Bruk av primære humane fibroblaster for overvåking Mitokondrielle Fenotyper i feltet av Parkinsons sykdom

Summary

Fibroblaster fra pasienter bærer mutasjoner i Parkinsons sykdom-forårsaker gener representerer en lett tilgjengelig

Abstract

Parkinsons sykdom (PD) er den nest vanligste bevegelse lidelse og rammer 1% av personer over 60 år ^en. Fordi aldring er den viktigste risikofaktor, vil tilfeller av PD øke i løpet av de neste tiårene ^2. Ved siden av patologisk protein folding og nedsatt protein degradering pathways, ble endringer i mitokondrienes funksjon og morfologi påpekt som ytterligere kjennetegn på neurodegeneration i PD ^3-11.

Etter års forskning i murine og humane kreftceller som in vitro modeller for å dissekere molekylære mekanismene i parkinsonisme, har bruken av menneskelige fibroblaster fra pasienter og hensiktsmessige kontroller som ex vivo-modeller blitt et verdifullt verktøy for forskning, hvis potensielle begrensningene er vurdert. Annet enn udødeliggjort, heller kunstige celle-modeller, primære fibroblaster fra pasienter bærer sykdom mutasjoner tilsynelatende reflekterer viktige patologiske funksjoner of sykdom hos mennesker.

Her har vi avgrense prosedyren for å ta hud biopsier, dyrking humane fibroblaster og ved hjelp av detaljerte protokoller for viktige mikroskopiske teknikker for å definere mitokondrie fenotyper. Disse ble brukt til å undersøke ulike funksjoner knyttet til PD som er relevante for mitokondrie funksjon og dynamikk. Ex vivo, kan mitokondrier bli analysert i forhold til sin funksjon, morfologi, colocalization med lysosomer (organelles nedverdigende dysfunksjonelle mitokondrier) og nedbrytning via lysosomal vei . Disse fenotyper er svært relevant for identifisering av tidlige tegn på PD og kan gå forut kliniske motoriske symptomer i menneskelig sykdom-genet. Derfor kan analysene som presenteres her brukes som verdifulle verktøy for å identifisere patologiske trekk ved neurodegeneration og bidra til å definere nye terapeutiske strategier i PD.

Protocol

1. Hudbiopsi og Dyrking av humane fibroblaster

1. Den hudbiopsi må tas av en erfaren lege. Prosedyren foregår under sterile betingelser og krever lokal anestesi. Typiske områder som brukes for biopsi er den indre side av den øvre arm, skulder eller korsryggen.
2. Du kan ta 4x4mm eller 6x6mm diameter prøven ved punch biopsi for å få nok vev for dyrking humane fibroblaster.
3. Skjær hudbiopsi i like små biter under sterile forhold for å skille dem i 2-4 T25 flasker. Hver kolbe bør inneholde 2-3 stykker av epidermis. Kulturen mediet inneholder 15% FCS, 1,1% natrium-pyruvat og 1% penicillin / streptomycin i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium.
4. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO _2. Forventet forplantningstid inntil første fibroblaster vokse ut av epidermal prøven er 1-2 uker. Hvis vekst problemer er oppstått, kan du benytte deg av fibroblast vekst factor (5-10 ng / ml FGF2) for å forbedre vekst av celler.
5. Når en celle sammenflyting av 50-70% er nådd, kan de primære humane fibroblaster fryses. Tiden inntil 50-70% sammenflyting nås, skiller mellom cellelinjer. Fryse fibroblaster i 90% FCS pluss 10% dimetylsulfoksyd (DMSO).

2. Utarbeidelse av humane fibroblaster for Live Cell Imaging Mikroskopi

Generelt bør forsøk med humane fibroblaster utføres med passasjer under 10 som senescence-tilknyttede forandringer kan endre egenskapene til cellene etter flere passasjer. I tvilstilfeller kan beta-galaktosidase analyser brukes til å vurdere induksjon av aldringsprosesser i de respektive cellene. Generelt, ikke bruk alderen fibroblaster (se ovenfor). Videre, for å sammenligne flere cellelinjer, arbeide med den samme passasje antall av hver cellelinje. Sammenligning av ulike genetisk homogene pasienter sammenlignet med friske kontroller anbefales. Men, som noen gangerpasienter bærer spesifikke mutasjoner kan være sjeldne, kan dette bety at huden biopsier fra bare én pasient med en viss passasje nummer og ulike styreledninger må inkluderes - her er det viktig å sikre at den samme passasjen antall av alle linjer inkludert. Hvis en celle sammenflyting av 50-70% er nådd, men ingen forsøk planlagt, bør fibroblaster fryses.

