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Methodenartikel

Immunhistochemische Färbung von B7-H1 (PD-L1) auf Paraffin-embedded Slides der Pankreaskarzinom Tissue

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DOI:

10.3791/4059

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3. Januar 2013

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1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

B7-H1 (PD-L1) und seine Bindung an PD-1 einen großen tumorinduzierte immunsuppressiven Signal in Mikroumgebung des Tumors. Eine immunhistochemische Färbetechnik, die Expression und Lokalisation von B7-H1 in Pankreaskarzinom zu charakterisieren ist hier beschrieben.

Zusammenfassung

B7-H1/PD-L1, ein Mitglied der B7-Familie von immunregulatorische Zelloberflächenproteinen, spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulation von zellvermittelten Immunantworten durch seine Wechselwirkung mit seinem Rezeptor, programmierten Zelltod-1 (PD -1) 1,2. Überexpression von B7-H1 durch Tumorzellen wurde in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Melanom, Glioblastom und Karzinomen der Lunge, Brust, Dickdarm, Eierstock und Nierenzellen bemerkt worden, und wurde gezeigt, dass anti-Tumor-T beeinträchtigen Zell-Immunität 3-8.

Vor kurzem hat B7-H1 Expression von Pankreaskarzinom Geweben als potentieller prognostischer Marker 9,10 identifiziert worden. Zusätzlich hat Blockade von B7-H1 in einem Mausmodell von Bauchspeicheldrüsenkrebs gezeigt worden, um eine Anti-Tumor-Antwort 11 zu erzeugen. Diese Daten legen nahe, wie wichtig B7-H1 als ein potenzielles therapeutisches Ziel. Anti-B7-H1-Blockade Antikörper sind daher in klinischen Studien für die mul geprüfttiple humanen soliden Tumoren wie Melanomen und Karzinomen der Lunge, Dickdarm, Niere, Magen und Bauchspeicheldrüse 12.

Um schließlich in der Lage sein, um die Patienten, die von B7-H1 Targeting-Therapien profitieren zu identifizieren, ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen Expression und Lokalisation von B7-H1 und Ansprechen des Patienten auf die Behandlung mit B7-H1-Blockade Antikörper zu untersuchen. Untersuchen der Expression von B7-H1 in menschlichen Pankreaskarzinom Gewebe durch Immunhistochemie wird ein besseres Verständnis, wie diese mit-inhibitorische Signalmolekül trägt zur Unterdrückung der Antitumor-Immunität in Mikroumgebung des Tumors. Die Anti-B7-H1-Antikörper (Klon 5H1) von Chen und Mitarbeitern entwickelt wurde gezeigt, zuverlässig Färbeergebnisse in Kryoschnitten mehrerer Arten von menschlichen neoplastischen Geweben 4,8 zu produzieren, aber auf Anfärben Paraffin eingebetteten Folien war eine Herausforderung, bis kürzlich 13-18. Wir haben developed die B7-H1 Färbeprotokoll für Paraffin eingebettete Folien Pankreaskarzinom Gewebe. Die B7-H1 Färbeprotokoll hier beschriebenen konsistente membranöse und zytoplasmatische Färbung von B7-H1 mit wenig Hintergrund.

Protokoll

B7-H1/PD-L1, ein Mitglied der B7-Familie von immunregulatorische Zelloberflächenproteinen, spielt eine wichtige Rolle bei der negativen Regulation von zellvermittelten Immunantworten durch seine Wechselwirkung mit seinem Rezeptor, programmierten Zelltod-1 (PD -1) 1,2. Überexpression von B7-H1 durch Tumorzellen wurde in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Melanom, Glioblastom und Karzinomen der Lunge, Brust, Dickdarm, Eierstock und Nierenzellen bemerkt worden, und wurde gezeigt, dass anti-Tumor-T beeinträchtigen Zell-Immunität 3-8.

Vor kurzem hat B7-H1 Expression von Pankreaskarzinom Geweben als potentieller prognostischer Marker 9,10 identifiziert worden. Zusätzlich hat Blockade von B7-H1 in einem Mausmodell von Bauchspeicheldrüsenkrebs gezeigt worden, um eine Anti-Tumor-Antwort 11 zu erzeugen. Diese Daten legen nahe, wie wichtig B7-H1 als ein potenzielles therapeutisches Ziel. Anti-B7-H1-Blockade Antikörper sind daher in klinischen Studien für mehrere Menschen getestetsolider Tumoren wie Melanomen und Karzinomen der Lunge, Dickdarm, Niere, Magen und Bauchspeicheldrüse 12.

