Methodenartikel

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

DOI:

10.3791/4209

⸱

27. Januar 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Anesthesiology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

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Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.

Zusammenfassung

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Bestimmte Mitglieder der Einwärtsgleichrichter Kalium (Kir) Kanal Familie drug targets für eine Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich Bluthochdruck, Vorhofflimmern und Schmerzen 1,2 postuliert. Zum größten Teil jedoch Fortschritte zum Verständnis ihres therapeutischen Potenzials oder sogar grundlegenden physiologischen Funktionen durch den Mangel an guten pharmakologischen Werkzeugen verlangsamt. In der Tat hat die molekulare Pharmakologie des Einwärtsgleichrichter Familie weit hinter der des S4 Superfamilie der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle (Kv)-Kanäle, für die eine Reihe von nanomolaren-Affinität und hochselektive Peptidtoxin Modulatoren 3 entdeckt haben zurückgeblieben. Die Bienengift Toxin tertiapin und seine Derivate sind potente Inhibitoren von Kir1.1 und Kir3 Kanäle 4,5, aber Peptide sind nur von begrenztem Nutzen therapeutisch als auch experimentell aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften und schlechte Bioverfügbarkeit, metabolische Stabilität und Gewebe Penetranz. Die Entwicklung potenterund selektive niedermolekulare Sonden mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften werden ein Schlüsselfaktor für ein volles Verständnis der Physiologie und therapeutische Potenzial von Kir-Kanälen sein.

Das Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) durch die National Institutes of Health (NIH) Common Fund hat Möglichkeiten geschaffen für akademische Wissenschaftler Sonde Entdeckung Kampagnen für molekulare Targets und Signalwege in der Notwendigkeit einer besseren pharmakologischen 6 einzuleiten. Die MLPCN bietet Forschern den Zugang zu Industrie-scale Screening-Zentren und die medizinische Chemie und Informatik zu unterstützen niedermolekularen Sonden, um die Funktion von Genen und Gen-Netzwerke aufzuklären entwickeln. Der entscheidende Schritt in der Zulassung zu dem MLPCN ist die Entwicklung eines robusten Target-oder Pathway-spezifischen Assay, zugänglich für High-Throughput-Screening (HTS) ist.

Hier beschreiben wir, wie man eine Fluoreszenz-basierten Thallium (Tl +) flux assa entwickelny von Kir Kanalfunktion für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung 7,8,9,10. Der Assay basiert auf der Durchlässigkeit des K +-Kanals Pore der K + Kongener Tl + basiert. Eine handelsübliche Leuchtstofflampen Tl + Reporter-Farbstoff wird verwendet, um transmembrane Fluss der Tl + durch die Pore zu erkennen. Es gibt mindestens drei kommerziell erhältliche Farbstoffe, die sich für Tl + Flux Assays sind: BTC, FluoZin-2 und 7,8 Fluxor. Dieses Protokoll beschreibt Assay-Entwicklung mit FluoZin-2. Obwohl ursprünglich entwickelt und vermarktet als Zink-Indikator, Ausstellungen FluoZin-2 eine robuste und dosisabhängige Erhöhung der Fluoreszenzemission auf Tl + Bindung. Wir begann mit FluoZin-2 vor Fluxor verfügbar war 7,8 und haben weiterhin so 9,10 zu tun. Jedoch sind die Schritte in Assay-Entwicklung im wesentlichen identisch für alle drei Farbstoffe, und Benutzer sollten bestimmen, welche am besten geeigneten Farbstoff ist für ihre spezifische nEEDS. Wir diskutieren auch die Assays Performance-Benchmarks, die erreicht, um für die Einreise in die MLPCN in Betracht gezogen werden muss. Da Tl + gut durchzieht die meisten K +-Kanäle, sollte der Test sein, anpassbar an die meisten K +-Kanal Ziele.

Protokoll

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Ein. Erzeugung von stabilen polyklonalen Zelllinien

  1. Die Errichtung eines hochwertigen stabile Zelllinie die Kir Kanal von Interesse ist ein wichtiger erster Schritt in Richtung Entwicklung eines robusten High-Throughput-Screening-Test. Konstituierende K +-Kanal Überexpression kann zu einer Aktivierung des Zelltodes Wege, stabile Zelllinie Degeneration und Verlust der Assay-Leistung führen. Um diese potentiellen Probleme zu vermeiden und ein bequemer interne Kontrolle für die Assay-Entwicklung (siehe unten), wird ein Tetracyclin-induzierbare Expressionssystem 8 empfohlen.
  2. Kultur die elterliche T-Rex-HEK293-Zellen unter Verwen....

