piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

Sunandan Saha; Yozo Nakazawa; Leslie E. Huye; Joseph E. Doherty; Daniel L. Galvan; Cliona M. Rooney; Matthew H. Wilson

doi:10.3791/4235

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Methodenartikel

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

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DOI:

10.3791/4235

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5. November 2012

Sunandan Saha¹^,² , Yozo Nakazawa³ , Leslie E. Huye⁴^,⁵ , Joseph E. Doherty²^,⁶ , Daniel L. Galvan² , Cliona M. Rooney⁴^,⁵^,⁷ , Matthew H. Wilson¹^,²^,⁴^,⁸

¹Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine , ²Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine , ³Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, ⁴Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine , ⁵Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine , ⁶Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine , ⁷Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine , ⁸Michael E. DeBakey VA Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des nicht-viralen PiggyBac Transposon-System. T-Zellen zur Verwendung der modifizierte PiggyBac Transposonsystem Ausstellung stabile Transgenexpression.

Zusammenfassung

Die piggyBac Transposonsystem ist natürlich aktiv, ursprünglich aus dem Kohlspannerraupe Motte ^1,2 abgeleitet. Diese nicht-viralen Plasmid basierten System ist, am häufigsten unter Verwendung von zwei Plasmide mit einer Expression der Transposase piggyBac Enzym und ein Transposon-Plasmid beherbergt, der das Gen (e) von Interesse zwischen invertierten Wiederholung Elemente, die für den Gentransfer-Aktivität erforderlich sind. PiggyBac vermittelt Gentransfer durch "cut and paste"-Mechanismus, wobei die Transposase integriert das Transposon-Segment in das Genom der Zielzelle (n) von Interesse. piggyBac hat effizienten Gentransfer-Aktivität in einer breiten Vielzahl von Insekten ^1,2, Säuger ^3-5 gezeigt, und Menschen cells6 einschließlich der primären menschlichen T-Zellen ^7,8. Kürzlich wurde ein hyperaktives piggyBac Transposase erzeugt Verbesserung Gentransfereffizienz ^9,10.

Menschliche T-Lymphozyten sind von klinischen interest für Immuntherapie von Krebs ^11. Zu beachten ist, hat die erste klinische Studie mit Transposon Veränderung der menschlichen T-Zellen mit dem Dornröschen Transposon System ¹² zugelassen. Wir haben zuvor die Nützlichkeit piggyBac als nicht-viralen Methoden zur genetischen Modifikation von menschlichen T-Zellen ausgewertet. Wir fanden piggyBac zu einer genetischen Veränderung von menschlichen T-Zellen mit einem Reportergen und eine nicht-immunogene Suizidgen induzierbar ⁷ effizient. Analyse von genomischen Integration Seiten offenbart einen Mangel an Präferenz für die Integration in oder in der Nähe bekannter Proto-Onkogene ^13. Wir verwendeten piggyBac Gen-modify zytotoxische T-Lymphozyten, um einen chimären Antigen-Rezeptor gegen den Tumor-Antigen HER2 gerichteten tragen, und festgestellt, dass Gen-modifizierten T-Zellen gezielt vermittelte Abtötung von HER2-positiver Tumorzellen in vitro und in vivo in einem orthotopen Mausmodell ^14. Wir haben auch verwendet piggyBacdie menschliche T-Zellen resistent gegen Rapamycin, die nützlich sein sollen von Krebstherapien, wo Rapamycin ¹⁵ ausgenutzt wird zu erzeugen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung piggyBac genetisch zu verändern primären humanen T-Zellen. Dies beinhaltet Isolation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus menschlichem Blut durch Kultur, genetischen Veränderung, und Aktivierung von T-Zellen folgt. Für die Zwecke dieser Bericht wurden T-Zellen mit einem Reportergen (eGFP) zur Analyse und Quantifizierung der Genexpression durch Durchflusszytometrie modifiziert.

PiggyBac kann zum menschlichen T-Zellen mit einer Vielzahl von Genen von Interesse zu modifizieren. Obwohl wir verwendet piggyBac an T-Zellen gegen Tumorantigene ¹⁴ lenken sind, haben wir auch verwendet, um einen induzierbaren piggyBac Sicherheitsschalter zuzusetzen, um Gen-modifizierten Zellen zu eliminieren, wenn nötig ^7. Die große Ladekapazität von piggyBac auch Gentransfer aktivierteine große Rapamycin resistenten mTOR-Molekül (15 kb) ^15. Daher stellen wir eine nicht-viralen Methodik für stabile Gen-Modifikation von primären humanen T-Zellen für eine Vielzahl von Zwecken.

