Användning av primära humana fibroblaster för övervakning Mitokondriella fenotyper inom området för Parkinsons sjukdom

Summary

Fibroblaster från patienter som bär mutationer i Parkinsons sjukdom som orsakar gener utgör en lättillgänglig

Abstract

Parkinsons sjukdom (PS) är den näst vanligaste rörelsestörning och drabbar 1% av befolkningen äldre än 60 ^1. Eftersom åldrande är den viktigaste riskfaktorn, kommer fall av PD öka under de närmaste årtiondena ^2. Bredvid patologisk proteinveckning och försämrade protein vägar nedbrytning har förändringar av mitokondriernas funktion och morfologi pekades ut som ytterligare kännetecken för neurodegeneration i PD ^3-11.

Efter år av forskning i murina och humana cancerceller som in vitro-modeller för att dissekera molekylära vägar för parkinsonism, har användningen av humana fibroblaster från patienter och lämpliga kontroller som ex vivo-modeller blivit ett värdefullt instrument för forskning om potentiella förbehåll beaktas. Annat än odödliggjorda ganska artificiella cellmodeller, primära fibroblaster från patienter som bär sjukdom-associerade mutationer speglar uppenbarligen viktiga patologiska drag of den mänskliga sjukdomen.

Här har vi avgränsa förfarandet för att ta hudbiopsier, odling humana fibroblaster och använda detaljerade protokoll för viktiga mikroskopiska tekniker för att definiera mitokondriella fenotyper. Dessa användes för att undersöka olika funktioner i samband med PD som är relevanta för mitokondriell funktion och dynamik. Ex vivo kan mitokondrier analyseras i termer av deras funktion, morfologi, samlokalisering med lysosomer (de organeller förnedrande dysfunktionella mitokondrier) och nedbrytning via lysosomala vägen . Dessa fenotyper är högst relevanta för identifieringen av tidiga tecken på PD och kan föregå kliniska motoriska symtom i mänskliga sjukdomar genbärare. Därför kan de analyser som presenteras här kan användas som värdefulla verktyg för att identifiera patologiska funktioner i neurodegeneration och hjälper till att definiera nya terapeutiska strategier PD.

Protocol

1. Hudbiopsi och Odling av humana fibroblaster

1. Huden biopsi måste tas av en erfaren läkare. Förfarandet sker under sterila förhållanden och kräver lokalbedövning. Typiska platser som används för biopsi är insidan av överarmen, axel eller nedre delen av ryggen.
2. Du kan ta 4x4mm eller 6x6mm diameter prov genom stansbiopsi att få tillräckligt med vävnad för odling mänskliga fibroblaster.
3. Skär hudbiopsi i lika små bitar under sterila betingelser för att separera dem i 2-4 T25 kolvar. Varje flaska bör innehålla 2-3 stycken epidermis. Odlingsmediet innehåller 15% FCS, 1,1% natriumpyruvat och 1% penicillin / streptomycin i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium.
4. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% COj _2. Den förväntade förökning tills 1. Fibroblaster växer ur den epidermala provet är 1-2 veckor. Om tillväxten problem uppstår kan du använda fibroblasttillväxt factor (5-10 ng / ml FGF2) för att förbättra tillväxt av celler.
5. När en cell konfluens på 50-70% uppnås kan de primära humana fibroblaster frysas. Tiden fram till 50-70% konfluens uppnåtts, skiljer bland cellinjer. Frysa fibroblaster i 90% FCS plus 10% dimetylsulfoxid (DMSO).

2. Beredning av humana fibroblaster för levande cell imaging mikroskopi

I allmänhet bör experiment med humana fibroblaster utföras med passager under 10 som senescens-associerade förändringar kan förändra egenskaperna hos celler efter flera passager. I tveksamma fall kan beta-galaktosidas-analyser användas för att bedöma induktion av åldrande processer i respektive celler. Generellt ska du inte använda åldrade fibroblaster (se ovan). Vidare, för att jämföra flera cellinjer, arbetar med samma antal passager av varje cellinje. Jämförelse av olika genetiskt homogena patienter jämfört med friska kontroller. Emellertid, som iblandpatienter som bär specifika mutationer kan vara sällsynta, kan detta innebära att hudbiopsier från endast en patient med ett visst antal passager och olika linjer kontroll måste ingå - här är det viktigt att säkerställa samma passagen antalet alla linjer ingår. Om en cell konfluens på 50-70% uppnås, men inget experiment planeras, bör fibroblaster frysas.

