Biolumineszenz Imaging von NADPH-Oxidase-Aktivität in verschiedenen Tiermodellen

Zusammenfassung

NADPH-Oxidase ist die wichtigste Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Phagozyten. Aufgrund der Kurzlebigkeit von ROS, ist es schwierig zu messen und zu überwachen ROS Ebenen in lebenden Tieren. Ein minimal invasives Verfahren zur seriellen Quantifizierung von ROS in lebenden Mäusen beschrieben.

Zusammenfassung

NADPH-Oxidase ist ein kritischer Enzym, das antibakterielle und antimykotische Wirts vermittelt. Zusätzlich zu seiner Rolle in der antimikrobiellen Abwehrmechanismen hat NADPH-Oxidase kritischen Meldefunktionen, die die Entzündungsreaktion ¹ modulieren. Somit ist die Entwicklung einer Methode, um in "real-time" die Kinetik der NADPH-Oxidase-derived ROS-Generation messen erwartet ein wertvolles Forschungsinstrument Mechanismen relevant Verteidigung, Entzündungen und Verletzungen Gastgeber verstehen.

Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung des NADPH-Oxidase durch schwere Infektionen und übermäßiger Entzündung aus. Aktivierung der Phagozyten NADPH-Oxidase erfordert Translokation seiner cytosolischen Untereinheiten (p47 ^phox, p67 ^phox und p40 ^phox) und Rac an einen membrangebundenen Flavocytochrom (bestehend aus einer gp91 ^phox und p22 ^phox Heterodimer). VerlustFunktionsverlust-Mutationen in einem dieser NADPH-Oxidase Komponenten ergeben CGD. Ähnlich wie bei Patienten mit CGD haben gp91 ^{phox-defizienten} Mäusen und p47 ^{phox-defizienten} Mäusen defekte Phagozyt NADPH-Oxidase-Aktivität und beeinträchtigter Wirtsabwehr ^{13, 14.} Neben Phagozyten, die die NADPH-Oxidase oben beschriebenen Komponenten enthalten, exprimieren eine Vielzahl von anderen Zelltypen unterschiedliche Isoformen von NADPH-Oxidase.

Hier beschreiben wir eine Methode zur ROS-Produktion in lebenden Mäusen zu quantifizieren und den Beitrag der NADPH-Oxidase zu ROS-Generation in den Modellen von Entzündungen und Verletzungen abzugrenzen. Dieses Verfahren basiert auf ROS Umsetzung mit L-012 (ein Analogon von Luminol) zur Lumineszenz, die durch eine Charge-Coupled Device (CCD) aufgezeichnet wird basierend emittieren. In der ursprünglichen Beschreibung der L-012-Sonde wurde L-012-abhängigen Chemolumineszenz vollständig von Superoxiddismutase aufgehoben, was anzeigt, dass der Haupt-ROS in dieser Reaktion nachgewiesen war superOxidanion ^15. Spätere Studien haben gezeigt, dass L-012 können andere freie Radikale, einschließlich reaktiven Stickstoffspezies ^{16, 17} zu detektieren. Kielland et al. ¹⁷ zeigte, dass die topische Anwendung von Phorbolmyristatacetat, ein potenter Aktivator der NADPH-Oxidase, führte zu Oxidase-abhängigen ROS Generation, die in Mäusen unter Verwendung des lumineszierenden Sonde L-012 detektiert werden könnte NADPH. In diesem Modell zeigten sie, dass L-012-abhängigen Lumineszenz in p47 ^{phox-defizienten} Mäusen wurde aufgehoben.

Wir verglichen ROS-Generation in Wildtyp-Mäusen und NADPH-Oxidase-Mangel p47 ^{phox-/ -} Mäusen ² in den folgenden drei Modelle: 1) intratracheale Verabreichung von Zymosan, eine pro-inflammatorische Pilzzellwand abgeleiteten Produkt, das NADPH-Oxidase aktivieren kann, 2) cecal Ligatur und Punktion (CLP), ein Modell des intra-abdominalen Sepsis mit sekundärer akuter Lungenentzündung und Verletzungen, und 3) mündliche Tetrachlorkohlenstoff(CCl _4), ein Modell der ROS-abhängige Leberschädigung. Diese Modelle wurden speziell ausgewählt, um NADPH-Oxidase-abhängigen ROS-Generation im Rahmen der nicht-infektiösen Entzündungen, polymikrobiellen Sepsis und toxininduzierte Organverletzung auszuwerten sind. Vergleicht man Biolumineszenz in Wildtyp-Mäusen p47 ^{phox-/ -} Mäusen ermöglicht es uns, den spezifischen Beitrag von ROS durch p47 ^{phox-haltigen} NADPH-Oxidase der Biolumineszenz-Signal in diesen Modellen generiert abzugrenzen.

Biolumineszenz-Bildgebung Ergebnisse, die eine erhöhte ROS Ebenen in Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu p47 nachgewiesen ^{phox-/ -} Mäusen zeigten, dass NADPH-Oxidase die Hauptquelle der ROS-Generation ist in Reaktion auf entzündliche Reize. Diese Methode bietet eine minimal-invasive Ansatz für "real-time" Überwachung der ROS-Generation während der Entzündung in vivo.

Protokoll

Ein. Tiermodelle

1. Mäuse: Verwenden p47 ^{phox-/ -} Mäusen und Alter und Geschlecht abgestimmt C57BL6/DBA Mäusen. Holen Sie die Genehmigung für die Experimente von Institutional Animal Care und Use Committee.
2. Anästhesie: Verwenden Sie eine kontinuierliche Isofluran Verwaltungssystem der Narkose zu induzieren. Der Verdampfer System (VetEquip) mit Isofluran (2-3%) gefüllt. Bestätigen Sie, dass Mäuse vollständig betäubt durch die Beobachtung der Atmung, Bewegung und Cornealreflex in Reaktion auf äußere Reize sind.
3. Chirurgische Verfahren: Reiben Sie die OP-Bereich (Tischgerät) mit 70% Ethanol. Trage sterile Handschuhe und ein....

Diskussion

"Real-time"-Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in lebenden Tieren kann durch Fluoreszenz-und Chemilumineszenz-Sonden erreicht werden. Während fluoreszierenden Sonden aus mit schwacher Signal-zu-Rausch-Verhältnisse ¹² leiden, ist die beschriebene Aufnahmetechnik empfindlicher für die Detektion der Lichtemission im Anschluss an eine chemische Reaktion mit dem ROS Luminol-basierten Substrat L-012. Wie alle Biolumineszenz Bildgebung, wird diese Methodik durch wellenlängenabhängige Licht durch.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalognummer	Kommentare
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
Tetrachlorkohlenstoff	Sigma, St. Louis, MO	289116