1. På den første dagen av forsøket, vaske de vedlagte fibroblaster gang med PBS. Deretter frigjøre dem fra kolben bunnen ved hjelp av en celle avløsning oppløsning av proteolytiske DNase enzymer (dvs. AccuMax).
2. Telle dine celler og frø 50,000-70,000 celler i hver brønn av en 4-kammer coverglass (1,8 cm ² kultur området per brønn). Følgelig, for de 8-kammer coverglas, er halvparten av cellen nummer eller en litt mindre egnet (0,8 cm ² kultur området per brønn). Det er viktig å frø snarere et lite antall celler for å utføre skikkelig encellede analyse. Ingen bestemt belegg for kamrene is behov.
3. Etter 24-48 timers, kan den levende celle bildebehandling eksperiment utføres. Sørg for at levende celle bildebehandling mikroskop er utstyrt med en inkubator som styrer temperatur og CO ₂ nivåer. Under bildeopptak, en atmosfære av 37 ° C og 5% CO ₂ bør opprettholdes.
4. Hver levende celle bildebehandling måling bør utføres i minst tre uavhengige eksperimenter. Totalt, bør minimum 50 celler per cellelinje avbildes. Live cell imaging eksperimenter samt off-line analyser må utføres under blindet forhold for å garantere objektive data innsamling.

3. Måling av mitokondrienes funksjon in Living humane fibroblaster

For konvensjonell måling av mitokondriell funksjon via mitokondrie membran potensial (MMP)-avhengige fargestoffer, er fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) den primære metoden. I tilfelle av humane fibroblaster, mobilnettet autofluorescence ofte observeres og kan forårsake falske positive resultater av interferens med selve fargingen signalet. Autofluorescens blir vanligvis mer uttalt med høyere passasje antall fibroblaster. Derfor foretrekker vi å vurdere mitokondriefunksjon av humane fibroblaster av levende celle bildebehandling mikroskopi.

1. 24-48 timer etter såing, Inkuber fibroblaster i 50 nM MMP-avhengige fargestoff tetramethylrodamine etylester (TMRE) i RPMI medium. Dette RPMI medium bør mangle fenolrødt som dette kan negativt påvirke bildekvaliteten. 1,6 pM av Hoechst flekker bør legges til visualisere kjerner.
2. Inkuber celler i forberedt farging løsning beskyttet mot lys i 15 minutter ved 37 ° C og 5% CO _2.
3. Erstatte farging løsning med RPMI medium (uten fenolrødt). Fortsette uten en vasketrinn og umiddelbart bildet celler. Bruk 63x forstørrelse og confocal laser scanning mikroskopi teknikk (alternativt fluorescensmikroskopi hjelpApotome teknikk) for å definere enkle lag av celler. Påfør 37 ° C og 5% CO ₂ til cellene under avbildingsprosessen.
4. Når bildebehandling fibroblaster, betale maksimal oppmerksomhet til den anvendte eksponeringstid fluorescerende lys som TMRE flekker kan bleke ut raskt. Definer din riktig eksponering tid mellom 200 og 300 ms, og ikke overstige dette intervallet. Bildeinnlastingen under standardiserte innstillinger er svært viktig, som man ville være i stand til å foreta sammenligninger basert på intensitet hvis innstillingene er forskjellig mellom cellelinjer.
5. Som en definert radius rundt den avbildede cellene er bleket ut etter lyseksponering, behold de neste synsfeltet tilstrekkelig langt fra photobleached delen.
6. Off-line analyser er utført ved hjelp ImageJ Software (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA).
7. Velg cellen som er interessant med et markeringsverktøy.
8. Konverter bildet til 8-bit (Bilde <Type <8-bit).
9. Reduser uspesifikk støy by bruke "Støvfjernar"-funksjonen (Process <Noise <utjevning).
10. Velg "oppslagstabeller - Fire" tilstand (Bilde <oppslagstabeller <Fire).
11. Slå på terskel til "Over / Under" funksjon og juster terskel (Bilde <Juster <Terskel).
12. Velg "analysere partiklene" alternativet, som vil gi deg den gjennomsnittlige verdien for grått for hver mitokondrie partikkel påvisbar (Analyze <Analyser Partikler). Lagre gitt resultat listen som et Excel-regneark.
13. Åpen resultat i Excel-programmet og beregne gjennomsnittet av gjennomsnittet grå verdien av mitokondrie strukturer (indikert som 'mening' i den gitte excel resultatlisten).
14. Å skape en overflate tomten, velger plugin "Interaktiv 3D overflate tomten" i "3D" plugin delen. Her kan du også justere tomten ved hjelp av ulike visningsalternativer. Endring av "opprinnelige fargene" til "Spectrum LUT" gir intensiteten skala bar for den aktuelle tomten.
15. Alternativtå bruke TMRE for å analysere mitokondriefunksjon av humane fibroblaster via live celle bildebehandling, en kombinasjon av de MMP-uavhengig fargestoff Mitotracker Grønn FM og MMP-avhengige fargestoff Mitotracker CM-H ₂ XRos kan brukes. Igjen, for humane fibroblaster lever celle bildebehandling mikroskopi er å foretrekke, men generelt dette alternativet har også blitt brukt ved hjelp av FACS analyse i andre typer celler ^12. Når du bruker denne alternativ tilnærming til å måle mitokondrienes funksjon i humane fibroblaster, trinn 3-7 protokollen § 5 "Måling av mitochondrio-lysosomal colocalization i levende humane fibroblaster" bør brukes. Dermed er overlapping av signaler, både fra mitokondriene positivt for Mitotracker Grønn FM og Mitotracker CM-H ₂ XRos beregnet og angir mengden av funksjonelle mitokondrier som forholdet til alle mitokondriene stede.