Um schließlich in der Lage sein, um die Patienten, die von B7-H1 Targeting-Therapien profitieren zu identifizieren, ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen Expression und Lokalisation von B7-H1 und Ansprechen des Patienten auf die Behandlung mit B7-H1-Blockade Antikörper zu untersuchen. Untersuchen der Expression von B7-H1 in menschlichen Pankreaskarzinom Gewebe durch Immunhistochemie wird ein besseres Verständnis, wie diese mit-inhibitorische Signalmolekül trägt zur Unterdrückung der Antitumor-Immunität in Mikroumgebung des Tumors. Die Anti-B7-H1-Antikörper (Klon 5H1) von Chen und Mitarbeitern entwickelt wurde gezeigt, zuverlässig Färbeergebnisse in Kryoschnitten mehrerer Arten von menschlichen neoplastischen Geweben 4,8 zu produzieren, aber auf Anfärben Paraffin eingebetteten Folien war eine Herausforderung, bis kürzlich 13-18. Wir haben die B7-H1 staini entwickeltng Protokoll für Paraffin eingebettete Folien Pankreaskarzinom Gewebe. Die B7-H1 Färbeprotokoll hier beschriebenen konsistente membranöse und zytoplasmatische Färbung von B7-H1 mit wenig Hintergrund.

Ein. De-parafinization

  1. Bake gleitet bei 55 ° C für 20 min.
  2. In einer chemischen Haube, Folien tauchen in Xylol für 10 min.
  3. Objektträger in frischem Xylol für 10 min.
  4. Objektträger in 100% Ethanol für 5 min.
  5. Objektträger in frisch 100% Ethanol für 5 min.
  6. Objektträger in 95% Ethanol für 5 min.
  7. Objektträger in 80% Ethanol für 5 min.
  8. Objektträger in entionisiertem Wasser für 5 min.

2. Antigen Retrieval

  1. Objektträger in Tris-EDTA-Puffer (pH 9,0) und Wärme in einem Dampfkochtopf bis 125 ° C für 30 sec, dann 90 ° C für 10 sek.
  2. Lassen Dias cool für 60 min.
  3. Objektträger in TBST für 5 min; repebei zweimal.

3. Färbung

  1. Wischen Sie Lösungen rund um das Gewebe auf den Folien. Markieren Sie einen Kreis um das Gewebe mit einer hydrophoben Stift.
  2. Objektträger in einer feuchten Kammer und vermeiden das Trocknen des Gewebes auf der Folie über den gesamten Färbeprozesses. Einen Tropfen (etwa 200 ul oder mehr, um das Gewebe vollständig zu bedecken Bereich) von Peroxidase Block innerhalb des hydrophoben Kreis auf der Rutsche und inkubieren in Peroxidase Block für 5 min.
  3. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min.
  4. Geben Sie einen Tropfen BLOCK ACE Blocking-Puffer auf jeder Folie und Inkubation für 15 min.
  5. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min.
  6. Geben Sie einen Tropfen Avidin-Lösung auf jeder Folie und Inkubation für 15 min.
  7. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min.
  8. Geben Sie einen Tropfen Biotin-Lösung auf jeder Folie und Inkubation für 15 min.
  9. Spülen slides mit TBST, dann in TBST für 5 min.
  10. Die Objektträger mit 1:1000 Verdünnung von Maus-Anti-B7-H1-Antikörper (Klon 5H1) oder einer Maus IgG1 κ Isotypenkontrolle in 200 ul TBST bei 4 ° C über Nacht für 22 h + / - 1 h. Die endgültige Antikörperkonzentration in TBST ist 2,57 ug / ml.
  11. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen.
  12. Die Objektträger mit einem Biotin konjugiertes Ratte-anti-Maus-IgG1-Antikörper in einer sekundären 1:500 Konzentration (in 200 ul 2% Ziegenserum-Lösung) für 30 min.
  13. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen.
  14. Geben Sie einen Tropfen Streptavidin-Biotin-Komplex auf jeder Folie und Inkubation für 15 min (muss mindestens 30 min vor Gebrauch vorbereitet werden).
  15. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen.
  16. Geben Sie einen Tropfen Amplifikationsreagenz (verdünnt 2:1 mit TBST) auf jeder Folie und Inkubation für 4 min.
  17. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen.
  18. Geben Sie einen Tropfen Streptavidin-HRP auf jeder Folie und Inkubation für 15 min.
  19. Die Objektträger mit TBST, dann in TBST für 5 min. Zweimal wiederholen.
  20. Setzen Sie einen Tropfen 3,3-Diaminobenzidin (DAB)-Substrat und Chromogen auf jeder Folie entwickeln und die Farbe für 2 min.
  21. Unmittelbar nach der Farbentwicklung, waschen Folien mit ddH 2 O für 1-2 min.
  22. Die Objektträger mit einem Tropfen Hämatoxylin für 90 sec.
  23. Waschen mit ddH 2 O für 1-2 min.
  24. Waschen mit Seifenwasser Leitungswasser für 1-2 min.
  25. Waschen mit ddH 2 O für 1-2 min.

