Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Modellsystem zur Untersuchung Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Latenz und Reaktivierung. Der Test verwendet homogene sympathischen Neuronen Kulturen und ermöglicht die molekulare Analyse der Virus-Neuron-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Vielzahl von Anwendungen, wie RNA-Interferenz und Expression von rekombinanten Proteinen.

Zusammenfassung

Herpes simplex Virus Typ-1 (HSV-1) stellt eine lebenslange latente Infektion in peripheren Neuronen. Dieses latente Reservoir ist die Quelle der wiederkehrenden Ereignissen, die Reaktivierung Übertragung zu gewährleisten und dazu beitragen, klinischen Erkrankung. Aktuelle antivirale Medikamente haben kaum Auswirkungen auf das latente Reservoir und es gibt keine Impfstoffe. Während die molekularen Details der Virusvermehrung gut charakterisiert sind, bleiben Mechanismen, die Latenz in den Neuronen schwer fassbar. Unser gegenwärtiges Verständnis von Latenzzeiten von In-vivo-Studien mit kleinen Tiermodellen, die zur Definition der virale Gen Anforderungen und die Rolle der Immunreaktionen wurden unentbehrlich abgeleitet. Jedoch ist es unmöglich, spezifische Wirkungen auf die Virus-Neuron-Verhältnis von mehr allgemeinen Folgen der Infektion durch Immun oder nicht-neuronalen Zellen Unterstützung in lebenden Tieren vermittelt unterscheiden. Darüber hinaus ist Tierversuchen kostspielig, zeitaufwendig und im Hinblick auf die begrenzten verfügbaren Optionen für die Manipulation von HostVerfahren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wird ein Neuron-System nur, dass dringend benötigte reproduziert die in vivo Eigenschaften von Latenz und Reaktivierung, sondern bietet die Vorteile von Gewebekulturen in Bezug auf die Homogenität und Zugänglichkeit.

Hier präsentieren wir ein in vitro Modell unter Verwendung von kultivierten primären sympathischen Neuronen von Ratten überlegen Halsganglien (SCG) (Abbildung 1) zu HSV-1-Latenz und Reaktivierung, die passt zu studieren meisten, wenn nicht alle gewünschten Kriterien. Nach Beseitigung nicht-neuronalen Zellen, sind nahezu homogen TrkA ⁺ Neuronenkulturen mit HSV-1 in Anwesenheit von Acyclovir (ACV) die lytische Vermehrung zu unterdrücken infiziert. Nach der Entfernung ACV, nicht-produktive HSV-1-Infektionen, die treu zeigen akzeptiert Markenzeichen der Latenz werden effizient etabliert. Insbesondere werden lytischen mRNAs, Proteine, und das infektiöse Virus nicht nachweisbar, auch in Abwesenheit der Auswahl, aber Latenz-assoziierten Transkript (LAT) exprimierenIonen besteht in neuronalen Kerne. Virale Genome mit einer durchschnittlichen Anzahl von 25 Kopien pro Neuron gehalten und können zur produktiv zu stören PI3-Kinase / Akt Signalisierung oder Rücknahme eines Nerven Wachstumsfaktor ¹ zu replizieren. Rekombinantes HSV-1-Codierung EGFP fusioniert mit dem lytischen Proteins US11 eine funktionale Echtzeit-Marker für die Replikation durch die Reaktivierung, die leicht quantifiziert wird. Zusätzlich zu den chemischen Behandlungen können genetische Methoden wie RNA-Interferenz oder Gentransfer über lentiviralen Vektoren erfolgreich auf das System ermöglicht mechanistische Studien, die sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, bei Tieren angewendet werden. Zusammenfassend bietet die SCG-basierten HSV-1-Latenz / Reaktivierung System eine leistungsstarke, notwendiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen, die HSV1 Latenz und Reaktivierung in Neuronen, ein langjähriger Rätsel, dessen Lösung in der Virologie können neue Einblicke in die Entwicklung neuer Therapien anbieten zu entwirren, dass Ziel ter latent Herpesvirus Reservoir.