1. På den första dagen för experimentet, tvätta de bifogade fibroblasterna gång med PBS. Släpp dem från kolven botten med hjälp av en lösning cell lossnar av proteolytiska DNas enzymer (t.ex. AccuMax).
2. Räkna dina celler och utsäde 50,000-70,000 celler i varje brunn i en 4-kammare täckglas (1,8 cm ² kulturområdet per brunn). Därför för de 8-kammare coverglas, är hälften av antalet celler eller lite mindre lämplig (0,8 cm ² kulturområdet per brunn). Det är viktigt att frö snarare ett litet antal celler för att utföra verkligt enkel-cellanalys. Ingen specifik beläggning för kamrarna iar behövs.
3. Efter 24-48 timmar kan den levande cell imaging experiment utföras. Se till att levande cell imaging Mikroskopet är utrustat med en inkubator som styr temperatur och CO ₂ nivåer. Under bildtagning, ° C och 5% en atmosfär av 37 CO ₂ bör bibehållas.
4. Varje levande cell imaging mätning bör utföras i minst tre oberoende försök. Totalt bör minst 50 celler per cellinje skall avbildas. De levande cell imaging experiment samt off-line analyser måste utföras under förblindade villkor för att garantera objektiva datainsamling.

3. Mätning av mitokondriell funktion i levande humana fibroblaster

För konventionell mätning av mitokondriell funktion via mitokondriell membranpotential (MMP)-beroende färgämnen, är fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS) den primära metoden. I fallet med humana fibroblaster, cellulär autofluorescence ofta observeras och kan orsaka falskt positiva resultat genom interferens med själva färgningen signalen. Autofluorescens blir oftast mer uttalad vid högre passage antal fibroblaster. Därför föredrar vi att utvärdera mitokondriefunktion mänskliga fibroblaster genom levande cell imaging mikroskopi.

1. 24-48 timmar efter sådd, inkubera de fibroblaster i 50 nM MMP-beroende färgämne tetramethylrodamine etylester (TMRE) i RPMI-medium. Detta RPMI medium bör sakna fenolrött eftersom detta kan inverka negativt på bildkvaliteten. 1,6 pM Hoechst färgning bör läggas för att visualisera kärnor.
2. Inkubera cellerna i framställd färgningslösning skyddas från ljus under 15 min vid 37 ° C och 5% COj _2.
3. Ersätt färgningslösningen med RPMI-medium (utan fenolrött). Fortsätt utan ett tvättningssteg och omedelbart celler bild. Använd 63x förstoring och konfokal laserscanning mikroskopi teknik (alternativt fluorescensmikroskopi medApotome teknik) för att definiera enskilda lager av celler. Applicera 37 ° C och 5% CO ₂ till celler under avbildningsprocessen.
4. När avbildning av fibroblaster, betala maximal uppmärksamhet åt tillämpat exponeringstid av fluorescerande ljus som TMRE färgning kan bleka ut snabbt. Definiera din rätt exponeringstid mellan 200 och 300 ms och inte överstiger detta intervall. Bilden förvärvet under standardiserade inställningar är mycket viktigt, eftersom en inte skulle kunna göra jämförelser utifrån intensitet om inställningarna skiljer mellan cellinjer.
5. Som en definierad radie runt avbildade cellerna bleks ut efter ljusexponering, hålla nästa synfältet tillräckligt långt från photobleached sektionen.
6. Off-line analyser utförs med ImageJ programvara (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA).
7. Välj cell av intresse genom att använda ett markeringsverktyg.
8. Konvertera bilden till 8-bitars (Bild <typ <8-bitars).
9. Minska ospecifik buller By med hjälp av "Ta bort fläckar"-funktionen (Process <Ljudnivå <Despeckle).
10. Välj "uppslagstabeller - Fire" tillstånd (Bild <uppslagstabeller <Fire).
11. Slå av tröskeln funktionen till "över / under" funktion och justera tröskeln (Bild <Justera <Gränsvärde).
12. Välj "analysera partiklar" alternativet, som kommer att ge dig den genomsnittliga grå för varje mitokondrie partikel detekteras (Analysera <analysera partiklar). Spara den givna resultatlistan som ett Excel-kalkylblad.
13. Öppna resultat filen i Excel-programmet och beräkna medelvärdet av medelvärdet gråa värdet av de mitokondriella strukturer (anges som "betyder" i den givna excel resultatlistan).
14. För att skapa en yta tomt, välj plugin "Interaktiv 3D-yta plot" i "3D" plugin avsnitt. Här kan du justera ytterligare tomten med hjälp av olika visningsalternativ. Ändra "Original Colors" till "Spektrum LUT" ger baren intensitet skalan för lämplig tomt.
15. Alternativtatt använda TMRE för att analysera mitokondriella funktionen av humana fibroblaster genom levande cell imaging, en kombination av MMP-oberoende färgämne MitoTracker Grön FM och MMP-beroende färgämne MitoTracker CM-H ₂ XRos kan användas. Återigen, för humana fibroblaster levande cell imaging mikroskopi föredras, men i allmänhet detta alternativ har också använts med användning av FACS-analys i andra typer av celler ^12. När du använder denna alternativa tillvägagångssätt för att mäta mitokondriell funktion i humana fibroblaster, steg 3-7 i protokollet avsnitt 5 "Mätning av mitochondrio-lysosomala samlokalisering i levande humana fibroblaster" bör tillämpas. Därmed är överlagring av signaler, både från mitokondrier positiva för MitoTracker Grön FM och MitoTracker _CM-H-2 XRos beräknas och anger mängden funktionella mitokondrier som förhållandet till alla mitokondrier närvarande.

