Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.

Abstract

Nanopartikel-Systemen haben als wertvolle Hilfsmittel zur Verabreichung von Impfstoffen durch ihre Fähigkeit, effizient zu liefern Fracht, einschließlich Proteine ​​entstanden, auf Antigen-präsentierenden Zellen ^1-5. Internalisierung von Nanopartikeln (NP) von Antigen-präsentierenden Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Erzeugung einer Immunantwort gegen das verkapselte Antigen. Um, wie sich Änderungen in Nanopartikel-Formulierung auswirken Funktion zu bestimmen, haben wir versucht, einen hohen Durchsatz, quantitative experimentelle Protokoll, das kompatibel mit Erkennung internalisierte Nanopartikel sowie Bakterien war zu entwickeln. Bis heute wurden zwei unabhängige Techniken, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, waren die Methoden benutzt, um die Phagozytose von Nanopartikeln zu untersuchen. Der hohe Durchsatz Natur der Durchflusszytometrie erzeugt robuste statistische Daten. Jedoch aufgrund der niedrigen Auflösung, schlägt es genau zu quantifizieren verinnerlicht gegenüber Zelle gebundenen Nanopartikeln. Mikroskopie erzeugt Bilder mit hoher räumlicher Auflösung; however, es ist zeitaufwendig und birgt kleinen Stichproben ^6-8. Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (MIFC) ist eine neue Technologie, die sowohl Aspekte der Mikroskopie und Durchflusszytometrie, die Multi-Color-spektralen Fluoreszenz-und Hellfeld-Bildgebung führt gleichzeitig durch eine Laminar-Kern enthält. Dadurch ist eine genaue Analyse des Fluoreszenzsignals Intensitäten und räumlichen Beziehungen zwischen unterschiedlichen Strukturen und zellulären Eigenschaften bei hoher Geschwindigkeit.

Hier beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung MIFC um die Zellpopulationen, die Polyanhydrid Nanopartikel oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium verinnerlicht haben zu charakterisieren. Wir beschreiben die Herstellung von Nanopartikel-Suspensionen, Zellmarkierung, Erwerb auf einem ImageStream ^X-System und die Analyse der Daten mit Hilfe des IDEAS-Anwendung. Darüber hinaus zeigt die Anwendung einer Technik, die verwendet werden, um die Internalisierung p unterschieden werden könnenathways für Nanopartikel und Bakterien mit Cytochalasin-D als ein Inhibitor der Aktin-vermittelte Phagozytose.

Protocol

1. RAW 264.7 Cell Culture

1. Ernte RAW 264.7-Zellen aus ihren Flaschen, wenn sie Konfluenz durch Abkratzen sie leicht mit einem Zellschaber erreichen. Anzahl und der Platte diese in eine 24-Loch-Mikrotiterplatte mit einer Dichte von 5 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in 0,5 ml komplettem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (cDMEM, 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamax, und 10 mM HEPES) und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einer 5% CO _{2 inkubiert.}

2. Pathogene Salmonella enterica Serovar Typhimurium 14028 Transformation und Kultur

1. Einführung rekombinanter Plasm....

Discussion

Studien haben gezeigt, dass biologisch abbaubare Nanopartikel auf Basis von Poly (milchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) oder Polyanhydriden verwendet werden, um eingeschlossene Antigene oder Medikamente Zielzellen abzugeben. Aufnahme dieser Nanopartikel von phagozytischen Zellen auf ihre Wirksamkeit wichtig, damit quantitative . Analyse der Internalisierung kritisch bei der Entwicklung neuartiger Nanopartikel-Delivery-Systeme Mit dieser Methode können differentielle Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedenen Zelltypen mit L.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
RAW 264.7 Zelllinie	American Type Culture Collection (ATCC)	TIB-71
Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM)	Cellgro	10 bis 013-CV
Fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	S 11150	Premium Grade
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
24-Well-Platte	TPP	92024
Zellkulturflaschen	TPP	90151
Zellschaber	TPP	99002	24 cm
Salmonella enterica Serovar Typhimurium	ATCC	14028
BTX ECM630 Electro Zellmanipulators	BTX Harvard Apparatus
MOPS	Fisher Scientific	BP308
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)	Cellgro	21 bis 040-CV
Ultraschall-Prozessor flüssig	MisOnix	S-4000
Cytochalasin-D	Sigma-Aldrich,	C8273
Formaldehyd	Polysciences	04018
Waschpuffer	2% hitzeinaktiviertem FBS, 0,1% Natriumazid in PBS.
Perm / Waschpuffer	BD Biosciences	554714
Freisicht-Schnappdeckel Mikroröhrchen	Sigma	T4816
Alexa Fluor 660 Phalloidin	Invitrogen	A22285
ImageStream X	Amnis Corporation	100200	Optionen: 658nm Laser, Autosampler
Natriumazid	Fisher Scientific	S-500 227I