4. Dehydration und Montage

  1. Eintauchen der Objektträger in 80% Ethanol für 3 min.
  2. Tauchen Sie die Folien in 95% Ethanol für 3 min.
  3. Eintauchen der Objektträger in 100% Ethanol für 5 min. Wiederholen.
  4. Eintauchen der Objektträger in Xylol für 5 min. Wiederholen.
  5. Einen TropfenCytoseal 60 auf den Schlitten und Ort das Deckglas.

Tabelle 1 listet die Reagenzien in den oben beschriebenen Verfahren verwendet.

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Ergebnisse

Eine erfolgreiche immunhistochemische Färbung von B7-H1 demonstrieren die heterogene Expression von B7-H1 (braun Signale DAB Farbentwicklung) in Pankreaskarzinom. Einige Pankreaskarzinom-Zellen haben überwiegend membranöse Expression von B7-H1 (Abbildung 1A), während andere entweder vorwiegend zytoplasmatische Expression von B7-H1 oder wenig Expression von B7-H1 (Abbildungen 2 und 3). Normale Pankreasgangepithel drückt etwas B7-H1 (Abbildung 4). Anfärbung mit einem Maus...

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Diskussion

Immunhistochemische Färbung von B7-H1 auf Kryoschnitten In früheren Studien wurde für eine Vielzahl von Krebsarten 3,4 gemeldet. Jedoch klinischen Tumorproben üblicherweise nur in Form von in Paraffin eingebetteten Blöcke verfügbar. Die monoklonalen Antikörper 5H1 hat neuerdings erfolgreich an die Färbung von Paraffin eingebettet Tumorgeweben einschließlich Nierenzellkarzinom, Gebärmutterhalskrebs, Blasenkrebs und Melanom 13-18 angewandt. B7-H1 Färbung auf Paraffin eingebettete, 9,19 ode...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

EB, KMB und HX tragen gleichermaßen. Diese Studie wurde von der NCI SPORE in Gastrointestinal Cancers P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant, Sol Goldman Pancreatic Cancer Center und National Pancreas Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
CSA-System Dako K1500 Enthält die folgenden Reagenzien in dem Protokoll genannt: Peroxidase Block, Streptavidin-Biotin-Komplex, Amplifikationsreagens, Streptavidin-HRP und DAB Substrat und Chromogen
Avidin / Biotin Blocking Kit Vektor SP-2001
Block ACE Serotec BUF029
Biotin Anti-Maus-IgG1 BD 553441
Mouse IgG1 K Isotypkontrolle eBioscience 14-4714-85
TBS (Tris-gepufferte Salzlösung), 10X Cellgro 46-012-CM 10xTBS enthält 80 g / l NaCl und 24,2 g / L Tirs;
Verdünnt 1X mit ddH2O für Waschmittel;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 1 ml zugesetzt, um 1 l 1X TBS zu machen TBST
Target Retrieval, 20x Celerus Welle 014-3000-000 Verdünnt auf 1x mit ddH 2 O
190 Proof Ethylalkohol Pharmco-Aaper 111000190
200 Proof Ethylalkohol Pharmo-Aaper 111000200
Xylol VWR 95057-827
Hematoxylin Richard-Allan Scientific 72804
Cytoseal 60 Richard-Allan Scientific 8310-4
Deckgläser Corning 2940-245
Feuchte Kammer Sigma H6644
Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung.

Referenzen

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