Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Zusammenfassung

Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Zusammenfassung

Traditionell wurde die Zellwanderung auf zweidimensionalen, steife Kunststoff-Oberflächen untersucht. Doch bei wichtigen biologischen Prozessen wie der Wundheilung, Geweberegeneration und Krebs Metastasen, müssen die Zellen durch komplexe, dreidimensionale extrazelluläre Gewebe zu navigieren. Zum besseren Verständnis der Mechanismen hinter diesen biologischen Prozessen ist es wichtig, die Rolle der Proteine ​​verantwortlich für den Antrieb Zellmigration zu untersuchen. Hier skizzieren wir ein Protokoll, um die Mechanismen der Zell-Migration mit der epithelialen Zelllinie (MDCK)-Studie, und eine dreidimensionale, faserig, Selbst-Polymerisation von Matrix als Modellsystem. Diese optisch klare extrazellulären Matrix ist leicht zugänglich live-cell imaging Studien und besser imitiert die physiologische, Weichteil-Umgebung. Dieser Bericht zeigt eine Technik für die direkte Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik, und die Verformung des umgebenden dreidimensionalen Matrix.

PrüfungEliminierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik bei zellulären Prozessen bietet wichtige Einblicke in Protein-Funktionen. Genetisch kodierte fluoreszierende Tags bieten eine einzigartige Methode zur Beobachtung Proteinlokalisierung und Dynamik. Mit dieser Technik können wir die subzelluläre Ansammlung von Schlüssel zu analysieren, Kraft generierenden Komponenten des Zytoskeletts in Echtzeit, wie die Zelle Manöver durch die Matrix. Darüber hinaus mit mehreren fluoreszierenden Markierungen mit unterschiedlichen Wellenlängen, können wir die Ortung von mehreren Proteinen gleichzeitig, so dass wir zu testen, zum Beispiel, ob unterschiedliche Proteine ​​ähnliche oder unterschiedliche Rollen haben. Darüber hinaus kann die Dynamik der Fluoreszenz-markierten Proteinen quantifiziert unter Verwendung von fluoreszierenden Recovery After Photobleaching (FRAP) Analyse sein. Diese Messung Assays das Protein Mobilität und wie stabil gebunden werden die Proteine, die Zytoskelett-Netzwerks.

Durch die Kombination von live-cell imaging mit der Behandlung von Protein-Funktion Inhibitoren,Wir können in Echtzeit die Änderungen in der Verteilung der Proteine ​​und die Morphologie der wandernden Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus kombinieren wir auch live-cell imaging mit der Verwendung von fluoreszierenden Tracer-Partikel in der Matrix eingebettet werden, um die Matrix Verformung während der Zellmigration zu visualisieren. So können wir visualisieren, wie eine wandernde Zelle krafterzeugenden Proteine ​​verteilt, und wo die Zugkräfte auf die umgebende Matrix ausgeübt. Durch diese Techniken können wir wertvolle Einblicke in die Rolle von spezifischen Proteinen und ihre Beiträge zu den Mechanismen der Zellwanderung zu gewinnen.

Protokoll

1. Generierung von stabilen Zelllinien (zB MDCK-Zellen)

1. Platte Zellen bei 80-90% Konfluenz in einer p35 Gericht. Lassen Sie sich nicht Zellen bilden 100% konfluenten Monolayer, die Transfektionseffizienz verringern.
2. Schleusen die Zellen mit dem Plasmid von Interesse mit Lipofectamine 2000. Optimieren Transfektionsbedingungen mit dem Protokoll des Herstellers.
3. Am nächsten Tag, Passage der Zellen in zwei p150 Petrischalen. Die große Schüssel wird empfohlen, genügend Abstand zwischen den stabilen Kolonien zu ermöglichen.
4. Am nächsten Tag das Medium wechseln und fügen 500 ug / ml G418 zu jedem Gericht. Die G418-Konzentration sollte für die einzelnen Zelllinien optimiert werden.
5. Ändern Medien jeden zweiten Tag für etwa 2 Wochen. Nach 2 Wochen sollte G418-resistente Kolonien beginnen sich zu bilden, und wird sichtbar mit bloßem Auge.
6. Mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, identifizieren GFP positive Kolonien. Markieren Sie diese Kolonien auf der Platte mit einem Sharpie Stift.
7. Um selektiv trypsinize die Kolonien aus dem Gewebekulturplatte absaugen aus den Medien, und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS oder Trypsin-Lösung. Auf dem zweiten waschen, nicht saugen alle die Lösung. Lassen Sie eine dünne Schicht von Flüssigkeit auf der Unterseite der Platte, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern.
8. Für jedes markierte Kolonie: Verwendung einer sterilisierten Wattestäbchen, um so nah wie möglich abwischen um den Rand der Kolonie. Dadurch wird eine Insel der Nassbereich mit der Zelle Kolonie. Je 10 ul von Trypsin auf die Kolonie. Wiederholen Sie für jede Kolonie, und gehen schnell ein Austrocknen zu verhindern. Ein erfahrener Forscher können in der Regel holen ~ 12 Kolonien pro p150 Platte.
9. Inkubieren Platte bei 37 ° C für 5-10 Minuten, bis die Zellen von der Platte lösen und rund erscheinen.
10. Für jede Kolonie: Je 10 ul von Trypsin auf die Kolonie, und Pipette nach oben und unten ein paar Mal, um Zellen von der Platte zu lösen. Dann Pipette alle Zellen aus der Kolonie in einem einzigen gut in einer 24-Well-Schale.
11. Nach stabile Kolonien gewachsen sind, Proteinexpression von jeder Kolonie ist mittels Standard Western Blot und Immunfluoreszenz. Erweitern Sie diese Zelllinien für die weitere Analyse.

