Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Zusammenfassung

Digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie von postkapillären Venolen in der cremasterica Mikrozirkulation ist eine bequeme Methode, um Einblicke in die Leukozyten-Endothel Interaktion zu gewinnen In-vivo- In Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der quergestreiften Muskulatur. Wir bieten hier ein ausführliches Protokoll, um sicher fahren zu können, die Technik und ihre Anwendungen zu diskutieren und Einschränkungen.

Zusammenfassung

Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) wurde in einer großen Reihe von pathologischen Zuständen, wie z. B. Schlaganfall, Herzinfarkt, intestinale Ischämie sowie nach der Transplantation und Herz-Kreislauf-Chirurgie. ¹ Reperfusion des zuvor ischämischen Gewebe in Verbindung gebracht, während die wesentlich für die Vorbeugung irreversibler Gewebeverletzung, entlockt übermäßige Entzündung des betroffenen Gewebes. Angrenzend an die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Aktivierung des Komplementsystems und erhöhte mikrovaskuläre Permeabilität, die Aktivierung von Leukozyten eine der wichtigsten Akteure in der pathologische Kaskade von Gewebeschäden während der Reperfusion ist. ^{2, 3} ist Leukozytenaktivierung ein mehrstufiger Prozess, bestehend Walzen, feste Adhäsion und und wird durch eine komplexe Interaktion zwischen Adhäsionsmolekülen in Reaktion auf Lockstoffe wie Komplement, Chemokine oder der Plättchen-aktivierenden Faktor vermittelt werden. ⁴ <p class = "jove_content"> Während Leukozytenrollen in postkapillären Venolen wird überwiegend durch die Wechselwirkung der Selektine mit ihren ^fünf Zähler Liganden, feste Adhäsion von Leukozyten an das Endothel ist Selectin-gesteuerten über Bindung an intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM) und vaskuläre zellvermittelten Adhäsionsmoleküle (VCAM). ^{6, 7}

Goldstandard für die in vivo-Beobachtung von Leukozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung ist die Technik der Intravitalmikroskopie, erstmals 1968 beschrieben. ⁸

Obwohl verschiedene Modelle von IRI (Ischämie-Reperfusionsschaden) für verschiedene Organe beschrieben worden sind, sind nur wenige ^9-12 geeignet für die direkte Visualisierung der Rekrutierung von Leukozyten in der mikrovaskulären Bett auf einem hohen Niveau der Bildqualität. ⁸

Wir fördern hier die digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie der postkapillären Venole in der Mikrozirkulation cremastericader Ratte ¹³ als eine bequeme Methode, um qualitativ und quantitativ analysieren Leukozytenrekrutierung für IRI-Forschung in der quergestreiften Muskulatur und eine detaillierte Anleitung zur Durchführung des Verfahren. Wir erläutern häufigsten Fallstricke und geben nützliche Tipps, die den Leser in den wirklich zu schätzen, und sicher ausführen sollte die Methode.

In einer Schritt für Schritt zeigen wir Protokoll, wie man mit der Atmung gesteuerten Anästhesie unter ausreichender Kontrolle zu halten, das Tier narkotisiert fest für längere Zeit loszulegen. Anschließend beschreiben wir das cremasterica Vorbereitung als dünne flache Platte für herausragende optische Auflösung und ein Protokoll für die Leukozyten-Bildgebung in der IRI, aber gut in unseren Labors etabliert.

Protokoll

1. Anästhesie und Monitoring

1. Entsprechende nationale und institutionelle Ethik sollten vorhanden sein, bevor Tierversuche. Nach Zustimmung der Ethikkommission Anesthetize männlichen Sprague Dawley Ratten mit einem Körpergewicht von 120 bis 180 g. Liefern Sie 2 bis 3 Vol.% Isofluran zu einer Plexiglas-Box über Isofluran Verdampfer und legen Sie die Ratte im Inneren.
2. Sobald die angemessene Höhe der Anästhesie erreicht wird (fehlende Reaktion bis Fuß oder Schwanz Pinch) der Ratte gewichtet wird rasiert und auf der ventralen zervikalen Bereich.
3. Platzieren Sie die Ratte in Rückenlage auf ein Heizkissen auf Körpertemperatur bei 37 ° C gehalte....

Diskussion

Leukozyten-Endothel-Interaktion, sind die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Aktivierung des Komplementsystems die Hauptmerkmale der IRI-induzierten Gewebe Dysfunktion. ^26. Die Mikrozirkulation des betroffenen Gewebes als integraler Standort für die entzündliche Entstehung betrachtet wird. Abgesehen von Ex-vivo-Experimente wie Flow Assays Kammer ^{27, 28} ist es zwingend notwendig, um gut etablierte Modelle der intravitalen Bildgebung weiter zu der in vivo-Relevanz zu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bezeichnung des Geräts:	Firma:	Artikelnummer:	Kommentare:
Forene 100% (V / V)	Abt	B506	API Isofluran
Terylene Suture	Serag Weissner	OC108000
Portex feinen Bohrung Plastikschläuche	Smiths Medical	800/100/100	0,28 mm Innendurchmesser
0,9% ige Kochsalzlösung	Fresinus Kabi	808771
Change-A-Spitze Deluxe Kit Kauter	Bovie Medical	Del1
Abbocath-T-14G	Venisystems	G713- A01	verwendet als Tubus
Servo Ventilator 900C	Maquet		verwendet als Tier ventialtor
Logische Druckaufnehmer	Smiths Medical	MX1960
Sirecust 404-Monitor	Siemens
ABL 700 Benchtop Analyzer	Radiometer		Blut für Gasmessung
Heizkissen	Effenberger	8319
Alu-Bühne	ALFUN	AW7022
Operationsmikroskop OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
Mikrochirurgische Instrumente Labor set	S & T	767
Biemer Gefäß-Clip	Diener	64,562
Anlegezange	Diener	64,568	Biemer für Gefäß-Clip
Rhodamin 6G	Sigma-Aldrich	R4127
Vaseline weiß DAB	Winthrop	2726853
Deckgläser			32x32 mm
			Intravital Setup
Zeis Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeis	490036	Epifluoreszenzmikroskop
470 nm-LED	Carl Zeis	423052	Fluoreszenz-Lichtquelle
Colibri 2 System	Carl Zeis	423052
W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC	Carl Zeis	421452	Wasserimmersionsobjektiv
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire	Carl Zeis	426509	hoch auflösende Digitalkamera
Axio Vision LE-Software	Carl Zeis	410130	verwenden für die Offline-Analyse