piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des nicht-viralen PiggyBac Transposon-System. T-Zellen zur Verwendung der modifizierte PiggyBac Transposonsystem Ausstellung stabile Transgenexpression.

Zusammenfassung

Die piggyBac Transposonsystem ist natürlich aktiv, ursprünglich aus dem Kohlspannerraupe Motte ^1,2 abgeleitet. Diese nicht-viralen Plasmid basierten System ist, am häufigsten unter Verwendung von zwei Plasmide mit einer Expression der Transposase piggyBac Enzym und ein Transposon-Plasmid beherbergt, der das Gen (e) von Interesse zwischen invertierten Wiederholung Elemente, die für den Gentransfer-Aktivität erforderlich sind. PiggyBac vermittelt Gentransfer durch "cut and paste"-Mechanismus, wobei die Transposase integriert das Transposon-Segment in das Genom der Zielzelle (n) von Interesse. piggyBac hat effizienten Gentransfer-Aktivität in einer breiten Vielzahl von Insekten ^1,2, Säuger ^3-5 gezeigt, und Menschen cells6 einschließlich der primären menschlichen T-Zellen ^7,8. Kürzlich wurde ein hyperaktives piggyBac Transposase erzeugt Verbesserung Gentransfereffizienz ^9,10.

Menschliche T-Lymphozyten sind von klinischen interest für Immuntherapie von Krebs ^11. Zu beachten ist, hat die erste klinische Studie mit Transposon Veränderung der menschlichen T-Zellen mit dem Dornröschen Transposon System ¹² zugelassen. Wir haben zuvor die Nützlichkeit piggyBac als nicht-viralen Methoden zur genetischen Modifikation von menschlichen T-Zellen ausgewertet. Wir fanden piggyBac zu einer genetischen Veränderung von menschlichen T-Zellen mit einem Reportergen und eine nicht-immunogene Suizidgen induzierbar ⁷ effizient. Analyse von genomischen Integration Seiten offenbart einen Mangel an Präferenz für die Integration in oder in der Nähe bekannter Proto-Onkogene ^13. Wir verwendeten piggyBac Gen-modify zytotoxische T-Lymphozyten, um einen chimären Antigen-Rezeptor gegen den Tumor-Antigen HER2 gerichteten tragen, und festgestellt, dass Gen-modifizierten T-Zellen gezielt vermittelte Abtötung von HER2-positiver Tumorzellen in vitro und in vivo in einem orthotopen Mausmodell ^14. Wir haben auch verwendet piggyBacdie menschliche T-Zellen resistent gegen Rapamycin, die nützlich sein sollen von Krebstherapien, wo Rapamycin ¹⁵ ausgenutzt wird zu erzeugen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung piggyBac genetisch zu verändern primären humanen T-Zellen. Dies beinhaltet Isolation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus menschlichem Blut durch Kultur, genetischen Veränderung, und Aktivierung von T-Zellen folgt. Für die Zwecke dieser Bericht wurden T-Zellen mit einem Reportergen (eGFP) zur Analyse und Quantifizierung der Genexpression durch Durchflusszytometrie modifiziert.

PiggyBac kann zum menschlichen T-Zellen mit einer Vielzahl von Genen von Interesse zu modifizieren. Obwohl wir verwendet piggyBac an T-Zellen gegen Tumorantigene ¹⁴ lenken sind, haben wir auch verwendet, um einen induzierbaren piggyBac Sicherheitsschalter zuzusetzen, um Gen-modifizierten Zellen zu eliminieren, wenn nötig ^7. Die große Ladekapazität von piggyBac auch Gentransfer aktivierteine große Rapamycin resistenten mTOR-Molekül (15 kb) ^15. Daher stellen wir eine nicht-viralen Methodik für stabile Gen-Modifikation von primären humanen T-Zellen für eine Vielzahl von Zwecken.

Protokoll

Tag 0

Ein. Isolierung von PBMCs aus menschlichem Blut

1. Collect 20 ml frischem menschlichem Blut mit Venenpunktion in Na-Heparin Vacutainer-Röhrchen.
2. Mischung Blut und erweiterte RPMI 1640 in 1:1 (v / v)-Verhältnis.
3. 20 ml Lymphoprep Mediums auf eine 50 ml-Zentrifugenröhrchen (25 ° C). Langsam Schicht 25-30 ml Blut-RPMI 1640 Mix auf der Oberseite des Lymphoprep.
4. Zentrifugation bei 400 xg für 40 min ohne Bremsen.
5. Sammeln Sie beide unterschiedliche und Fuzzy-Schichten mit einem Einweg-Pipette in 10 ml 1x PBS (25 ° C) und bringe das Volumen von bis zu 50 ml mit 1x PBS.
6. Zentrifuge bei 450....

Ergebnisse

Eine schematische demonstrieren die Schritte in genetisch modifizierenden menschlichen T-Lymphozyten mit einem Reportergen (eGFP) ist in Abbildung 1 gezeigt. Diese Plasmide sind auf Anfrage bei den Autoren. Ein schemtic demonstrieren die Schritte in gentechnisch veränderten humanen T-Lymphozyten mit einem Reportergen (eGFP) ist showin in 2. Es ist notwendig, T-Zellen zu aktivieren, um sie zu teilen, zu erweitern, und Propagation in Kultur. Modifiziertes humanes T-Zellen wurden dann gezü.......

Diskussion

Das hierin beschriebene Verfahren erlaubt eine stabile Modifikation Transgen von primären humanen T-Lymphozyten. Wir haben zuvor die Verwendung des piggyBac Transposonsystem getestet, um T-Zellen zu modifizieren, um ein Reporter-Gen (für mehr als 4 Wochen), eine nicht-immunogene Suizidgen, einem chimären Antigenrezeptors für adoptive Immuntherapie (länger als 100 Tage) ausdrücken, und um den Widerstand gegen immunsuppressive Medikamente ^7,13-15 konstruieren. Nicht-virale Modifikation von T-Zellen für.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Lympholyte	Cedarlane	CL5015
Erweiterte RPMI 1640	LifeTechnologies	12633020
Hyclone Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	SH3008803
GlutaMAX-I Supplement	LifeTechnologies	35050-061
Human IL-15 Recombinant Protein	eBioscience	14-8159
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Amaxa Nucleofector	Lonza	AAD-1001S	& Nbsp;
Humane T-Zell Nucleofector Kit	Lonza	VPA-1002
CD8-APC	Southern Biotech	9536-11
Anti-Human CD3	eBioscience	16-0037-81
Anti-Human CD28	BD Pharmingen	555725
24 Well Tissue Culture behandelte Platte	BD Falcon	353047
24 Well Non Tissue Culture behandelte Platte	BD Falcon	351147
			Komplette T-Zell-Media-Komposition 1x Erweiterte RPMI 1640 5% Hitze inaktiviertem fötalem Rinderserum 2 mM GlutamaxIM-I