Summary
Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk toegankelijke
Abstract
De ziekte van Parkinson (PD) is de tweede meest voorkomende bewegingsstoornis en komt voor bij 1% van de mensen boven de leeftijd van 60 1. Omdat de vergrijzing is de belangrijkste risicofactor, zullen gevallen van PD te verhogen tijdens de komende decennia 2. Naast pathologische vouwing van eiwitten en een verminderde afbraak van eiwitten paden, werden veranderingen van mitochondriale functie en morfologie gewezen als verdere kenmerk van neurodegeneratie bij PD 3-11.
Na jaren van onderzoek in muizen en menselijke kankercellen in vitro modellen voor moleculaire wegen van Parkinson ontleden, is het gebruik van humane fibroblasten van patiënten en geschikte controles ex vivo modellen een waardevol hulpmiddel voor onderzoek als mogelijke restricties worden beschouwd. Anders dan vereeuwigd, in plaats van kunstmatige cel modellen, primaire fibroblasten van patiënten die ziekte-geassocieerde mutaties blijkbaar weerspiegelen belangrijke pathologische kenmerken of de menselijke ziekte.
Hier hebben we af te bakenen van de procedure van het nemen van de huid biopten, kweken menselijke fibroblasten en met behulp van gedetailleerde protocollen voor essentiële microscopische technieken om mitochondriale fenotypes te definiëren. Deze werden gebruikt om verschillende functies die samenhangen met PD die relevant zijn voor mitochondriale functie en dynamiek onderzoeken. Ex vivo kan mitochondria worden geanalyseerd op hun functie, morfologie, colokalisatie met lysosomen (organellen de afbrekende disfunctionele mitochondria) en afbraak via de lysosomale pathway . Deze fenotypes zijn zeer relevant voor de identificatie van vroege tekenen van PD en kan voorafgaan aan de klinische motorische symptomen bij de mens de ziekte-gen dragers. Derhalve kan de hier gepresenteerde assays worden gebruikt als waardevolle tools pathologische kenmerken van neurodegeneratie te identificeren en nieuwe therapeutische strategieën definiëren PD helpen.
Protocol
1. Huidbiopsie en kweek van humane fibroblasten
- De huid biopsie moet worden genomen door een ervaren arts. De procedure vindt plaats onder steriele omstandigheden en vereist plaatselijke verdoving. Typische gebieden voor biopsie zijn de binnenzijde van de bovenarm, schouder of onderrug.
- U kunt 4x4mm of 6x6mm diameter analysemonster berekenen door punch biopsie om genoeg weefsel te krijgen voor het kweken van menselijke fibroblasten.
- Snijd de huid in gelijke kleine stukjes biopsie onder steriele omstandigheden om ze te scheiden in 2-4 T25 flessen. Elke fles moet bevatten 2-3 stukken epidermis. Het kweekmedium bevat 15% FCS, 1,1% natrium pyruvaat en 1% penicilline / streptomycine in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2. De verwachte voortplantingstijd tot de eerste fibroblasten groeien uit de epidermale monster is 1-2 weken. Als de groei er problemen worden aangetroffen, kunt u gebruik maken van fibroblast groei factor (5-10 ng / ml FGF2) de groei van cellen te versterken.
- Zodra een cel confluentie van 50-70% is bereikt, kan de primaire humane fibroblasten worden bevroren. De tijd tot 50-70% confluentie bereikt, verschilt tussen cellijnen. Bevriezen fibroblasten in 90% FCS plus 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
2. Voorbereiding van menselijke fibroblasten voor live cell imaging microscopie
In het algemeen moeten experimenten met humane fibroblasten worden uitgevoerd met minder dan 10 passages als senescence geassocieerde veranderingen kunnen eigenschappen van cellen na meerdere passages. In geval van twijfel kunnen beta-galactosidase assays worden gebruikt voor de inductie van verouderingsprocessen beoordelen in de respectieve cellen. Over het algemeen geen gebruik maken van oude fibroblasten (zie hierboven). Bovendien, om verschillende cellijnen te vergelijken, werken met dezelfde passage nummer van elke cellijn. Vergelijking van verschillende genetisch homogene patiënten in vergelijking met gezonde controles wordt aanbevolen. Aangezien somspatiënten die specifieke mutaties zeldzaam, kan dit betekenen dat huidbiopten van slechts een patiënt met een bepaald passage nummer en verschillende stuurleidingen moeten worden opgenomen - hier is het essentieel om hetzelfde aantal passage alle lijnen inbegrepen. Als een cel confluentie van 50-70% is bereikt, maar geen experiment gepland, fibroblasten worden bevroren.