4. Måling av Mitokondrielt Morfologi in Living humane fibroblaster

1. 24-48hr etter såing, inkubere celler i 200 nM Mitotracker Grønn FM i RPMI medium (ingen fenolrødt) beskyttes mot lys i 15 minutter ved 37 ° C og 5% CO _2. 1,6 pM av Hoechst flekker bør brukes til å markere kjerner. Mitotracker Grønn FM er en MMP-uavhengig fargestoff, som flekker alle mitokondrie strukturer stede.
2. Vask forsiktig cellene gang med PBS.
3. Legg frisk RPMI medium (uten fenolrødt) til celler og umiddelbart bilde celler. Bruk 63x forstørrelse og confocal laser scanning mikroskopi teknikk (alternativt fluorescensmikroskopi hjelp Apotome teknikk) for å definere ett enkelt lag av celler.
4. Off-line analyser tatt ut ved bruk av ImageJ Software.
5. Velg cellen som er interessant med et markeringsverktøy.
6. Konverter bildet til 8-bit (Bilde <Type <8-bit).
7. Reduser uspesifikk støy ved å bruke "Støvfjernar"-funksjonen (Process <Noise <utjevning).
8. Bruk convolution filter for å markere mitochondrial strukturer (Process <Filtre <Convolve).
9. Justere terskelen slik at signal-til-støy-forholdet er hensiktsmessig (Bilde <Juster <terskel).
10. Ved å bruke "analysere partiklene" alternativet, er automatisk identifisering av mitokondrie strukturer igangsatt basert på et valgt pikselstørrelse (Analyze <Analyser Partikler). Flere mitokondrie parametre senere beregnet som areal, omkrets, små og store akser eller sirkularitet. Disse målingene kan stilles inn individuelt (Analyser <Set Mål). Lagre gitt resultat listen som et Excel-regneark.
11. Åpne resultat i Excel-programmet. Med bruk av slike parametre, kan analyser av mitokondrie morfologi utføres. Dette inkluderer definisjonen av formfaktoren som indikerer graden av forgrening av et mitokondrie nettverket [formel: (perimeter ²⁾ / (4 * PI () * område)] samt størrelsesforholdet definerer lengden av mitochondria (formel: store akser / mindre akser).

