Использование первичных фибробластов человека для мониторинга митохондриальной фенотипы в области болезни Паркинсона

Summary

Фибробласты от пациентов, несущих мутации в болезнетворные гены Паркинсона представляет собой легко доступны

Abstract

Болезнь Паркинсона (БП) является вторым наиболее распространенным нарушением движения и влияет на 1% людей в возрасте старше 60 ^1. Поскольку старение является наиболее важным фактором риска, случаи PD увеличится в течение следующего десятилетия ^2. Рядом с патологическим складывающиеся белка и нарушение путей деградации белков, изменения функции митохондрий и морфологии были отмечены как дальнейшее признак нейродегенерации в PD ^3-11.

После многих лет исследований в мышиных и человеческих раковых клеток, как в пробирке моделей, чтобы анализировать молекулярных путей, болезни Паркинсона, использование человеческих фибробластов у пациентов и соответствующие меры контроля для бывших моделей естественных стал ценным инструментом исследования, если потенциальный предостережения считаются. Кроме увековечена, а искусственные модели ячейки, первичные фибробласты от пациентов проведение болезни мутации, связанные, очевидно, отражают важные патологические особенности оF заболевания человека.

Здесь мы разграничить процедуру принятия биопсии кожи, культивирование фибробластов человека и с помощью подробных протоколов для основных микроскопических методов для определения митохондриальной фенотипов. Они были использованы для изучения различных особенностей, связанных с PD, которые относятся к митохондриальной функции и динамика. EX VIVO, митохондрии могут быть проанализированы с точки зрения их функции, морфологии, колокализации с лизосом (органеллы, унижающие дисфункциональные митохондрии) и деградации через лизосомальных пути . Эти фенотипы являются крайне актуальными для выявления ранних признаков PD и может предшествовать клинические симптомы двигатель в человеческих болезней носителей гена. Таким образом, тесты, представленные здесь может быть использован как ценный инструмент для выявления патологических особенностей нейродегенерации и поможет определить новые терапевтические стратегии в PD.

Protocol

1. Биопсия кожи и культивирование фибробластов человека

1. Биопсия кожи должно быть принято опытный врач. Процедура проводится в стерильных условиях и не требует местной анестезии. Типичные участки, используемые для биопсии внутренней стороне предплечья, плеча или нижней части спины.
2. Вы можете взять 4x4mm или 6x6mm диаметра образца по биопсии, чтобы получить достаточно ткани для культивирования фибробластов человека.
3. Вырезать биопсии кожи в равной мелкие кусочки в стерильных условиях, чтобы разделить их на 2-4 T25 колбы. Каждая колба должна содержать 2-3 части эпидермиса. Культуральной среды содержит 15% FCS, 1,1% пирувата натрия и 1% пенициллина / стрептомицина в Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 среда.
4. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO _2. Ожидается времени распространения до первого фибробластов растут из эпидермиса образца составляет 1-2 недель. Если рост возникновения проблем, вы можете использовать фибробластов фа ростаCTOR (5-10 нг / мл FGF2) для повышения роста клеток.
5. Как только клетка слияния 50-70% будет достигнут, основной человеческие фибробласты могут быть заморожены. Время до 50-70% слияния будет достигнута, отличается среди клеточных линий. Замораживание фибробластов в 90% FCS плюс 10% диметилсульфоксида (ДМСО).

2. Подготовка фибробластов человека для живых микроскопии изображений сотовых

В общем, эксперименты с человеческими фибробластами должны быть выполнены проходы ниже 10, как старение связанные изменения могут изменить свойства клеток после нескольких проходов. В случае сомнений, бета-галактозидазы анализы могут быть использованы для оценки индукции процессов старения в соответствующих клетках. Как правило, не используют в возрасте фибробластов (см. выше). Кроме того, для сравнения нескольких клеточных линий, работать с тем же номером прохождения каждой клеточной линии. Сравнение различных генетически однородны пациентов по сравнению со здоровыми рекомендуется. Однако, как иногдапациентов проведение специфических мутаций может быть редким, это может означать, что биопсия кожи только от одного пациента с определенным количеством проход и различные линии управления должны быть включены - вот это важно обеспечить такое же количество прохождение всех линий включены. Если ячейка слияния 50-70% будет достигнут, но не эксперимент, запланированные, фибробласты должны быть заморожены.