- Op de eerste dag van het experiment was na de bijgevoegde fibroblasten met PBS. Laat deze los uit de kolf bodem door het gebruik van een cel detachement oplossing van proteolytische enzymen DNase (dwz AccuMax).
- Tel je cellen en zaad 50,000-70,000 cellen in elke well van een 4-kamer coverglass (1,8 cm2 cultuur gebied per well). Bijgevolg zijn voor de 8-kamer coverglas helft van het aantal cellen of iets minder geschikt (0,8 cm2 cultuur gebied per well). Het is belangrijk om zaad eerder een klein aantal cellen real eencellige analyse. Geen specifieke coating voor de kamers is nodig.
- Na 24-48 uur, kan de live-cell imaging experiment worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat de live-cell imaging microscoop is uitgerust met een incubator die temperatuur en CO 2-niveaus controleert. Tijdens beeldacquisitie, een atmosfeer van 37 ° C en 5% CO2 te handhaven.
- Elke beeldvorming van levende cellen metingen worden uitgevoerd in ten minste drie onafhankelijke experimenten. In totaal moet een minimum van 50 cellen per cellijn worden afgebeeld. De live cell imaging experimenten en de off-line analyses moeten worden uitgevoerd onder verblind voorwaarden onpartijdige gegevens verzamelen garanderen.
3. Meting van Mitochondriale functie in levende menselijke fibroblasten
Voor conventionele meting van mitochondriale functie via mitochondriale membraanpotentiaal (MMP)-afhankelijke kleurstoffen, fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS) is het belangrijkste middel. In het geval van menselijke fibroblasten, cellulaire autofluorescence wordt vaak waargenomen en kunnen valse positieve resultaten veroorzaakt door verstoring van het werkelijke signaal kleuring. Autofluorescentie wordt gewoonlijk groter met hogere aantallen passage fibroblasten. Daarom geven wij de voorkeur aan mitochondriale functie van de menselijke fibroblasten te beoordelen door live cell imaging microscopie.
- 24-48 uur na het zaaien, incubeer de fibroblasten in 50 nM van de MMP-afhankelijke kleurstof tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) in RPMI medium. Deze RPMI medium moet missen fenolrood, want dit kan een negatieve invloed hebben beeldkwaliteit. 1,6 uM van Hoechst kleuring moet worden toegevoegd aan kernen visualiseren.
- Incubeer cellen bereide kleuroplossing beschermd tegen licht gedurende 15 min bij 37 ° C en 5% CO2.
- Vervang de kleuroplossing met RPMI medium (zonder fenolrood). Gaan zonder een wasstap en direct beeld cellen. Gebruik 63x vergroting en confocale laser scanning microscopie techniek (als alternatief met behulp van fluorescentie microscopieApotome techniek) om enkele lagen van cellen definiëren. Toepassing 37 ° C en 5% CO 2 cellen tijdens beeldvormingsproces.
- Wanneer beeldvorming van de fibroblasten, maximale aandacht te besteden aan de toegepaste belichtingstijd van TL-licht als TMRE vlekken kan bleekwater snel. Definieer uw juiste belichtingstijd tussen de 200 en 300 ms en niet hoger zijn dan dit interval. Het beeld acquisitie onder gestandaardiseerde instellingen is van groot belang, zoals men zou niet in staat om vergelijkingen te maken op basis van de intensiteit als de instellingen verschillend tussen cellijnen.
- Als een bepaalde straal rond de belichte cellen wordt gebleekt na blootstelling aan licht, hou de volgende gezichtsveld voldoende ver van de photobleached sectie.
- Off-line analyses zijn uitgevoerd met behulp van ImageJ Software (Wayne Rasband; National Institutes of Health, USA).
- Selecteer je mobiele van belang door middel van een selectie-instrument.
- Converteert een opname naar 8-bit (Afbeelding <Type <8-bits).
- Verminder niet-specifieke geluid by met behulp van de "Ontvlekken"-functie (Proces <Noise <Ontvlekken).
- Kies de "Lookup Tables - Fire" staat (Afbeelding <opzoektabellen <Fire).
- Schakelaar in de drempel functie aan de "boven / onder" functie en stel drempel (Afbeelding <Adjust <Threshold).
- Selecteer de "analyse van deeltjes" optie, die geeft je de gemiddelde grijswaarde van elk mitochondriale deeltje detecteerbaar (Analyze <Analyseer Particles). Sla de gegeven lijst met resultaten als een Excel-spreadsheet.