2. Oberflächenmodifizierung von Glasboden Gericht für eine optimale Kollagenbindungsaktivität (Optional)

1. Um silanisieren das Glas, Pipette 300 pl 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilan Lösung auf das Glas Teil eines jeden p35 Schale mit einem 10 mm Öffnung. Siehe Abbildung 1 für die Silanisierung und Vernetzung schematisch. 3-Aminopropyltrimethoxysilan in gefiltertes Wasser verdünnt.
2. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
3. Saugen Sie die 3-Aminopropyltrimethoxysilan Lösung und wäscht mit gefiltertem Wasser dreimal für jeweils 10 Minuten.
4. Saugen Sie das Wasser und legen Gerichte auf heißer Platte auf 50 ° C für 1,5 Stunden. Legen Spitzen der Gerichte leicht aus der Schale, so dass Feuchtigkeit in die Schüssel entweichen kann.
5. Entfernen Sie Gerichte aus Hitze und lassen cool.
6. Pipette 300 pl 2% Glutaraldehyd-Lösung auf das Glas Portion von jedem Gericht. Die Glutaraldehyd in PBS verdünnt.
7. Inkubation für 1 Stunde.
8. Saugen Sie die Glutaraldehyd-Lösung und Geschirr spülen mit PBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
9. Sterilisieren Gerichte durch die Einwirkung von UV-Licht für 1 Stunde. Die silanisierten Gerichte können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

3. Erstellung von 3D-Kollagen-Gel mit Tracer-Partikeln

1. Wash fluoreszierender Tracer Partikel indem sie zum Stillstand 100 ul of stock Tracer-Partikel ⁽¹⁰ 10 Partikel / ml) in einer Zentrifuge bei 15.000 rpm für 5 Minuten saugen die Flüssigkeit, und fügen Sie 500 ul von Medien. 5 Mal wiederholen. Nach der letzten Wäsche, resuspendieren Partikel in 30 ul Medien.
2. Trypsinize GFP exprimierenden Zellen wie gewohnt.
3. Resuspendieren Zellpellet auf ca. 2 x 10 ⁶ Zellen / ml.
4. Pipette 240 ul des Wachstums von Medien in ein Eppendorf-Röhrchen.
5. Add 12,6 &mgr; l 1 M Hepes, 20 ul gefiltertes Wasser, 50 ul Zell-Lösung, dann 10 ul von fluoreszierenden Partikeln.
6. Schließlich, fügen Sie 167 ul von Rindern Dermis Collagen I-Lösung (eine funktionierende Konzentration von 1 mg / ml) zu erhalten.
7. Mix-Lösung gründlich, dann Pipette 80 ul der Lösung auf das Glas Teil des silanisierten Glasboden Gericht.
8. Legen Schüssel in Inkubator und damit das Gel bei 37 polymerisieren ° C für 30 Minuten. Siehe Abbildung 1A für typische Kollagen-Gel in einer p35 Glasboden Gericht.
9. 2 ml Wachstumsmedium sorgfältig zu jedem Gericht.