1. В первый день эксперимента, мыть прилагаемой фибробластов один раз PBS. Затем освободить их от колбу с использованием раствора ячейки отряда протеолитических ферментов аз (т.е. Accumax).
2. Подсчитайте свои клетки и семян 50,000-70,000 клеток в каждую лунку 4-камерные покровного стекла (1,8 см ² области культуры на лунку). Соответственно, для 8-камеру coverglas, половина из числа клеток или немного меньше подходит (0,8 см ² области культуры на лунку). Важно, чтобы семена, а небольшое число клеток выполнять в режиме реального одноклеточных анализа. Никаких конкретных покрытия для камер янужна.
3. После 24-48 часов, живой эксперимент визуализации ячейки могут быть выполнены. Убедитесь, что живая клетка визуализации микроскопа оснащен инкубатор, который контролирует температуру и CO ₂ уровня. Во время захвата изображений, атмосфера 37 ° С и 5% CO ₂ должны быть сохранены.
4. Каждая живая клетка измерения изображения должны проводиться как минимум в трех независимых экспериментах. В общей сложности, не менее 50 клеток в клеточной линии должны быть отображены. Живая клетка изображений экспериментов, а также офф-лайн анализы должны быть проведены в соответствии ослепил условиях, чтобы гарантировать беспристрастный сбор данных.

3. Измерение функции митохондрий в живых фибробластов человека

Для обычных измерений функции митохондрий через митохондриальную мембранный потенциал (MMP)-зависимые красители, флуоресцентные активирован сортировки клеток (FACS) является основным методом. В случае фибробластов человека, сотовая autofluoreСЦЕНА часто наблюдается и может привести к ложно-положительных результатов от вмешательства в реальный сигнал окрашивания. Аутофлуоресцентной обычно становится более выраженной с высшим переход количества фибробластов. Поэтому мы предпочитаем, чтобы оценить функцию митохондрий фибробластов человека живым микроскопом изображений клеток.

1. 24-48 ч после посева, инкубировать фибробластов в 50 нМ MMP-зависимых красителей tetramethylrodamine этиловый эфир (TMRE) в среде RPMI. Эта среда RPMI должны хватает фенола красного, так как это может негативно повлиять на качество изображения. 1,6 мкм окрашивания Hoechst должны быть добавлены к визуализации ядер.
2. Инкубировать клетки в приготовленный раствор окрашивания защищенном от света месте в течение 15 мин при 37 ° C и 5% CO _2.
3. Заменить окрашивание раствора с RPMI среде (без фенола красного). Продолжить без промывки и сразу же клетки изображения. Используйте 63x увеличением и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (в качестве альтернативы использованием флуоресцентной микроскопииApotome техники) для определения одного слоя клеток. Применить 37 ° C и 5% CO ₂ в клетках во время съемки процесса.
4. При визуализации фибробластов, уделять максимальное внимание применяться времени воздействия дневного света, как TMRE окрашивания может отбелить быстро. Определите соответствующее время экспозиции от 200 до 300 мс и не превышать этот интервал. Получения изображений при стандартных настройках очень важно, как можно было бы не в состоянии сделать сравнение на основе интенсивности, если в настройках различаются между клеточными линиями.
5. Как определить радиус вокруг отображаемого клеток отбеливают после воздействия света, хранить следующие поля зрения достаточно далеко от photobleached разделе.
6. Автономный анализы выполняются с помощью программного обеспечения ImageJ (Wayne Расбанд; Национального института здоровья, США).
7. Выберите ячейку интересов с помощью инструмента выделения.
8. Преобразование изображения в 8-битные (Image <Тип <8-бит).
9. Уменьшить неспецифической б шумаУ помощью "Удаление пятен" функции (Process <Шум <Удаление пятен).
10. Выберите "Поиск столы - Fire" условия (Изображение <таблиц подстановок <Fire).
11. Переключитесь на пороге функции "больше / меньше" функцию и установить порог (Изображение <Adjust <порога).
12. Выберите "анализ частиц" вариант, который даст вам среднее значение серого для каждого митохондриальной частицы обнаруживаются (Анализ <Анализ частиц). Сохранить данный список результатов в виде таблицы Excel.
13. Открыть файл результата в программе Excel и вычислить среднее среднее значение серого митохондриальной структуры (обозначается как "среднее" в данном списке результатов Excel).
14. Чтобы создать график поверхности, выберите плагин «Интерактивная 3D поверхность участка" в "3D" плагин разделе. Здесь вы можете дополнительно настроить участка с использованием различных вариантов отображения. Изменение "Original Colors", чтобы "Спектр LUT" дает баре шкале интенсивности для соответствующего участка.
15. Поочередноиспользованием TMRE для анализа митохондриальной функции фибробластов человека с помощью изображений живых клеток, сочетание MMP-независимые краситель зеленого Mitotracker FM и MMP-зависимых красителей Mitotracker CM-H ₂ Xros могут быть использованы. Опять же, для фибробластов человека жить микроскопом клетки изображения предпочтительнее, но в целом эта альтернативная также используется использованием FACS анализа в другие виды клеток ^12. При использовании этого альтернативного подхода для оценки функции митохондрий в фибробластах человека, шаг 3-7 раздела протокол 5 "Измерение mitochondrio-лизосомальных колокализации в живых фибробластов человека" должны быть применены. При этом, наложение сигналов, как из митохондрий положительным для Mitotracker Зеленый FM и Mitotracker CM-H ₂ Xros рассчитывается и указывается количество функциональных митохондрий как отношение ко всем митохондрии присутствуют.