5. Måling av Mitochondrio-lysosomal colocalization in Living humane fibroblaster

1. 24-48 timer etter såing, inkubere celler i 200 nM Mitotracker Grønn FM og 100 nM Lyostracker Rød DND-99 i RPMI medium (uten fenolrødt) beskyttes mot lys i 15 minutter ved 37 ° C og 5% CO _2. 1,6 pM av Hoechst flekker brukes til å fremheve kjerner.
2. Erstatt mediet med fersk RMPI medium (uten fenolrødt) inneholder 100 nM Lyostracker Red DND-99. Dette fargestoff har å være til stede under hele bildebehandling økt. Ikke vaske cellene etter inkubasjonstid. Umiddelbart image cellene. Bruk 63x forstørrelse og konfokal teknikk (alternativt Apotome teknikk) for å definere enkle lag av celler.
3. Off-line analyser tatt ut ved bruk av ImageJ Software.
4. Åpne de to respektive bildene du ønsker å analysere i form av colocalization status.
5. Konverter bildet til 8-bit (Bilde <Type <8-bit). Reduser uspesifikk støy ved å bruke "Støvfjernar"-funksjonen i begge bildene (Process <Noise <utjevning).
6. Velg plugin "JACoP" som colocalization analysere verktøyet, som gir deg verdier for de respektive kanalene og beregner Pearsons koeffisient, overlapper koeffisient og Manders 'koeffisient (Plugins <JACoP).

6. Representant Resultater

Mitokondriell funksjon i levende humane fibroblaster kan evalueres via live celle avbildningsteknikk. For funksjonelle analyser, korrelerer den TMRE fluorescens signalet med mitokondrie membran potensialet (MMP). Under normale MMP forhold er TMRE fluorescens signifikant høyere (figur 1A, øvre rad) enn under patologiske tilstander karakterisert ved en redusert MMP (Figur 1A, nederste rad). Dette fluorescensintensitet måles ved å beregne gjennomsnittet av middelverdien grå verdien av hver mitokondriestruktur ( (figur 1A, høyre side).

Ved siden av vurderingen av mitokondrienes funksjon i humane fibroblaster, kan levende celle bildebehandling mikroskopi brukes til å definere ulike parametere mitokondrie morfologi. Som bruker Mitotracker Grønne FM dye mitokondrielle strukturer er visualisert uavhengig av deres respektive MMP (figur 2). Dette er viktig for å sikre at inkludering av alle mitokondrie strukturer stede inn analysene. Bruke ImageJ Software, morfologi analysert på basis av binære tall, som bare her mitokondrie morfologi parametere kan vurderes (figur 2, "binær"). Eksempler for mitokondrie morfologi analyser i formmessig faktor samt sideforhold ble nylig publisert ^{6, 1}3. En annen viktig funksjon som kan måles i levende humane fibroblaster er nedbrytning av mitokondrie strukturer. Det første trinnet i denne utviklingen kan vurderes ved mitochondrio-lysosomal colocalization i live cell imaging mikroskopi. Visse patologiske tilstander føre til økt colocalization av mitokondrier med lysosomer (figur 3A). Igjen er Mitotracker Grønn FM brukes til å farge mitokondrie strukturer uavhengig av deres respektive MMP. I tillegg, farging med Lysotracker Red DND-99 tillater visualisere lysosomale strukturer. Det er kritisk at Lysotracker rødt fargestoff er til stede under det bildedannende prosess, som vasketrinnene redusere signalet som blir for lavt for visualisering. Colocalization er representert ved tydelige gule fluorescens signaler på grunn av overlapping av den grønne (Mitotracker Grønn FM) og rød (Lysotracker Red DND-99) farging (hvite piler, figur 3A) og bestemmes ved beregning av Pearson coefficient (figur 3B).

Generelt for off-line analyser med ImageJ programvare, er det nyttig å visualisere en celle per bilde, slik at definisjonen av en spesifikk region av interesse (ROI) kan unngås.