4. Mätning av mitokondriell morfologi i Living humanfibroblaster

1. 24-48h efter ympning, inkubera celler i 200 nM MitoTracker Grön FM i RPMI-medium (utan fenolrött) skyddas från ljus under 15 min vid 37 ° C och 5% COj _2. 1,6 pM Hoechst färgning bör användas för att markera kärnor. MitoTracker Grön FM är en MMP-oberoende färg, som fläckar mitokondriella strukturer närvarande.
2. Försiktigt tvätta cellerna en gång med PBS.
3. Lägg färskt RPMI-medium (utan fenolrött) till celler och omedelbart bildceller. Använd 63x förstoring och konfokal laserscanning mikroskopi teknik (alternativt fluorescensmikroskopi med Apotome teknik) för att definiera skikt av celler.
4. Off-line analyser tas ut med hjälp av ImageJ programvara.
5. Välj cell av intresse genom att använda ett markeringsverktyg.
6. Konvertera bilden till 8-bitars (Bild <typ <8-bitars).
7. Minska ospecifika buller genom att använda "Ta bort fläckar" funktionen (Process <Ljudnivå <Despeckle).
8. Använd faltningsfiltret att markera mitochondrial strukturer (Process <Filter <Convolve).
9. Justera tröskeln, så att signal-till-brusförhållandet är lämplig (Bild <Adjust <Tröskelvärde).
10. Genom att använda "analysera partiklar" alternativet är automatisk identifiering av mitokondriella strukturer inleddes utifrån ett valt pixelstorlek (Analysera <analysera partiklar). Flera mitokondriella parametrar därefter beräknas som area, omkrets, mindre och större axlar eller cirkularitet. Dessa mätningar kan ställas in individuellt (Analysera <Set mätningar). Spara den givna resultatlistan som ett Excel-kalkylblad.
11. Öppna resultat filen i Excel-programmet. Med användning av sådana parametrar, kan analyser av mitokondriell morfologi utföras. Detta inkluderar definitionen av formfaktorn anger graden av förgrening av en mitokondriell nätverk [formel: (omkrets ²⁾ / (4 * PI () * area)] samt bildförhållandet definierar längden av mitokondrier (formel: större axlar / mindre axlar).