4. Измерение митохондриальной Морфология в живых фибробластов человека

1. 24-48ч после посева, инкубировать клетки в 200 нМ Mitotracker Зеленый FM в RPMI среде (без фенола красного) в защищенном от света в течение 15 мин при 37 ° C и 5% CO _2. 1,6 мкм окрашивания Hoechst должны быть использованы для выделения ядер. Mitotracker Зеленый FM является MMP-независимые краситель, который окрашивает все митохондриальные структуры представляют.
2. Осторожно промыть клетки один раз PBS.
3. Добавить свежую среду RPMI (без фенола красного) в клетки и клетки сразу же изображение. Используйте 63x увеличением и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (в качестве альтернативы флуоресцентной микроскопии использованием Apotome техники) для определения одного слоя клеток.
4. Автономный анализ вывозятся использование программного обеспечения ImageJ.
5. Выберите ячейку интересов с помощью инструмента выделения.
6. Преобразование изображения в 8-битные (Image <Тип <8-бит).
7. Уменьшить шум неспецифической с помощью "Удаление пятен" функции (Process <Шум <Удаление пятен).
8. Используйте фильтр свертки для выделения митохондрийdrial структуры (процесс <Фильтры <Размывание).
9. Отрегулируйте порог так, чтобы сигнал-шум соответствующий (Image <Adjust <порога).
10. С помощью «анализировать частицы" вариант, автоматическая идентификация митохондриальных структур возбуждено по выбранной размер пиксела (Анализ <Анализ частиц). Несколько митохондриальной параметры впоследствии рассчитывается как площадь, периметр, малой и большой осей или округлости. Эти измерения могут быть установлены отдельно (Анализ <Измерения Set). Сохранить данный список результатов в виде таблицы Excel.
11. Откройте файл результатов в программе Excel. С использованием таких параметров, анализ митохондриальной морфологии может быть осуществлена. Это включает в себя определение форм-фактора с указанием степени разветвленности митохондриальной сети [формула: (периметр ²⁾ / (4 * PI () * области)], а также соотношение сторон определении длины митохондрий (формула: основные осей / малой осей).