- Open resultatenbestand in Excel programma en bereken het gemiddelde van de gemiddelde grijswaarde van het mitochondriale structuren (aangeduid als "gemiddelde" in de gegeven excel Suchergebnisliste).
- Om een oppervlakteplot maken, kiest u de plug-in "Interactieve 3D-oppervlak plot" in de "3D" plugin sectie. Hier kunt u meer wijzigingen voor een perceel met behulp van verschillende weergave-opties. Het veranderen van de "Original Colors" aan "Spectrum LUT" geeft de intensiteit schaalbalk voor de juiste plot.
- Alternatiefhet gebruik TMRE de analyse van de mitochondriale functie van humane fibroblasten via beeldvorming van levende cellen, een combinatie van de MMP-onafhankelijke kleurstof Mitotracker Green FM en MMP-afhankelijke kleurstof Mitotracker CM-H 2 XRos worden gebruikt. Nogmaals, voor humane fibroblasten levende cellen imaging microscopy de voorkeur, maar in het algemeen alternatief is ook gebruikt met FACS analyse in andere soorten cellen 12. Bij gebruik van deze alternatieve benadering van de mitochondriale functie in menselijke fibroblasten, stap 3-7 van het protocol hoofdstuk 5 te meten "Meten van mitochondrio-lysosomale colokalisatie in levende menselijke fibroblasten" moet worden toegepast. Daarmee wordt de overlay van signalen, zowel mitochondria positief voor Mitotracker Green FM en Mitotracker CM-H 2 XRos berekend en geeft de hoeveelheid functionele mitochondria als ratio voor alle mitochondria aanwezig.
4. Meting van Mitochondriale Morfologie in Living menselijke fibroblasten
- 24 tot 48hr na het zaaien, incubeer cellen in 200 nM Mitotracker Green FM in RPMI medium (zonder fenolrood) beschermd tegen licht gedurende 15 min bij 37 ° C en 5% CO2. 1,6 uM van Hoechst kleuring moet worden gebruikt om kernen te markeren. Mitotracker Green FM is een MMP-onafhankelijke kleurstof, die allemaal vlekken mitochondriale structuren te presenteren.
- Voorzichtig een keer wassen van de cellen met PBS.
- Voeg vers RPMI medium (zonder fenol rood) naar de cellen en onmiddellijk beeld cellen. Gebruik 63x vergroting en confocale laser scanning microscopie techniek (als alternatief met behulp van fluorescentie microscopie Apotome techniek) om enkele lagen van cellen definiëren.
- Off-line analyses worden genomen door het gebruik van ImageJ Software.
- Selecteer je mobiele van belang door middel van een selectie-instrument.
- Converteert een opname naar 8-bit (Afbeelding <Type <8-bits).
- Verminder niet-specifieke geluid met behulp van de "Ontvlekken"-functie (Proces <Noise <Ontvlekken).
- Gebruik de convolutie filter mitochon markerendrial structuren (Proces <Filters <convolve).
- Stel de drempel zodat de signaal-ruisverhouding wenselijk is (Image <aanpassen <Threshold).
- Door gebruik te maken van de "analyse van deeltjes" optie, wordt de automatische identificatie van mitochondriale structuren gestart op basis van een gekozen pixelgrootte (Analyze <Analyseer Particles). Verschillende mitochondriale parameters worden vervolgens berekend, zoals oppervlakte, omtrek, kleine en grote assen of circulariteit. Deze metingen kunnen individueel worden ingesteld (Analyze <Set Afmetingen). Sla de gegeven lijst met resultaten als een Excel-spreadsheet.
- Open resultaat bestand in Excel programma. Met gebruik van deze parameters kunnen analyses van mitochondriale morfologie worden uitgevoerd. Dit omvat de definitie van de vorm factor die de mate van vertakking van een mitochondriaal netwerk [formule: (perimeter 2) / (4 * PI () * gebied)] en de verhouding waarin de lengte van mitochondria (formule belangrijke assen / minor assen).
5. Meting van Mitochondrio-lysosomale colokalisatie in Living menselijke fibroblasten
- 24-48 uur na het uitzaaien, incubeer cellen in 200 nM Mitotracker Green FM en 100 nM Lyostracker Red DND-99 in RPMI medium (zonder fenolrood) beschermd tegen licht gedurende 15 min bij 37 ° C en 5% CO2. 1,6 uM van Hoechst kleuring wordt gebruikt om kernen te markeren.
