Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in Escherichia Coli Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Alla Gagarinova; Mohan Babu; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4056

Methodenartikel

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in Escherichia Coli Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

DOI:

10.3791/4056

⸱

12. November 2012

Alla Gagarinova^*¹ , Mohan Babu^*²^,³ , Jack Greenblatt¹^,² , Andrew Emili¹^,²

¹Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ²Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, ³Department of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den entwickelten Escherichia coli.

Zusammenfassung

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Phänotypen durch eine komplexe Reihe von physikalischen (zB Protein-Protein) und funktionelle (zB Gen-Gen oder genetisches) Wechselwirkungen (GI) ¹ bestimmt. Während körperliche Interaktionen können angeben, welche bakterielle Proteine als Komplexe verbunden sind, müssen sie nicht unbedingt enthüllen Weg-level funktionalen Beziehungen1. GI Bildschirmen, in denen das Wachstum der Doppelmutanten, die zwei gelöschte oder inaktivierte Gene gemessen und verglichen mit den entsprechenden einzelnen Mutanten, beleuchten kann epistatischen Abhängigkeiten zwischen Loci und somit ein Mittel zum Abfragen und entdecken neuartigen funktionalen Beziehungen ^2. Large-scale GI Karten für eukaryotische Organismen wie Hefe ^3-7 berichtet worden, aber GI Informationen bleiben spärlich für Prokaryoten ^8, die die funktionellen Annotation von bakteriellen Genome behindert. Zu diesem Zweck haben wir und andere Hochdurchsatz-quantitative bakteriellen GI Screeningverfahren ^{9, 10} entwickelten Hier präsentieren wir die wichtigsten Schritte erforderlich, um quantitative E. durchführen coli Genetic Synthetische Array (ESGA) Screening-Verfahren auf einem genomweite ^9, mit natürlichen bakteriellen Konjugation und homologe Rekombination, um systemisch zu erzeugen und zu messen, das die Eignung einer großen Anzahl von Doppel-Mutanten in einer Kolonie Anordnungsformat. Kurz gesagt, wird ein Roboter verwendet, um zu übertragen durch Konjugation, Chloramphenicol (Cm) - F-markierten Rezipientenstämme - Mutante Allele aus engineered Hfr (High Häufigkeit der Rekombination) 'Donorstämme' in eine geordnete Anordnung von Kanamycin (Kan) markiert. Normalerweise verwenden wir loss-of-function einzelnen Mutanten tragen nicht wesentlicher Deletionen (zB die "Keio" Sammlung ¹¹⁾ und essentielles Gen hypomorphen Mutationen (dh Allele verleihen reduzierte Protein Expression, die Stabilität oder Aktivität ^{9, 12, 13)} fragen die funktionalen Zusammenhänge der nicht-essentielle und essentielle Gene, resziehungsweise. Nach Konjugation und anschließenden genetischen Austausch durch homologe Rekombination vermittelten werden die resultierenden Doppelmutanten auf festem Medium, das sowohl Antibiotika ausgewählt ist. Nach Auswachsen werden die Platten digital bebildert und Koloniegrößen quantitativ erzielt unter Verwendung einer in-house automatisierten Bildverarbeitungssystem ^14. GIs enthüllt werden, wenn die Wachstumsrate einer Doppelmutante entweder signifikant besser oder schlechter als erwarteten ⁹ ist. Erschwerende (oder negative) GIs oft zwischen loss-of-function Mutationen in Paaren von Genen aus kompensatorischen Wege, die auf der gleichen grundlegenden Prozess ² auftrifft führen. Hier wird der Verlust eines einzelnen Gens gepuffert, so dass entweder einzelne Mutante lebensfähig ist. Allerdings ist der Verlust der beiden Signalwege schädlichen und resultiert in synthetischen Letalität oder Krankheit (dh langsame Wachstum). Umgekehrt kann Linderung (oder positiven) Wechselwirkungen zwischen Genen in der gleichen Weg oder Proteinkomplexes ² als der auftretenDeletion von entweder Gen allein oft ausreicht, um die normale Funktion des Weges oder komplexer, so dass zusätzliche Störungen nicht verringern Aktivität und damit Wachstum, weiter stören. Insgesamt lassen sich systematisch identifiziert und analysiert GI-Netzwerke bieten unvoreingenommene, globale Karten der funktionalen Zusammenhänge zwischen einer großen Anzahl von Genen, von denen Signalweg-Level-Informationen durch andere Ansätze verpasst ⁹ entnommen werden kann.

Protokoll

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Ein. Konstruieren Hfr Cavalli Donor Mutantenstämme durch Recombineering ^{15, 16}

Die Schritte zum Aufbau der ESGA Donor Flecken werden nachfolgend beschrieben. Kurz gesagt, werden wir gezielt λ - Red vermittelt homologe Rekombination ¹⁶ der verstärkten wählbaren DNA-Marker-Kassette Fragmente durch PCR nicht-essentielle Gen-Deletionsmutanten (Abschnitt 1.1) oder essentielle Gen hypomorphen mutierten Donorstämme (Abschnitt 1.2), die dann als verwendet werden erstellen "Abfragen", um GI-Netzwerken definieren.

Hinweis: Während der technologischen Entwicklung,....