5. Измерение Mitochondrio-лизосомальных колокализации в живых фибробластов человека

1. 24-48 ч после посева, инкубировать клетки в 200 нМ Mitotracker Зеленый FM и 100 нМ Lyostracker Красной DND-99 в RPMI среде (без фенола красного), защищенном от света месте в течение 15 мин при 37 ° C и 5% CO _2. 1,6 мкм окрашивания Hoechst используется для выделения ядер.
2. Замените среду с свежей среды RMPI (без фенола красного), содержащей 100 нМ Lyostracker Красной DND-99. Этот краситель должен присутствовать в течение всего сеанса визуализации. Не мойте клеток после инкубационного периода. Сразу изображения клеток. Используйте 63x увеличением и конфокальной техники (в качестве альтернативы Apotome техники) для определения одного слоя клеток.
3. Автономный анализ вывозятся использование программного обеспечения ImageJ.
4. Открытие двух соответствующих изображений вы хотели бы проанализировать с точки зрения колокализации статус.
5. Преобразование изображения в 8-битные (Image <Тип <8-бит). Уменьшить шум неспецифической с помощью "Удаление пятен" функции в обоих изображений (Process <Шум <Удаление пятен).
6. Выберите плагин "JACoP", как колокализации анализа инструмент, который дает вам значения для соответствующих каналов и вычисляет коэффициент Пирсона, перекрывают коэффициента и коэффициента Мандерс (плагины <JACoP).

6. Представитель Результаты

Функции митохондрий в живых фибробластов человека может быть оценена с помощью техники визуализации живых клеток. Для функционального анализа, сигнал TMRE флуоресценции коррелирует с митохондриального мембранного потенциала (ММП). При нормальных условиях ММП, флуоресценция TMRE значительно выше (рис. 1А, верхний ряд), чем при патологических состояниях, характеризующихся пониженным ММП (рис. 1А, нижний ряд). Эта интенсивность флуоресценции измеряется путем вычисления среднего значения среднего серого ценность каждого митохондриальной структуры ( (рис. 1А, правая сторона).

Далее для оценки функции митохондрий в фибробластах человека, живых изображений микроскопии клетки могут быть использованы для определения различных параметров митохондриального морфологии. С помощью Mitotracker зеленый краситель FM митохондриальной структуры визуализируются независимо от их соответствующих ММП (рис. 2). Это важно для обеспечения включения всех митохондриальных структур в настоящее анализов. Использование программного обеспечения ImageJ, морфология анализируется на основе двоичной цифры, так как только здесь митохондриальной параметров морфологии может быть оценена (рис. 2, "двоичный"). Примеры для анализа митохондриальной морфологии с точки зрения форм-фактора, а также соотношение сторон были недавно опубликованы ^{6, 1}3. Еще одна важная особенность, которая может быть измерена в живых фибробластов человека является деградация митохондриальной структуры. Первый шаг в этом прогрессе можно судить по mitochondrio-лизосомальных колокализации в живых микроскопии изображений клеток. Некоторые патологические состояния приводят к повышенной колокализации митохондрий с лизосомы (рис. 3А). Опять же, Mitotracker Зеленый FM используется для окрашивания митохондриальных структур независимо от их соответствующих ММП. Кроме того, окрашивание Lysotracker Красной DND-99 позволяет визуализировать лизосомальных структур. Очень важно, чтобы краситель красный Lysotracker присутствует во время визуализации процесса, как стиральная шаги уменьшить сигнал, который становится слишком низкой для визуализации. Колокализации представлены светло-желтого сигналов флуоресценции в связи с перекрытием зеленый (Mitotracker Зеленый FM) и красный (Lysotracker Красной DND-99) окрашивание (белые стрелки, 3А) и определяются путем расчета Pearson СЕfficient (рис. 3В).

В общем, для офф-лайн анализ с ImageJ программного обеспечения, это полезно визуализировать одну клетку на изображение, так что определение конкретной области интереса (ROI) можно избежать.