5. Mätning av Mitochondrio-lysosomala samlokalisering i Living humanfibroblaster

1. 24-48 timmar efter ympning, inkubera celler i 200 nM MitoTracker Grön FM och 100 nM Lyostracker Röd DND-99 i RPMI-medium (utan fenolrött) skyddas från ljus under 15 min vid 37 ° C och 5% COj _2. 1,6 pM Hoechst färgning används för att markera kärnor.
2. Ersätt mediet med färskt RMPI-medium (utan fenolrött) innehållande 100 nM Röd Lyostracker DND-99. Detta färgämne måste vara närvarande under hela avbildning sessionen. Tvätta inte cellerna efter inkubationstid. Omedelbart bild cellerna. Använd 63x förstoring och konfokala teknik (alternativt Apotome teknik) för att definiera skikt av celler.
3. Off-line analyser tas ut med hjälp av ImageJ programvara.
4. Öppna de två respektive bilder du vill analysera i termer av samlokalisering status.
5. Konvertera bilden till 8-bitars (Bild <typ <8-bitars). Minska ospecifika buller genom att använda "Ta bort fläckar" funktionen i båda bilderna (Process <Ljudnivå <Despeckle).
6. Välj plugin "JACoP" som samlokalisering analyserar verktyg som ger dig värden för de respektive kanalerna och beräknar Pearsons koefficient, överlappar koefficient och Manders koefficient (Plugins <JACoP).

6. Representativa resultat

Mitokondriell funktion i levande humana fibroblaster kan utvärderas via levande celler avbildningsteknik. För funktionella analyser korrelerar TMRE fluorescenssignalen med mitokondriell membranpotential (MMP). Under normala MMP förhållanden är TMRE fluorescensen signifikant högre (Figur 1A, övre raden) än under patologiska tillstånd som kännetecknas av en minskad MMP (Figur 1A, nedre raden). Denna fluorescensintensitet mätes genom att beräkna genomsnittet av det genomsnittliga gråvärdet varje mitokondriell struktur ( (Figur 1A, höger sida).

Bredvid bedömningen av mitokondriell funktion i humana fibroblaster, kan levande cell imaging mikroskopi kan användas för att definiera olika parametrar mitokondriell morfologi. Genom att använda gröna MitoTracker FM dye mitokondriella strukturer visualiseras oberoende av deras respektive MMP (figur 2). Detta är viktigt att säkerställa att samtliga mitokondriella strukturer närvarande i analyserna. Med hjälp av ImageJ programvara är morfologi analyseras utifrån binära siffror, eftersom endast här mitokondriella morfologi parametrar kan bedömas (Figur 2, "binär"). Exempel på mitokondriella morfologi analyser i form av formfaktor samt bildförhållande publicerades nyligen ^{6, 1}3. En annan viktig funktion som kan mätas i levande humana fibroblaster är nedbrytningen av mitokondriella strukturer. Det första steget i denna utveckling kan bedömas genom mitochondrio-lysosomala samlokalisering i levande cell imaging mikroskopi. Vissa patologiska tillstånd resulterar i en ökad samlokalisering av mitokondrier med lysosomer (figur 3A). Återigen är MitoTracker Grön FM används för att färga mitokondriella strukturer oberoende av deras respektive MMP. Dessutom färgning med Lysotracker Röd DND-99 tillåter visualisering lysosomala strukturer. Det är kritiskt att Lysotracker röda färgämnet är närvarande under avbildningsprocessen, som tvättningssteg minska signal som blir alltför låg för visualisering. Samlokalisering representeras av tydliga gula fluorescenssignaler på grund av överlappning av gröna (MitoTracker Grön FM) och röd (Lysotracker Röd DND-99) färgning (vita pilar, figur 3A) och bestäms genom beräkning av Pearson CoEfficient (Figur 3B).

I allmänhet för off-line analyser med ImageJ programvara är det bra att visualisera en cell per bild, så att definitionen av en specifik region av intresse (ROI) kan undvikas.

