In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.
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Methodenartikel
Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nanopartikel-Systemen haben als wertvolle Hilfsmittel zur Verabreichung von Impfstoffen durch ihre Fähigkeit, effizient zu liefern Fracht, einschließlich Proteine entstanden, auf Antigen-präsentierenden Zellen 1-5. Internalisierung von Nanopartikeln (NP) von Antigen-präsentierenden Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Erzeugung einer Immunantwort gegen das verkapselte Antigen. Um, wie sich Änderungen in Nanopartikel-Formulierung auswirken Funktion zu bestimmen, haben wir versucht, einen hohen Durchsatz, quantitative experimentelle Protokoll, das kompatibel mit Erkennung internalisierte Nanopartikel sowie Bakterien war zu entwickeln. Bis heute wurden zwei unabhängige Techniken, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, waren die Methoden benutzt, um die Phagozytose von Nanopartikeln zu untersuchen. Der hohe Durchsatz Natur der Durchflusszytometrie erzeugt robuste statistische Daten. Jedoch aufgrund der niedrigen Auflösung, schlägt es genau zu quantifizieren verinnerlicht gegenüber Zelle gebundenen Nanopartikeln. Mikroskopie erzeugt Bilder mit hoher räumlicher Auflösung; however, es ist zeitaufwendig und birgt kleinen Stichproben 6-8. Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (MIFC) ist eine neue Technologie, die sowohl Aspekte der Mikroskopie und Durchflusszytometrie, die Multi-Color-spektralen Fluoreszenz-und Hellfeld-Bildgebung führt gleichzeitig durch eine Laminar-Kern enthält. Dadurch ist eine genaue Analyse des Fluoreszenzsignals Intensitäten und räumlichen Beziehungen zwischen unterschiedlichen Strukturen und zellulären Eigenschaften bei hoher Geschwindigkeit.
Hier beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung MIFC um die Zellpopulationen, die Polyanhydrid Nanopartikel oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium verinnerlicht haben zu charakterisieren. Wir beschreiben die Herstellung von Nanopartikel-Suspensionen, Zellmarkierung, Erwerb auf einem ImageStream X-System und die Analyse der Daten mit Hilfe des IDEAS-Anwendung. Darüber hinaus zeigt die Anwendung einer Technik, die verwendet werden, um die Internalisierung p unterschieden werden könnenathways für Nanopartikel und Bakterien mit Cytochalasin-D als ein Inhibitor der Aktin-vermittelte Phagozytose.
Protokoll
1. RAW 264.7 Cell Culture
- Ernte RAW 264.7-Zellen aus ihren Flaschen, wenn sie Konfluenz durch Abkratzen sie leicht mit einem Zellschaber erreichen. Anzahl und der Platte diese in eine 24-Loch-Mikrotiterplatte mit einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml komplettem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (cDMEM, 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamax, und 10 mM HEPES) und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einer 5% CO 2 inkubiert.
2. Pathogene Salmonella enterica Serovar Typhimurium 14028 Transformation und Kultur
- Einführung rekombinanter Plasm....
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Diskussion
Studien haben gezeigt, dass biologisch abbaubare Nanopartikel auf Basis von Poly (milchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) oder Polyanhydriden verwendet werden, um eingeschlossene Antigene oder Medikamente Zielzellen abzugeben. Aufnahme dieser Nanopartikel von phagozytischen Zellen auf ihre Wirksamkeit wichtig, damit quantitative . Analyse der Internalisierung kritisch bei der Entwicklung neuartiger Nanopartikel-Delivery-Systeme Mit dieser Methode können differentielle Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedenen Zelltypen mit L.......
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Offenlegungen
Sherree L. Freund wird von Amnis Corporation, die das System produziert ImageStream X beschäftigt.
Danksagungen
Die Autoren möchten die ONR-Muri Award (NN00014-06-1-1176) und das US Army Medical Research und Materiel Command (Grant Numbers W81XWH-09-1 bis 0386 und W81XWH-10-1-0806) für die finanzielle danken zu unterstützen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| RAW 264.7 Zelllinie | American Type Culture Collection (ATCC) | TIB-71 | |
| Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 10 bis 013-CV | |
| Fötales Rinderserum | Atlanta Biologicals | S 11150 | Premium Grade |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 24-Well-Platte | TPP | 92024 | |
| Zellkulturflaschen | TPP | 90151 | |
| Zellschaber | TPP | 99002 | 24 cm |
| Salmonella enterica Serovar Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 Electro Zellmanipulators | BTX Harvard Apparatus | ||
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) | Cellgro | 21 bis 040-CV | |
| Ultraschall-Prozessor flüssig | MisOnix | S-4000 | |
| Cytochalasin-D | Sigma-Aldrich, | C8273 | |
| Formaldehyd | Polysciences | 04018 | |
| Waschpuffer | 2% hitzeinaktiviertem FBS, 0,1% Natriumazid in PBS. | ||
| Perm / Waschpuffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Freisicht-Schnappdeckel Mikroröhrchen | Sigma | T4816 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStream X | Amnis Corporation | 100200 | Optionen: 658nm Laser, Autosampler |
| Natriumazid | Fisher Scientific | S-500 227I |
Referenzen
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jac....
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Nachdrucke und Genehmigungen
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