie das Virus in HBSS durch vorsichtiges Pipettieren der richtigen Menge an Virus-Suspension in eine pre-aliquotiert Volumen von HBSS in einem 1,8 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 50 ul HBSS pro Loch Aggregation Zellen geeignet ist.
7. Disperse die Zellen durch Pipettieren sie nach oben und unten in ihre Röhre, dann Pipette das notwendige Volumen bis 400.000 Zellen pro Vertiefung in die Vertiefungen einer 6-well Suspensionskultur Platte zu erreichen.
8. Fügen Sie die entsprechenden Volumen der verdünnten Virus in jede Vertiefung, um die gewünschte MOI zu erzielen.
9. Add Medium in jede Vertiefung, um das Gesamtvolumen bis zu 1,7 mL zu bringen.
10. Legen Sie die Platte auf einem Schüttler im Inkubator. Setzen Sie den Shaker auf eine geringe Lautstärke, so dass das Medium sanft umspült den Vertiefungen (~ 100 rpm). Lassen Sie die Zellen, die Aggregationte für 24-36 Stunden. Aggregate mit einem ungefähren Durchmesser von 75-175 &mgr; gebildet werden sollte.

3. Verkapselung von Zellen in PEGDM

1. Zellen können als Dispersion (Schritt 2.4) oder nach Aggregation (Schritt 2.10) gekapselt werden. Da die Hydrogel-Vorläufer PEGDM Lösung ist ein flüssiges, können Zellen neigen dazu, vor der Vernetzung und Bildung von Hydrogelen zu begleichen. Wenn Abwicklung wird voraussichtlich schnell erfolgen, wie bei größeren Aggregaten, kann es vorteilhaft sein, das Hydrogel in zwei Schritten zu produzieren, so dass die Zellen auf einer mittleren Ebene des Gels zu begleichen. A one-step-Hydrogel-Synthese geeigneten Verfahren für die verteilte Zellen gezeigt (Abbildung 2) und die Zwei-Schritt-Verfahren wird ebenfalls gezeigt (Abbildung 3) und unten näher (3,2-3,9).
2. Erstellen Sie ein Gefäß, in dem das Hydrogel durch Aufschneiden der konischen Spitze aus einer 1 ml Kunststoff-Spritze und stellen Sie es open end up in einem Rack gebildet werden.
3. Pipettieren Sie 20 ul von photoaktiven PEGDM sosung in das offene Ende der Spritze auf den Kolben machen, dass die Lautstärke deckt die gesamte Kolbenfläche. Stellen Sie den Kolben in kleinen Schritten zu einer flachen Oberfläche der Flüssigkeit zu erreichen.
4. Platzieren Sie die Pipette in das Rack und die Position des Racks unter einer UV-Lampe (365nm, ~ 7 mW / cm ²⁾ für ca. 8 Minuten bis zum Hydrogel Vernetzung ermöglichen. Während dieser Zeit kann die Herstellung der Zellen begonnen werden
5. Pipet ein Volumen mit der gewünschten Anzahl der Zellen / Aggregaten in eine 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Kappe und Zentrifuge das Rohr bei 130 g für 5 Minuten.
6. Mit einer Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig den Medien, ohne die Zellpellet an der Spitze des Rohres. Da die Medien Kopf nähert sich dem Pellet, kann es hilfreich sein, um eine feinere verwenden, 10 ul Pipettenspitze.
7. Gently Zellpellet in 20 ul photoaktive PEGDM Lösung (mit einem weitmündigen Pipettenspitze, wenn die Arbeit mit Aggregaten) und fügen Sie die Zellsuspension auf die Spritze oben auf the zuvor Hydrogel Teil vernetzt.
8. Setzen Sie die Spritze, um weitere 8 Minuten UV-Licht zum Bau des Hydrogels abzuschließen. Wenn Sie fertig sind, sollten die Zellen vollständig innerhalb des zylindrischen Hydrogel (Abbildung 3) gekapselt werden.
9. Werfen Sie die Hydrogel aus der Spritze und in 1 ml HBSS in die Vertiefung einer 24-Well-Platte kurz waschen des Gels. Übertragen Sie die Gel auf 1 mL der Medien in der Vertiefung einer 24-Well-Platte und Kultur unter den gewünschten Bedingungen.