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Ergebnisse

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GIs zeigen funktionelle Beziehungen zwischen Genen. Da Gene im selben Signalweg ähnliche GI-Muster aufweisen und die Ähnlichkeit des GI-Profils die Kongruenz der Phänotypen darstellt, können wir funktionell verwandte Gene in Signalwege gruppieren, indem wir ihre GI-Profile clustern. Die Integration von GI- und GI-Korrelationsnetzwerken mit physikalischen Interaktionsinformationen oder anderen Assoziationsdaten, wie z. B. genomischen Kontextbeziehungen (GC), kann auch die Organisation von Funktionsmodulen höherer Ordnung .......

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Diskussion

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Wir haben eine stufenweise Protokoll für die Verwendung robotischen ESGA Screening, um bakterielles Gen Funktionen auf einen Stoffwechselweg Ebene durch Abfragen GI untersuchen skizziert. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um einzelne Gene als auch ganzer biologischer Systeme in E. studieren coli. Sorgfältig Ausführung der experimentellen oben beschriebenen Schritte, einschließlich aller geeigneten Kontrollen und konsequent analysieren und unabhängig validiert die GI-Daten sind wesentliche Aspekte fü.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Genome Kanada, Ontario Genomics Institute und der Canadian Institutes of Health Research gewährt JG und AE AG unterstützt wird, ist ein Empfänger von Vanier Canada Graduate Scholarship.

....

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Materialien

4. Primer5. PCR- und Elektrophorese-Reagenzien7. Equipment für PCR, Transformation und Replica-Pinning

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
I. Antibiotika
Chloramphenicol	Bioshop	#CLR201
Kanamycin		#KAN201
Ampicillin		# AMP201
2. Luria-Bertani mittel
Pulver	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Bakterienstämme und Plasmide
Hfr Cavalli-Stamm λ _red System (JL238)	Babu et al.¹⁴.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli F- Empfängersammlung	National BioResource Project (NBRP) von Japan¹¹
Hypomorphe E. coli F- SPA-Tag-Stämme	Offene Biosysteme; Babu et al.¹⁴<
pKD3-basierte entsalzte Primer			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'Entsalzte
kundenspezifische			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAAGTAGG-3'Entsalzte
kundenspezifische Primer			F2 und R2: 20 nt konstante Regionen basierend auf der pKD3-Sequenz und 45 nt benutzerdefinierte Homologieregionen F2 konstante Region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 konstante Region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 und S2: 27 nt konstante Regionen zum Priming der Verstärkung der SPA-Cm-Kassette und 45 nt benutzerdefinierte Homologieregionen S1 konstante Region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 konstante Region: 5'- GGCCCCATATGAATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F und KOCO-C: 20 nt Primer 200 bp entfernt von der nicht-essentiellen Gendeletionsstelle oder der essentiellen Gen-SPA-Tag-Einfügestelle<
Taq DNA-Polymerase	Fermentas	# EP0281
10X PCR-Puffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl₂	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Beladung Farbstoff	NEB	#B7021S
Ethidiumbromid	Bioshop	# ETB444
10X TBE Puffer	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Borsäure	Sigma	# T1503-1KG
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# B6768-500G
DNA Leiter	NEB	#N3232L
6. DNA-Isolierung und Clean-up Kits
Genomisches DNA-Isolations- und Aufreinigungskit	Promega	#A1120
Plasmid Midi Kit	Qiagen	# 12143
QIAquick PCR Aufreinigungskit	Qiagen	#28104<
Thermal Cycler	BioRad, iCycler
Agarose Gelelektrophorese	BioRad
Elektroporator	Bio-Rad GenePulser II
0,2 cm Elektroporationsküvette	Bio-Rad
42 ° C Wasserbadschüttler	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 Zentrifuge	Beckman Coschar
32 > C Shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 ° C-Platten-Inkubator	Fisher Scientific
RoToR-HDA Tischroboter	Singer Instruments
Pads	Singer Instruments
96 oder 384 lange Pins	Singer Instruments
8. Imaging Equipments
Kameraständer	Kaiser
Digitalkamera, 10 Megapixel	beliebiger Hersteller
, Testrite 16" x 24" Einheiten	Testrite
9. Pads oder Platten Recycling
10% Bleiche	Jeder Anbieter
70% Ethanol	Jeder Anbieter
Steriles destilliertes Wasser	Jeder Anbieter
Durchflusshaube	Jeder Anbieter
UV-Lampe	Jeder Anbieter
10. Laborbedarf
50 ml Röhrchen aus Polypropylen	Beliebiger Anbieter
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Beliebiger Anbieter
250 ml konische Flocken	VWR	# 29140-045
15 ml sterile Kulturröhrchen	Thermo Scientific	# 366052
Kryofläschchen	VWR	# 479-3221
Rechteckige Platten	Singer Instruments
96-Well- und 384-Well-Mikrotiterplatten	Singer Instruments	Nunc
Plattenwalze zum Versiegeln von Multiwell-Sigma		#R1275-Platten
	ABgene	# AB-0580
Klebeplattendichtungen	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
° C Gefrierschrank	Beliebiger Anbieter

LB td colspan="4"> mit konstanter Konstante Primer td colspan="4">td colspan="4"> 96, 384 und 1.536 Pin Density Leuchtkästen

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).
Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction....

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Synthetic Genetic Array Escherichia Coli Genetic Interaction Screening Colony Array Format Double Mutant Analysis Automated Image Processing Chloramphenicol Selection Kanamycin Selection Homologous Recombination Fitness Quantification

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