Figur 1. Måling av TMRE fluorescens signalet indikerer mitokondrie membranpotensialet (MMP) i levende humane fibroblaster av levende celle avbildningsteknikk. (A) er et fluorescerende TMRE MMP-avhengige fargestoff, hvis fluorescensintensitet korrelerer med MMP. Hoechst fargestoff ble brukt til stain atomkjerner (blå). Under normale MMP driftsforhold (øverste rad), er TMRE fluorescens betydelig høyere enn under patologiske tilstander karakterisert ved en redusert MMP (nederste rad). Fluorescensintensitet er i tillegg vistsom intensiteten overflate tomten. Skala indikerer 10 mikrometer. (B) Statistiske analyser av de eksemplariske fibroblaster vist i (A). Under patologiske tilstander, er en redusert TMRE fluorescens av mitokondrier målt i forhold til normal MMP tilstand. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Måling av mitokondrie morfologi i levende humane fibroblaster av levende celle avbildningsteknikk. Mitotracker Grønn FM (grønn) brukes til å visualisere mitokondrielle strukturer, for at det er uavhengig av MMP. Hoechst fargestoff ble brukt til stain atomkjerner (blå). Bruke ImageJ Software, kan morfologi bli analysert på binære tall. Skala indikerer 10 mikrometer. Klikk her for å vise større figur.

Figur 3. Måling av colocalization av mitokondrier med lysosomer i levende humane fibroblaster av levende celle avbildningsteknikk. (A) Mitotracker Grønn FM (grønn) blir brukt til å sette flekker mitokondrielle strukturer, Lyostracker Rød DND-99 (rød) visualiserer lysosomale strukturer. Hoechst fargestoff ble brukt til stain atomkjerner (blå). Vellykket colocalization etter patologiske tilstander er angitt med en gul signal på grunn av overlapping av Lysotracker Red og Mitotracker Grønn flekker (hvite piler). Skala indikerer 10 mikrometer. (B) Statistiske analyser av de eksemplariske fibroblaster vist i (A). En høyere grad av mitochondrio-lysosomale colocalization resulterer i en forhøyet Pearson koeffisientverdien./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Discussion

Pasient hudfibroblaster som ex vivo-modeller representerer et viktig verktøy for å karakterisere sykdomsassosierte genetiske defekter. I tillegg, hud-avledede fibroblaster er lett tilgjengelige og kan utvides ved dyrkning. Derfor, primære celler oppnådd fra pasienter som frakter PD-assosierte genetiske mutasjoner er å foretrekke fremfor bruk av tumorcellelinjer som de inneholder ikke bare den endogene sykdomsfremkallende genet, men hele genetiske bakgrunnen for berørte enkelte. Videre har de vist seg å fibroblastene reflektere viktige patologiske funksjoner av mitokondriell dysfunksjon under neurodegenerering. Forsøkene er beskrevet i denne protokollen er spesielt nyttige for å studere mitokondrie fenotyper inkludert funksjon, morfologi samt vurdere colocalization av mitokondrier med lysosomer via live celle avbildningsteknikk. Hermed, viktigste kjennetegnene på sykdommen, nemlig mitokondriedysfunksjon og påfølgende Svekketasjon av disse ikke-funksjonelle organeller, kan visualiseres og analyseres riktig ^{6, 13.} Endringer i mitokondrienes funksjon og morfologi er ofte et første trinn av sykdommen patologi. For eksempel økt fragmentering av mitokondrie nettverket kan være en forutsetning for forbedrede autophagic og mitophagic prosesser ^6,12. Derfor kan colocalization av mitokondrier med lysosomer bidra til å vurdere mitokondrie nedbrytning (mitophagy) ^6. Mangel på denne colocalization samt en opphopning av mitokondrier med lysosomer kunne reflektere defekter i det lysosomale nedbrytning pathway og må valideres ved modulering autophagic flussmiddel ^6. I denne sammenheng representerer ImageJ Software et viktig verktøy for å generere validert datasett ved halv-automatiske non-partisk analysere funksjoner.

En ekstra som utvider bruken av humane fibroblaster til mer sykdomsrelaterte modeller er den mulige generation av induserte pluripotente stamceller (iPS) celler, som kan være differensiert inn i forskjellige celletyper som er hovedmålet av sykdommen prosessen ^14. I tilfelle av Parkinsons sykdom, gjør differensiering av fibroblaster inn dopaminerge neuroner denne cellulære modellen en lovende metode for fremtidig forskning i denne nevrodegenerativ lidelse ^15,16. Viktigere, kan alle de beskrevne analyser i protokollen her lett oversettes til eksperimentelle oppsett for å undersøke mitokondrie forandringer innenfor dopaminerge nevroner. Selvfølgelig kan enda flere neuron-spesifikke live celle bildedannende eksperimenter brukes også.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
H–chst 33342	Invitrogen	H-3570
Table 1. Specific reagents and equipment.