4. Hypoxie-Tracking

1. Zu jedem Zeitpunkt während der Kultur-, Bild der Zellen mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie auf die Einleitung des hypoxischen Signalisierung zu verfolgen. Je nachdem, was wird abgebildet können Sie Bilder in der Multi-Well-Platte oder die Übertragung des Gels auf einen Objektträger vor der Platzierung auf dem Mikroskoptisch. Peak-Anregung von Ds Red ist bei 556nm erreicht und Peak-Emission erfolgt bei 586nm. Emission ist ziemlich intensiv und somit Bleichen nicht beobachtbare wordened problematisch zu sein. Lag der Zeit zwischen Beginn der Protein-Produktion und das erste Signal-Erkennung ist etwa 12 Stunden. Das Signal ist spezifisch genug, um individuelle Signalisierung Zellen zu identifizieren, aber die Auflösung nicht ausreichen können, für die Bestimmung intrazellulären Signal-Lokalisierung. In Signalisierung Zellen, wird das Signal in der Regel gleichmäßig über das Zytoplasma beobachtet. Die Signalintensität kann auch mit verlängerten Exposition gegenüber Hypoxie zu erhöhen, obwohl wir noch nicht vollständig bestimmt, wenn dies aufgrund der erhöhten Proteinexpression insgesamt Proteinakkumulation oder verzögert Proteinreifung.

5. Repräsentative Ergebnisse

Ein repräsentatives Beispiel für MIN6 Aggregaten in einer PEG-Hydrogel verkapselt ist in Abbildung 4 dargestellt. Das vernetzte Gel wird so fest, wobei die Form des Gefäßes, in dem die Reaktion durchgeführt wurde. Ein Gel mit glatten Außenflächen ist vorzuziehen zur Implantation in die Prävention eines Fremdkörpers re Hilfe fürResponse. Innerhalb des Gels sollte Zellaggregate vollständig in die Matrix eingeschlossen sein und homogen verteilt, um für eine bessere Nährstoff-Transport zu ermöglichen.

Repräsentative Bilder hypoxischen Signalisierung in MIN6 Aggregate sind in Abbildung 5 dargestellt. Identische MIN6 Aggregate mit dem Marker-Virus infiziert wurden entweder in 20% O ₂ (5a) oder 1% O ₂ (5b) für 44 Stunden vor der Aufnahme von Bildern kultiviert.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Tätigkeit unserer Hypoxie-Marker-System. Adenovirale Einsetzen der Ds Red DR-Gen-und Upstream-HRE-Promotor ermöglicht Hypoxie-induzierte Produktion des fluoreszierenden Proteins unter der Kontrolle des HIF-1.

Abbildung 2. Procedural Ablaufplan für die einstufige Verkapselung von zerstreuten MIN6 Zellen in einem crosslinked PEGDM Hydrogel. Für jedes Gel, sind die dispergierten Zellen in 40 ul der photoaktiven PEGDM Makromers suspendiert. Dies ist in einem abgeschlagenen 1ml Spritze gesetzt und das Hydrogel unter 365nm UV-Licht nach 10-12 Minuten gebildet. Nach der Fertigstellung wird das Hydrogel Festplatte aus der Spritze entfernt, gewaschen und in einem Medium gefüllten Well-Platte für die Inkubation.

Abbildung 3. Procedural Flussdiagramm für die Dual-für-Schritt-Kapselung von aggregierten MIN6 Zellen in einer vernetzten PEGDM Hydrogel. Für jedes Gel, ist ein Halb-Gel zunächst durch UV-Vernetzung von 20 &mgr; l der photoaktiven PEGDM Makromers Lösung für 8 Minuten gebildet. MIN6 Aggregate werden sorgfältig in einem zusätzlichen 20 &mgr; l von photoaktiven Makromers Lösung, die auf der Oberseite des vorgeformten Halb-Gel zugesetzt wird unterbrochen. Die volle Gel wird durch eine zusätzliche 8 Minuten von UV-Exposition mit Aggregaten voll in der medialen gekapselt gebildetEbene des Gels.