- Vervang het medium met verse RMPI medium (zonder fenol rood) met 100 nM Lyostracker Red DND-99. Deze kleurstof aanwezig gedurende de gehele opnamesessie. Niet wassen van de cellen na incubatie periode. Onmiddellijk het imago van de cellen. Gebruik 63x vergroting en confocale techniek (alternatief Apotome techniek) om enkele lagen van cellen definiëren.
- Off-line analyses worden genomen door het gebruik van ImageJ Software.
- Open de twee respectieve afbeeldingen die u wilt analyseren in termen van colokalisatie status.
- Converteert een opname naar 8-bit (Afbeelding <Type <8-bits). Verminder niet-specifieke geluid met behulp van de "Ontvlekken" functie in beide beelden (Proces <Noise <Ontvlekken).
- Kies de plugin "Jacop" als colokalisatie analysetool, die geeft u waarden voor de respectieve kanalen en berekent de Pearson's coëfficiënt, overlappen coëfficiënt en Manders 'coëfficiënt (Plugins <Jacop).
6. Representatieve resultaten
Mitochondriale functie in levende menselijke fibroblasten kunnen worden geëvalueerd via live cell imaging techniek. Voor functionele assays, de TMRE fluorescentiesignaal correleert met de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP). Onder normale omstandigheden MMP de TMRE fluorescentie beduidend hoger (Figuur 1A, bovenste rij) dan in pathologische omstandigheden gekenmerkt door een verminderde MMP (Figuur 1A, onderste rij). Deze fluorescentie intensiteit wordt gemeten door het gemiddelde van de gemiddelde grijswaarde van elk mitochondriale structuur (
Naast de beoordeling van mitochondriale functie in menselijke fibroblasten, kunnen live cell imaging microscopy worden gebruikt om verschillende parameters van mitochondriale morfologie definiëren. Door de Mitotracker Green FM kleurstof mitochondriale structuren gevisualiseerd onafhankelijk van hun MMP (Figuur 2). Dit is van belang te zorgen voor de integratie van alle mitochondriale structuren aanwezig in de analyses. Software gebruikt ImageJ wordt de morfologie geanalyseerd op basis van binaire cijfers als hier slechts mitochondriale morfologie parameters kan worden beoordeeld (Figuur 2, "binary"). Voorbeelden van mitochondriale morfologie analyses in termen van vorm factor, alsook de beeldverhouding zijn onlangs gepubliceerd 6, 13. Een andere belangrijke eigenschap die kan worden gemeten in levende humane fibroblasten is de afbraak van mitochondriale structuren. De eerste stap in deze vooruitgang kan worden beoordeeld door mitochondrio-lysosomale colokalisatie in live cell imaging microscopie. Bepaalde pathologische omstandigheden leiden tot een verhoogde colokalisatie van mitochondria met lysosomen (Figuur 3A). Opnieuw wordt Mitotracker Green FM gebruikt om mitochondriale structuren onafhankelijk van hun MMP vlek. Daarnaast kleuring met Lysotracker Red DND-99 maakt het mogelijk te visualiseren lysosomale structuren. Het is essentieel dat de Lysotracker Rode kleurstof aanwezig is tijdens het belichtingsproces, als wasstappen minder signaal te laag wordt voor visualisatie. Colokalisatie wordt weergegeven door heldere gele fluorescentie signalen door de overlap van de groene (Mitotracker Green FM) en rode (Lysotracker Red DND-99) kleuring (witte pijlen, Figuur 3A) en worden bepaald door berekening van de Pearson coefficient (Figuur 3B).
In het algemeen is voor off-line analyses met ImageJ software, is het nuttig om te visualiseren een cel per beeld, zodat de definitie van een bepaalde regio van belang (ROI) kan worden vermeden.