Protokoll

1. Isolierung und Kultivierung von Neuronen aus SCG Rattenembryonen

Um eine sinnvolle Kontext für das Verständnis dieses Protokoll geben, und für eine umfassende Diskussion der älteren Literatur, die etablierten Methoden der SCG Neuron Kultur, einschließlich der Grundlage für die SCG in vitro-Kultur-, Platten-Beschichtung von Substraten und den Komponenten des Serum-freien Medien, die Leser wird auf Referenzen ^4.2 bezeichnet.

1. Die Verwendung von Ratten als Quelle für die SCG Neuronen wurde in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien im Rahmen einer aktiven Protokoll, das von der Institutional Animal Care & Use....

Diskussion

Diese primäre Neuron Kultur und Infektion System bietet eine einfache und effektive Methode, um die molekularen Mechanismen HSV-1-Latenz und Reaktivierung zu erkunden. Das System treu rekapituliert die anerkannten Markenzeichen der Latenz in beiden Infektionen beim Menschen und bei Live-Tiermodellen definiert. Wenn das Virus in den SCG Kulturen latent ist, können infektiöse Partikel und lytischen Genprodukte nicht nachgewiesen werden. Die einzige virales Genprodukt in latent infizierten Neuronen, wird m.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagens	Firma	Katalog #	Kommentare
70μm Nylon-Filter (Zellsieb)	BD Biosciences	352350
1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS - / -)	Invitrogen	14175	W / O CaCl 2 und MgCl 2
1x Minimum Essential Medium (MEM)	Invitrogen	11095-080
5-Fluoro-2'-desoxyuridin	Sigma	F0503	Vorbereitung 20 mM Lager in 1X MEM; Lagerung bei -20 ° C
96-Loch-flache Boden gut TC Platten	Corning	3599
Acyclovir	Calbiochem	114798	Vorbereitung 31 mM Stammlösung in DMSO; Lagerung bei -20 ° C
Aphidicolin	Calbiochem	178273	Vorbereitung 10 mM Stammlösung in DMSO; Lagerung bei -20 ° C
B-27 Supplement	Invitrogen	17504-44
Collagenase	Sigma	C2674	Vorbereitung 10 mg / ml in HBSS Lager - / -; Lagerung bei -20 ° C
D-(+)-Glucose	Sigma	G6152	Vorbereitung 40% Lager in H 2 O; Filter sterilisieren und bei 4 ° C lagern
L-Glutamin	Invitrogen	25030-081
Laminin	Sigma	L2020	Herstellung von 1 mg / ml Stammlösung in H 2 O; quick-freeze 20 ulaliquats & Speicher bei -80 ° C; verdünnte bis 2 pg / ml konz arbeiten. in sterilem H 2 O
Leibovit'z L-15-Medien	Invitrogen	11415
Nerve Growth Factor	Harlan Laboratories	BT.5017	Vorbereitung 50 ug / ml in HBSS Lager - / -; Speicher bei -80 ° C
Neurobasalmedium	Invitrogen	12348
Phosphonoessigsäure (PAA)	Sigma	P6909	Vorbereitung 75 mg / ml Stammlösung in H 2 O; Lagerung bei -20 ° C
Poly-D-Lysin Hydrobromid	Sigma	P0899	Es werden 20 mg / ml Stammlösung in H 2 O; Lagerung bei -20 ° C
Rattenschwanz Collagen	Millipore	08-115	Konzentration variiert mit viel Versorgung; lagern bei 4 ° C und verdünnt auf 0,66 mg / ml konz arbeiten. in sterilem H 2 O
Trichostatin A	Sigma	T8552	Vorbereitung 1 mM Stammlösung in DMSO; Lagerung bei -20 ° C
2,5% Trypsin	Invitrogen	15090-04