Abbildung 4. Das Bild eines 40 ul Hydrogel unter 20-facher Vergrößerung. MIN6 Aggregaten (~ 400.000 insgesamt Zellen) sind klar innerhalb des Gels zu sehen. Hydrogel Durchmesser beträgt ca. 6mm (bar = 1 mm).

Abbildung 5. Fluorescent Hypoxie-Signalisierung in aggregierter MIN6 Zellen in einem PEGDM Hydrogel. Zellen, die gekapselt und wurden dann in den Brutschrank bei 20% O ₂ für 44 Stunden nicht angezeigt Hypoxie-Signalisierung (a), während Zellen, die dann eingekapselt inkubiert in 2% O ₂ für 44 Stunden Anzeige zu löschen, allgegenwärtige Signal. (Bar = 100 um) (b).

Discussion

Die hier vorgestellte Methode bietet eine schnelle und einfache Methode zur Verkapselung von Zellen in einer PEG-Hydrogel mit minimalem Einsatz nicht-physiologischen Bedingungen. PEG ist ein sehr nützliches Verkapselungsmaterial für seine Biokompatibilität und einfache Modifikation. Einfache Variation der PEG Prozentsatz in die photoaktive Lösung, zum Beispiel, kann verwendet werden, um die mechanischen Eigenschaften, wie Druck-Modul, und Transport-Eigenschaften durch Porengröße eingestellt werden. Außerdem ist PEG einfach durch die Zugabe von Seitenketten modifiziert. PEG-Hydrogele, also stellen beide eine viel versprechende klinische Gerät und eine flexible Plattform für in-vitro-Forschung

Eine Methode zur Verfolgung Hypoxie in PEG-verkapselten Zellen wurde ebenfalls vorgestellt. Diese Methode ist für die Einfachheit des Hypoxie-Erkennung und zur Vermeidung der Notwendigkeit, die Zellen von Interesse zu opfern nützlich. Die Technik kann auf eine Vielzahl von Zelltypen in einer Vielzahl von Bedingungen zu schaffen, ihre uns angewendet werdenefulness breit. Zum Beispiel kann eine Hypoxie als Stichwort für Stammzell-Differenzierung in der Stammzellforschung Micromass Kulturen verfolgt werden. Allerdings kann diese Methode nur angewandt, um Zellsysteme oder System, in dem Zellen später aggregiert verteilt dispergieren. Auch kann der Nachweis der Fluoreszenz-Signal werden in größeren oder dichteren Gewebe schwierig.

Materials

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Methacrylsäureanhydrid	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Mikrowelle	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Scientific Industries	SI-A236
Methylenchlorid	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Diethylether	Sigma-Aldrich	346136-1L
Dialyseschlauch	Spektrum	132640
	Laboratories
Gefrierschrank
Lyophilisator	Labconco	7670521
Vakuumpumpe	Welch	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21 bis 022-CV
Spritzenvorsatzfilter	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Custom Formulierung
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	30 bis 002-CI
Amphotericin B	Mediatech	30 bis 003-CF
Inkubator	Thermo Scientific	3597	Napco Serie 8000 WJ w / O2 Unterdrückung
Trypsin EDTA	Mediatech	25 bis 052-CI
Orbital Shaker	VWR	12620-926
UV-Lampe	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Nimmt zwei 40W, 365nm Schwarzlicht blau UV-Lampen
Zentrifuge	Eppendorf	5811 000.010 *	* Bestell-Nr. Modell 5810 R
Mikroskop	Nikon	TI-ND6-PFS	Mit Filtersatz für 556nm Anregung / 586nm-Emission