Protokoll

Tag 0

Ein. Isolierung von PBMCs aus menschlichem Blut

Collect 20 ml frischem menschlichem Blut mit Venenpunktion in Na-Heparin Vacutainer-Röhrchen.
Mischung Blut und erweiterte RPMI 1640 in 1:1 (v / v)-Verhältnis.
20 ml Lymphoprep Mediums auf eine 50 ml-Zentrifugenröhrchen (25 ° C). Langsam Schicht 25-30 ml Blut-RPMI 1640 Mix auf der Oberseite des Lymphoprep.
Zentrifugation bei 400 xg für 40 min ohne Bremsen.
Sammeln Sie beide unterschiedliche und Fuzzy-Schichten mit einem Einweg-Pipette in 10 ml 1x PBS (25 ° C) und bringe das Volumen von bis zu 50 ml mit 1x PBS.
Zentrifuge bei 450 × g für 10 min.
Überstand vollständig und 20 ml Erweiterte RPMI 1640.
Zentrifugation bei 400 xg für 5 min.
Überstand. 10 ml vollständige T-Zell-Medien mit 5 ng / ml rhIL-15 ergänzt vorgewärmt auf 37 ° C.
Zählen der Anzahl von Zellen und die Platte in einer 24-Well-Gewebekulturplatten coated Platte bei 2 x 10 ⁶ Zellen / Vertiefung in komplettem T-Zell-Medium mit 5 ng / ml rhIL-15 In sterilem Wasser zu umgebenden Vertiefungen ergänzt. Inkubieren über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2.

Tag 1

2. Lackierplatten mit anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper zur Stimulation von T-Zellen

Verdünnte anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper in sterilem Wasser in einer Konzentration von 1 pg / ml gelöst.
Hinzufügen jeweils 500 ul Antikörperlösung bis 5 gekennzeichneten Wells einer nicht beschichteten Gewebekulturplatten 24-Well-Platte.
Fügen sterilem Wasser der Brunnen ausruhen. Wickeln Sie die Platte in Schrumpffolie und Ort in einem 4 ° C Kühlschrank.

3. Nukleofektion von unstimulierten T-Zellen

Vorwärmen T-Zell-Medium bei 37 ° C und Ergänzung mit 5 ng / ml rhIL-15. Bereiten komplette Nucleofector Lösung durch Zugabe von 500 ul Nucleofector Supplement 1 bis 2,25 ml Nucleofector Lösung.
Aliquot 5 ug jedes Transposon (Zeo-pT-CMV-eGFP) und Transposase (pCMV-piggyBac) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: es kann notwendig sein, die Transposase und Transposon-DNA für eine optimale Menge Genabgabe zu optimieren und zu minimieren Zelltoxizität. Die Plasmide können von den Autoren auf Anfrage erhältlich.
Ernte PBMCs aus der 24-Well-Gewebekulturplatten Platte in eine 50 ml Tube. Zählen Sie die Anzahl der Zellen. Sparen Sie 2 x 10 ⁶ Zellen zur Verwendung als Kontrolle während der Durchflusszytometrie.
Hinzufügen 7-10 x 10 ⁶ Zellen in ein 15 ml-Tube und Zentrifuge bei 400 xg, 5 min, Überstand entfernen und Finger-Flick das Pellet.
Fügen Sie 100 ul der T-Zell komplette Nukleofektion Lösung gelöst Zellpellet.
Fügen Sie die Lösung Zellgemisch auf das Rohr mit den Plasmiden.
Hinzufügen der Lösung-Zell-Plasmid Mischung auf dem Boden der Küvette Nukleofektion. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen.
Nucleofect die Zellen mit program U-014 (Unstimulierte T-Zellen, menschliche, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
Sofort im 500 ul vorgewärmtes Medien mit rhIL-15 in die Küvette. Übertragen der Zellen an einer Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 1,5 ml vorgewärmtem Medium mit rhIL15.
Inkubieren über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2.

Tag 2

4. Unspezifische Stimulation von T-Zellen

Ernten Sie die Zellen und bestimmen Zellzahlen. Beiseite 0,5 x 10 ⁶ Zellen für die Durchflusszytometrie, um die Frequenz von GFP-positiven Zellen zu bestimmen. Verwenden Sie die nicht-transfizierten PBMCs als Kontrollen.
Saugen Sie die CD3/28 Antikörper-Lösung aus dem nicht Gewebekultur beschichtete Platte und spülen jede Vertiefung mit T-Zell-Medien.
Resuspendieren der Zellen nucleofected bei 0,5 x 10 ⁶ Zellen pro ml in vollständigem Medium CTLsupplementiert mit 5 ng / ml rhIL-15. 2,0 ml jeder der nucleofected Zellen in 4 Vertiefungen der nicht Gewebekulturplatte. Fügen Sie 0,5 x 10 ⁶ nicht nucleofected Zellen an der 5 ^th gut.
Inkubieren für 3 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2.

Tag 5

Ernte der stimulierten T-Zellen aus dem nicht-Gewebekulturplatte.
Zählen und replate die Zellen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 0,7 x 10 ⁶ Zellen / ml in T-Zell-Medium mit 5 ng / ml IL-15.

Tag 7

7. Analysis of Gene Expression

Ernten Sie die Zellen und Flecken mit anti-human CD8 Antikörper (könnte auch anti-CD3 und anti-CD4) und analysieren mit Durchflusszytometrie% GFP-Expression.

Tag 8 (Optional)

8. Expansion von T-Zellen

Am Tag 8 nach der Transfektion, können T-Zellen in T replattiert werden-Zell-Medium mit IL-15 in einer Dichte von 0,7 x 10 ⁶ Zellen pro Well für ¹⁶ weitere Expansion.