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Ergebnisse

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Die Verwendung eines Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystem bietet eine bequeme interne Kontrolle für die Unterscheidung Tl + Fluß durch endogene Wege und der Kir interessierenden Kanal. Abbildung 1 zeigt einige Beispiele von Zell Plattieren Karten in verschiedenen Arten von Experimenten verwendet. Die Positionen der Vertiefungen mit induzierten oder Tetracyclin-induzierten Zellen werden mit unterschiedlichen Farben dargestellt. Abbildung 2A zeigt die Source-Platte Karte.......

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Diskussion

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Datenverarbeitung: Sobald die Daten gesammelt werden, ein gemeinsamer Schritt in der Analyse beinhaltet Normalisierung jedes Brunnens Fluoreszenz-Antwort, F, auf den Ausgangswert zu Beginn des Experiments, F 0. Dies wird allgemein als der "statische Verhältnis" bezeichnet und symbolisiert "F / F 0". In Fällen, in denen F 0 von der Indikatorfarbstoff dominiert wird die statische Verhältnis Operation wird im wesentlichen für viele Faktoren wi.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus National Institutes of Health Zuschüsse 1R21NS073097-01 und 1R01DK082884 (JSD) und der Stiftung für den National Institutes Gewährung PIER11VCTR unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalognummer Kommentare
pcDNA5/TO Invitrogen V1033-20 Tetracyclin-induzierbarer Expressionsvektor
T-Rex-HEK293-Zellen Invitrogen R71007 Tetracyclin-induzierbaren Zelllinie
Lipofectamine LTX / Plus Reagent Invitrogen 15338100 Transfektionsreagenz
FBS ATLANTA Biologicals S11550 Zellkulturmedien
DMEM Invitrogen 11965 Zellkulturmedien
Hygromycin B Invitrogen 10687-010 Zellkulturmedien
Blasticidin S Invitrogen R210-01 Zellkulturmedien
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140 Zellkulturmedien
HBSS-zweiwertigen kostenlos Mediatech 21022CV Waschen der Zellen
Trypsin-0,25% Mediatech 25053CI Zelldissoziationslösung
Tetracyclin-HCl Sigma T9823 Induction Reagenz
Dialysiertes FBS ATLANTA Biologicals S12650 Plattierungsmedien
FluoZin-2 Invitrogen F24189 Fluoreszenzfarbstoff
Pluronic F-127 Invitrogen P-3000MP Dye Belastung
HBSS Invitrogen 14175 Assay-Puffer
HEPES Invitrogen 15630 Assay-Puffer
NaHCO 3 Sigma S6297 Tl + Stimulus-Puffer
MgSO 4 Sigma M2643 Tl + Stimulus-Puffer
CaSO 4 • 2H 2 O Sigma C3771 Tl + Stimulus-Puffer
D-Glucose Sigma G7528 Tl + Stimulus-Puffer
Thalliumsulfat Aldrich 204625 Tl + Stimulus-Puffer
HEPES Sigma H4034 Tl + Stimulus-Puffer
DMSO Sigma D4540 Lösungsmittel
Acht-Kanal elektronische Pipette Biohit E300 Zelle plating in 384 -Well-Platten
BD PureCoat Amin-beschichtete 384-Well-Platten BD Biosciences 356719 Assay Mikrotiterplatten
Echo qualifiziert 384-Well Polypropylen Microplatte (384PP) Labcyte P-05.525 Compound Quelle Mikrotiterplatten
384-well Mikroplatten Polypropylen Greiner Bio-One 781280
Multidrop Combi Reagenzspender Thermo Scientific 5840300
ELx405 Mikroplatten-Washer BioTek ELx405HT Automationszelle Waschen
Echo Liquid Handler Labcyte Labcyte Echo 550
Bravo automatisierten Liquid-Handling-Plattform Agilent Technologies Standard-Modell
Hamamatsu FDSS 6000 Hamamatsu Kinetic Imaging Plate Reader

Tabelle 1. Liste der Materialien und Reagenzien.

Referenzen

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  1. Ehrlich, J. R. Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy. J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).
  2. Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. Small-molecule modulato....

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels
Posted by JoVE Editors on 10/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels. The Protocol section has been updated.

The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |

to:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

Schlagwörter

Thallium Flux AssayFluoreszierender Tl ReporterfarbstoffFluoZin 2Tetracyclin induzierbare Zellen384 Well PlatteZ Prime BerechnungFluoreszenz Plattenleseger t

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