Figuur 1. Meting van de TMRE fluorescentie signaal dat de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) in levende menselijke fibroblasten door live cell imaging techniek. (A) is een fluorescent TMRE MMP-afhankelijke kleurstof waarvan de fluorescentie-intensiteit correleert met de MMP. Hoechst kleurstof werd gebruikt om kernen (blauw) kleuring. Onder normale omstandigheden MMP (bovenste rij), de TMRE fluorescentie aanzienlijk hoger is dan in pathologische omstandigheden gekenmerkt door een verminderde MMP (onderste rij). Fluorescentie-intensiteit is bovendien aangetoondals intensiteit oppervlakte perceel. Scale balk geeft 10 um. (B) Statistische analyses van de fibroblasten voorbeeld weergegeven in (A). Onder pathologische omstandigheden, wordt een verminderde TMRE fluorescentie van mitochondriën gemeten ten opzichte van de normale MMP staat. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Meting van de mitochondriale morfologie in levende humane fibroblasten door levende cellen beeldvormingstechniek. Mitotracker Green FM (groen) wordt gebruikt om mitochondriale structuren te visualiseren, voor dat het onafhankelijk van de MMP. Hoechst kleurstof werd gebruikt om kernen (blauw) kleuring. Met behulp van ImageJ Software, kan de morfologie worden geanalyseerd op binaire cijfers. Scale balk geeft 10 um. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Meting van de colokalisatie van mitochondriën met lysosomen in levende menselijke fibroblasten door live cell imaging techniek. (A) Mitotracker Groen FM (groen) wordt gebruikt om mitochondriale structuren vlek, Lyostracker Red DND-99 (rood) visualiseert lysosomale structuren. Hoechst kleurstof werd gebruikt om kernen (blauw) kleuring. Succesvolle colokalisatie onder pathologische omstandigheden wordt door een geel signaal vanwege de overlap van Lysotracker Red en Green Mitotracker kleuring (witte pijlen). Scale balk geeft 10 um. (B) Statistische analyses van de fibroblasten voorbeeld weergegeven in (A). Een hogere mate van mitochondrio-lysosomale colokalisatie resulteert in een verhoogde Pearson coëfficiënt waarde./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Huid van de patiënt fibroblasten als ex vivo modellen vormen een belangrijk instrument om de ziekte-geassocieerde genetische defecten te karakteriseren. Daarnaast, huid-afgeleide fibroblasten zijn gemakkelijk toegankelijk en kan worden uitgebreid op het kweken. Daarom primaire cellen verkregen van patiënten die PD-gerelateerde genetische mutaties de voorkeur boven het gebruik van tumor cellijnen zoals ze niet alleen de endogene otosclerosegen, maar de volledige genetische achtergrond van het aangetaste individu. Bovendien zijn de fibroblasten aangetoond belangrijke pathologische kenmerken van mitochondriale dysfunctie weerspiegelen bij neurodegeneratie. De experimenten beschreven in dit protocol zijn vooral nuttig voor het bestuderen van mitochondriale afwijkingen met functie, morfologie, alsmede de beoordeling colokalisatie van mitochondriën met lysosomen via live cell imaging techniek. Daarmee belangrijkste kenmerken van de ziekte, namelijk de mitochondriale dysfunctie en daaropvolgende afbreekbaarheidatie van deze niet-functionele organellen, worden gevisualiseerd en geanalyseerd goed 6, 13. Veranderingen van mitochondriale functie en morfologie zijn vaak een eerste stap van pathologie. Bijvoorbeeld, de fragmentatie van de mitochondriale netwerk kan een voorwaarde van verbeterde autophagic en mitophagic processen 6,12 zijn. Daarom kan de colokalisatie van mitochondria met lysosomen helpen mitochondriale afbraak (mitophagy) 6 beoordelen. Een gebrek aan deze colokalisatie alsmede een accumulatie van mitochondria met lysosomen kunnen weerspiegelen defecten in de lysosomale afbraak route en moet worden gevalideerd door het moduleren autophagic flux 6. In dit verband ImageJ Software een belangrijk hulpmiddel om gevalideerde data sets genereren door halfautomatische niet voorgespannen analysefuncties.
Een extra optie die het gebruik van humane fibroblasten omvat meer ziektegerelateerde modellen is de potentiële generatorion van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, die kunnen worden onderscheiden in verschillende celtypes die hoofddoel van het ziekteproces 14. In het geval van de ziekte van Parkinson, de differentiatie van dopaminerge neuronen in fibroblasten maakt deze cellulaire model een veelbelovend voor toekomstig onderzoek in dit neurodegeneratieve aandoening 15,16. Belangrijker, alle beschreven assays in het protocol hier gemakkelijk worden omgezet in experimentele opstellingen voor het onderzoeken mitochondriale veranderingen binnen dopaminerge neuronen. Natuurlijk kan nog neuron-specifieke beeldvorming van levende cellen experimenten toegepast, ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Fritz Thyssen Foundation (10.11.2.153 te RK), de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG, KR2119/3-2 en KR2119/8-1 te RK), het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 te RK) en door een doctoraatsbeurs van het charitatieve Hertie Foundation [naar LFB]. Wij danken Carolin Obermaier en Julia Westermeier voor hun steun tijdens de video shoot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 | |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B | |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 | |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 | |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 | |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 | |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 | |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| H–chst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson's disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
- Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
- Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson's disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
- Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson's disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
- Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
- Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge--the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson's disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
- Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
- Dagda, R. K., Cherra, S. J. 3rd, Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. , 284-13843 (2009).
- Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
- Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson's disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).