Figur 1. Mätning av TMRE fluorescenssignalen indikerar mitokondriella membranpotentialen (MMP) i levande humana fibroblaster genom levande celler avbildningsteknik. (A) TMRE är en fluorescerande MMP-beroende färgämne, vars fluorescensintensitet korrelerar med MMP. Hoechst färgämne användes för att färga kärnor (blå). Under normala MMP förhållanden (övre raden) är TMRE fluorescens betydligt högre än under patologiska tillstånd som kännetecknas av en minskad MMP (nedre raden). Fluorescensintensitet visas dessutomsom intensitet yta tomt. Skala stapel anger 10 um. (B) Statistiska analyser av de exemplifierande fibroblaster visas i (A). Enligt patologiska tillstånd, en minskad TMRE fluorescens av mitokondrier mätt jämfört med den normala MMP skick. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. Mätning av mitokondriella morfologi i levande mänskliga fibroblaster genom levande cell imaging teknik. MitoTracker Grön FM (grön) används för att visualisera mitokondrie strukturer, för att det är oberoende av MMP. Hoechst färgämne användes för att färga kärnor (blå). Med hjälp av ImageJ programvara kan morfologin analyseras binära siffror. Skala stapel anger 10 um. Klicka här för att visa större bild.

Figur 3. Mätning av samlokalisering av mitokondrier med lysosomer i levande humana fibroblaster genom levande cell imaging teknik. (A) MitoTracker Grön FM (grön) används för att färga mitokondrie strukturer, Lyostracker Röd DND-99 (röd) visualiserar lysosomala strukturer. Hoechst färgämne användes för att färga kärnor (blå). Framgångsrik samlokalisering under patologiska betingelser anges av en gul signal beroende på överlappning av Lysotracker Röd och MitoTracker Grön färgning (vita pilar). Skala stapel anger 10 um. (B) Statistiska analyser av de exemplifierande fibroblaster visas i (A). En högre grad av mitochondrio-lysosomala samlokalisering resulterar i en förhöjd Pearson koefficientvärdet./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.

Discussion

Patientens hud fibroblaster som ex vivo-modeller utgör ett viktigt verktyg för att karakterisera sjukdomsassocierade genetiska defekter. Dessutom, hud-härledda fibroblaster är lättillgängliga och kan utökas vid odling. Därför, primära celler erhållna från patienter som bär PD-associerade genetiska mutationer är att föredra jämfört med användningen av tumörcellinjer eftersom de innehåller inte bara den endogena sjukdomsorsakande genen, men hela den genetiska bakgrunden av den drabbade individen. Dessutom har fibroblaster visat sig avspegla viktiga patologiska funktioner i mitokondriell dysfunktion vid neurodegeneration. De experiment som beskrivs i detta protokoll är särskilt användbara för att studera mitokondriella fenotyper inklusive funktion, morfologi samt bedömning samlokalisering av mitokondrier med lysosomer via levande cell imaging teknik. Därmed, huvudsakliga kännetecknen för sjukdomen, nämligen mitokondriell dysfunktion och efterföljande nedbrytbararing av dessa icke-funktionella organeller, kan visualiseras och analyseras ordentligt ^{6, 13.} Förändringar av mitokondriell funktion och morfologi är ofta ett första steg i sjukdomens patologi. Till exempel ökade fragmentering av den mitokondriella nätet kan vara en förutsättning för förbättrade autophagic och mitophagic processer ^6,12. Därför kan samlokalisering av mitokondrier med lysosomer hjälpa till att bedöma mitokondrie nedbrytning (mitophagy) ^6. Brist på detta samlokalisering samt en ansamling av mitokondrier med lysosomer kan återspegla defekter i lysosomala nedbrytningsvägen och måste valideras genom modulering autophagic flöde ^6. I detta sammanhang representerar ImageJ programvara ett viktigt verktyg för att generera validerade datauppsättningar med hälften-automatiska icke-partisk analyserar funktioner.

En ytterligare alternativ som utökar användningen av mänskliga fibroblaster till mer sjukdomsrelaterade modeller är den potentiella Generatjon av inducerade (IPS) pluripotenta stamceller, som kan delas in i olika celltyper som är främsta målet för sjukdomsprocessen ^14. I fallet med Parkinsons sjukdom, gör differentieringen av fibroblaster i dopaminerga neuroner denna cellulära modell ett lovande verktyg för framtida forskning inom detta neurodegenerativ sjukdom ^15,16. Viktigare, kan alla de beskrivna analyserna i protokollet här kan lätt översättas till experimentella uppställningar för att undersöka mitokondriella förändringar inom dopaminerga neuroner. Naturligtvis kan även fler neuron-specifika levande cell imaging försöken tillämpas också.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
H–chst 33342	Invitrogen	H-3570
Table 1. Specific reagents and equipment.