4. Vorgehensweise für Zeitraffer-Bildaufnahme

1. Schalten Sie die Temperaturregelung des Mikroskops Gehäuse und lassen den Umfang Kammer auf einen steady state temperieren auf 37 ° C. Siehe Abbildung 2 für ein Beispiel für Live-Cell-Imaging-System.
2. Ändern Medien auf die neuen Medien mit 25 mM Hepes ergänzt um einen neutralen pH-Wert aufrecht zu erhalten. FürDIC Imaging, Austausch der Spitze der Schale mit einem, dass eine Glasplatte hat. Mit einem dünnen Streifen Parafilm, decken Sie die Seite der Schale, um Medien Verdunstung zu verhindern.
3. Für eine Ölimmersionsobjektiv, einen Tropfen Immersionsflüssigkeit auf das Ziel.
4. Legen Sie die Kollagen-Gel mit Schale auf Mikroskoptisch, und vergewissern Sie sich das Gericht in Kontakt mit der Immersionsflüssigkeit.
5. Schwerpunkt der Probe und die Suche nach Zellen von Interesse zu Bild. Zur Minimierung der Bühne treiben, damit Teller für ca. 45 Minuten vor Beginn einer langen Aufnahme zu regeln.
6. Geben Sie die Parameter der Bildaufnahme. Minimieren Laserbelichtung, die die Zellen schädigen könnten, durch die Modulation der Laserleistung, Belichtungszeit, Häufigkeit und Dauer der Aufnahmezeit. Die aktuellen Parameter werden mit dem Mikroskop und Zelltyp variieren.
7. Während der Zeitraffer-Übernahme kann ein Inhibitor zugesetzt werden. Für den Inhibitor neben Experiment, nicht verschließen die Schale mit Parafilm.
   1. Prepsind Hepes ergänzt Medien mit Drogen in einer gewünschten Arbeitskonzentration.
   2. Wenn Sie bereit sind, um Drogen zu Medien, Pause die Bilderfassung, hinzufügen und entfernen Sie vorsichtig die Schale oben, ohne die Schale.
   3. Saugen Sie die Medien in die Schüssel, und Pipette das Arzneimittel mit Medien in die Schüssel. Ersetzen Sie dann sorgfältig die Schale oben.
   4. Die Probe kann out-of-focus durch die Zugabe von neuen Medien, stellen Sie den Fokus.
   5. Starten Sie die Aufnahme, überwachen Sie dann die Aufnahme für die nächsten 30 Minuten, und stellen dann wie gewünscht ein. Siehe Abbildung 4 zeigt ein Beispiel der Drogenabhängigkeit zu experimentieren.

5. FRAP Verfahren und Analyse

1. Die FRAP Setup variiert zwischen den Systemen, folgen Anweisungen des Herstellers.
2. Set up Parameter für Live-Cell-Imaging.
3. Set up Parameter für Bleichen. Verwenden Sie ausreichend Laserleistung auf das Fluoreszenz-Signal ohne Beschädigung der Zelle photobleach. Testen Sie diese parmesser auf die Praxis Zellen.
4. Starten der Aufnahme von Bildern, und warten Sie mindestens 5 Frames der Bildaufnahme vor Ausbleichen der Region von Interesse.
5. Weiter zu erfassen und Recovery-Zeit sollte ausreichen, um die volle fluorescence recovery erfassen. Siehe Abbildung 5 für ein Beispiel für FRAP-Experiment.
6. Analysieren Sie die fluorescence recovery durch die Messung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität des gebleicht Bereich (vor und nach Bleichen) über die Zeit. Mit einer statistischen Analyse-Software (zB Excel), passen die Erholung Kurve des exponentiellen Gleichung: I = I _f ^(1-e-kt), wobei I die Intensität, I _f ist die letzte Intensität, t die Zeit und τ _½ ist die Zeit, die Intensität auf die Hälfte der Endwert zu erreichen: τ _½ = ln (2) / k. Die Halbzeitpause ist ein Maß für die Mobilität des Proteins.
7. Erhalten Sie die Parameter, Halbzeit-und abschließenden Intensität aus dem exponentiellen Fit-Kurve. Berechnen the mobile Bruchteil, indem das Verhältnis der endgültigen zu ersten Fluoreszenz-Intensitäten.

6. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für die live-cell imaging gesunder Epithelzellen innerhalb der Matrix ist in Abbildung 3 dargestellt. Gesunde Zellen weisen eine glatte, durchgehende Membran und deutlichen Kern, während kranken Zellen häufig eine gestörte Membran und eine übermäßige Anzahl von Vakuolen haben. In einer 3D-Matrix migrieren einzelnen Epithelzellen ^1, und im Laufe von mehreren Tagen bilden Epithelzellen dreidimensionale, kugelförmige, mehrzelligen Zysten innerhalb der Matrix ^2. Die Zellen sind ebenfalls sehr dynamisch, und die Migration innerhalb der Zyste (Abb. 3). Die Matrix Verformung infolge der Zugkräfte von wandernden Zellen ausgeübt wird, durch die Verschiebung der Tracer-Teilchen in der umgebenden Matrix (Abbildung 4) eingebettet analysiert. Der Tracer Partikel Bewegungen sind als maximale Projektion Bild abweichen angezeigtHNO-Zeitpunkten, und jedes Mal Punkt ist pseudo-gefärbt, um die Zeit (Abbildung 4B) zeigen. Alternativ werden die Bilder eines einzelnen Tracer Teilchen als eine Montage angezeigt, um die Bewegung des Teilchens Tracer im Laufe der Zeit (Abbildung 4C) zu zeigen. Alle Bildanalyse erfolgte mit ImageJ. Diese qualitativen Einschätzungen der Matrix Deformation und damit die Kräfte, die durch wandernden Zellen ausgeübt wird, sind nützlich, in erster Näherung der Zugkraft Verteilung. Die quantitative Bestimmung der Zugkräfte von wandernden Zellen in 3D ausgeübt wird, würde den Rahmen dieses Protokoll und wird an anderer Stelle ^3,4 beschrieben.

Ein typisches fluorescence recovery after photobleaching Experiment ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Region von Interesse sind gebleicht mit optimierten Laser-Einstellungen so, dass die Intensität der Fluoreszenz sichtbar ist Hintergrundwerte (an Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren) vermindert im Vergleich und gleichzeitig gesunde und unbeschädigte Zellen sein. Die optimale Einstellung muss be empirisch als jeder FRAP Setup ist anders bestimmt (zB FRAP mit Laser-Scanning-konfokalen System).

Die Belichtung und Zeit-Intervall von post-FRAP Bildaufnahme müssen sorgfältig kontrolliert werden, um Hintergrund Ausbleichen zu vermeiden. Die Verwendung von niedrigeren Laserleistung, kurze Belichtungszeit, und die Verwendung von empfindlichen Kamera und hocheffizienten Optiken sind für hohe Qualität FRAP Bildgebung unverzichtbar. Wenn die Fluoreszenz Bleichen während der Bildaufnahme ist bezeichnend, muss diesem Hintergrund verblassen quantifiziert und normalisiert werden aus den beobachteten Fluoreszenzintensität Erholung. Durch 3D-Charakter der Umgebung, kann die z-Komponente der Fluoreszenz-Intensität Erholung bedeutsam werden. Deshalb ist es wichtig, eine gebleicht Volumen, indem sie vor und nach der 3D-Stapel-Bildern von gebleicht Region zu definieren. Die weitere Analyse und Modellierung von Fluoreszenz-Erholung ist an anderer Stelle ^5,6 diskutiert.

Die einzigartige Kombination von live-cell imaging techniques: GFP, um die Dynamik des Zytoskelett-Proteine, rote Fluoreszenz-Tracer Teilchen folgen, um die Matrix Verformung, und die Zugabe von Inhibitoren zu überwachen, können gleichzeitig für die Analyse von Protein-Dynamik, Zugkraft und molekularen Mechanismen eingesetzt werden.

Abbildung 1. Herstellung von Kollagen-Gel. A) polymerisiert Kollagenmatrix auf einem Glasboden-Schüssel. Die rosa Farbe des Gels ist auf Embedded-fluoreszierende Partikel. B) Verfahren zur Behandlung der Glasboden Gerichte, die Kollagen-Gel auf der Glasoberfläche zu vernetzen. Zunächst wird der Glasboden Schüssel mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan Lösung, dann Glutaraldehyd-Lösung, die Kollagen-Matrix vernetzt, um das Glas behandelt.