Рисунок 1. Измерение TMRE флуоресценции сигнал, указывающий на митохондриальный мембранный потенциал (ММП) в живых фибробластов человека живым метод визуализации ячейки. (A) TMRE является люминесцентная MMP-зависимых красителей, которых интенсивность флуоресценции коррелирует с ММП. Hoechst краситель был использован для окрашивания ядер (синий). При нормальных условиях ММП (верхний ряд), флуоресценция TMRE значительно выше, чем при патологических состояниях, характеризующихся пониженным MMP (нижний ряд). Интенсивность флуоресценции дополнительно показанокак интенсивность участок поверхности. Масштаб полоса указывает на 10 мкм. (B) Статистический анализ примерной фибробластов показано на рисунке (A). В условиях патологии снизилась TMRE флуоресценции митохондрий измеряется по сравнению с нормальным состоянием ММП. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. Измерение митохондриальной морфологии живых человеческих фибробластов живой метод визуализации ячейки. Mitotracker Зеленый FM (зеленый) используется для визуализации митохондриальных структур, что она не зависит от ММР. Hoechst краситель был использован для окрашивания ядер (синий). Использование программного обеспечения ImageJ, морфологии могут быть проанализированы на двоичных цифр. Масштаб полоса указывает на 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую фигуру.

Рисунок 3. Измерение колокализации митохондрий с лизосом в живых человеческих фибробластов живой метод визуализации ячейки. (A) Mitotracker Зеленый FM (зеленый) используется для окрашивания митохондриальных структур, Lyostracker Красной DND-99 (красный) визуализирует лизосомальных структур. Hoechst краситель был использован для окрашивания ядер (синий). Успешное колокализации при патологических состояниях указывает желтый сигнал из-за перекрытия Красной Lysotracker и Mitotracker Зеленая окраска (белые стрелки). Масштаб полоса указывает на 10 мкм. (B) Статистический анализ примерной фибробластов показано на рисунке (A). Высокая степень mitochondrio-лизосомальных колокализации результатов в повышенном значение коэффициента Пирсона./ 4228/4228fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.

Discussion

Фибробласты кожи пациента, как бывший моделей естественных условиях представляют собой важный инструмент для описания болезней связанных с ними генетических дефектов. Кроме того, кожа полученных фибробласты легко доступны и могут быть расширены при культивировании. Таким образом, первичные клетки, полученные от больных проведении PD-связанные с ними генетические мутации являются более предпочтительными по сравнению с использованием опухолевых клеточных линий, поскольку они содержат не только эндогенного болезнетворных генов, но и весь генетический фон пострадавшего. Кроме того, фибробласты были показаны, чтобы отразить важные патологические особенности митохондриальной дисфункции при нейродегенерации. Эксперименты, описанные в этом протоколе особенно полезны для изучения митохондриальной фенотипов в том числе функции, морфологии, а также оценки колокализации митохондрий с помощью лизосом живой метод визуализации ячейки. При этом, основными признаками заболевания, а именно митохондриальная дисфункция и последующие унижающегоATION из этих нефункциональных органеллы, могут быть отображены и проанализированы должным образом ^{6, 13.} Изменения митохондриальных функций и морфологии часто первым шагом патологии болезни. Например, увеличить фрагментацию митохондриальных сети может стать предпосылкой расширения аутофагии и mitophagic процессы ^6,12. Таким образом, колокализации митохондрий с лизосомы могут помочь в оценке митохондриальной деградации (mitophagy) ^6. Отсутствие этого колокализации, а также накопление митохондрий с лизосом, возможно, отражает недостатки в лизосомальных пути деградации и должно быть подтверждено путем модуляции аутофагии потока ^6. В этом контексте ImageJ Программное обеспечение представляет собой важный инструмент для создания подтверждено наборов данных полуавтоматический беспристрастного анализа функций.

Дополнительная опция, которая расширяет использование человеческих фибробластов более связанных с болезнью моделей является потенциальным порождающимионный индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток, которые могут быть дифференцированы в различные типы клеток, которые являются главной целью процесса болезни ^14. В случае болезни Паркинсона, дифференцирование фибробластов в дофаминергических нейронов делает эту модель сотового перспективным инструментом для дальнейших исследований в этой нейродегенеративные расстройства ^15,16. Важно отметить, что все описанные тесты в протоколе здесь могут быть легко переведены на экспериментальных установок для исследования митохондриальной изменений в дофаминергических нейронов. Конечно, еще более специфичные для нейронов живого эксперимента визуализации ячейки могут быть применены, тоже.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
H–chst 33342	Invitrogen	H-3570
Table 1. Specific reagents and equipment.