Abbildung 2. Schematics der konfokalen / FRAP Mikroskop Setup. Das konfokaleMikroskop befindet sich auf einem Zeiss AxioObserver mit einem CoolSnap HQ II CCD-Kamera basiert und vollständig Slidebook Software (Intelligent Imaging Innovations) automatisiert. Das konfokale Einheit ist speziell entwickelt und basiert auf Yokogawa drehende Scheibe Einheit CSU10 und zwei Festkörperlaser (488 nm mit 50 mW und 561 nm mit 40 mW) mit akusto-optischen Filter (AOTF) in Millisekunden Umschalten zwischen zwei Lasern lassen. Die Emission Filter 525/50 nm und 620/60 nm (# 118661 und # 118085, Chroma Technology) und dichroitische Spiegel ist 488-568 BrightLine Dual-Band (Semrock). Die Ziele sind eine lange Distanz 40x C-Apochromat Objektiv mit NA 1,1 und Arbeitsabstand von 0,62 mm und einem 63x Plan-Apochromat Objektiv mit NA 1,4 und einem Arbeitsabstand von 0,19 mm. Das Mikroskop enthält auch eine FRAP Photoablation System, das von einer Faser optisch gepumpte Farbstofflaser, einen Computer gesteuert Strahlposition und Intensität, und einem beugungsbegrenzten Spotgröße besteht. Darüber hinaus ist das Mikroskop ausgestattet miteinem xy-motorisierten Bühne, die 0,1 Mikron Längenmessgeräte auf jeder Achse enthält. Während der Zeitraffer-Bildgebung, ist die Umgebungstemperatur um ein kundenspezifisches Mikroskop Kammer und eine Heizung mit einem Feedback-Temperaturregelung aufrechterhalten. Zur Isolierung jedes Geräusch und Vibration, wird das gesamte Mikroskop-System auf einem vibrationsfreien Tisch.

Abbildung 3. Live Cell Imaging von Epithelzellen, die GFP-Aktin. Diese Zellen bilden eine Zyste nach 4 Tagen der Kultur in einer 3D-Kollagen-Matrix. Einige Zellen bewegen sich entlang der Oberfläche der Zyste (gelbe Pfeilspitze), während andere im Inneren der Zyste (roter Pfeil) zu migrieren. Maßstab 10 um, die Zeit in Stunden.

Abbildung 4. Die Wirkung von Rho-Kinase-Hemmung auf Zugkraft. A) DIC Bild eines wandernden MDCK Zelle, die GFP getaggt nukleare Marker. Das Bild wurde unmittelbar vor der Behandlung von Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 entnommen. Maßstabsleiste 10 pm. B) Particle Verschiebung durch die Zugabe von Y-27632. Die Partikel-Positionen zu verschiedenen Zeitpunkten (0 bis 52 min) wurden pseudo-farbig nach der Intensität Maßstab, dann auf ein einziges Bild projiziert. Der weiße Bereich ist der GFP positiven Kern in den wandernden Zellen. Maßstabsleiste 10 pm. Zeit in Minuten. C) Die Partikelbewegung an der Hinterkante der Zelle (siehe Pfeil in B). Asterisk bezeichnet das letzte Bild vor dem Y-27632 zusätzlich erfasst. Der Tracer Partikel bewegt hin und weg von der Hinterkante des wandernden Zellen vor und nach der Zugabe von Y-27632, bzw.. Maßstab 1 um.

Abbildung 5. FRAP Analyse von GFP-Aktin exprimierende Zelle Migration in einer dreidimensionalen Matrix. A) Timelapse Bilder der GFP-Aktin exprimierende Zelle vor und nach dem Bleichen. Ein kleiner Bereich der GFP-Aktin an der Zelle hinten angesammelt wurde gebleicht (rote Pfeilspitze) Zum Zeitpunkt 0 ist. Zeit in Sekunden, Maßstab 5 um. B) Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des gebleicht Region (durchgezogene Linie) und die exponentielle Anpassung der Fluoreszenz Recovery (Kreise) aufgetragen über die Zeit. Die Fluoreszenzintensität wurde auf den ursprünglichen Wert vor Ausbleichen normalisiert.

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung live-cell imaging, die Mechanismen der Zellwanderung in einer dreidimensionalen Matrix zu studieren. Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von den Erhalt "gut" Klone stabil exprimieren GFP-markierten Proteine. Das niedrige Niveau der GFP-Proteine ​​erfordert einen Überschuss Anregung Exposition der Zelle Gesundheit Kompromisse, während ein zu hoher GFP Ebene unerwünschte Nebenwirkungen auf die Zelle haben wird. Somit ist der Vektor Wahl, um Gene in Zellen transfiz...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Collagen, Rinder-, Typ-I-	BD Biosciences	354231	Stock ist ca. 3 mg / ml
3-Aminopropyltrimethoxysilan	Sigma Aldrich	281778	Verdünnen in Wasser
Glutaraldehyd	Sigma Aldrich	340855	Verdünnen Sie in PBS
1M Hepes	Invitrogen	15630-080
Fluospheres Polystyrol-Mikrokügelchen 1 um, rote Fluoreszenz (580/605)	Invitrogen	F13083
Geneticin (G418)	Invitrogen	11811-031
Kultur Media-Komponenten:
DMEM	Invitrogen	31600-034
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S115500
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Kanamycin	Invitrogen	15160-054